Method Article

Сверхразрешающая визуализация и совместное управление: протокол для конфокальной микроскопии с мультиплексным обнаружением

DOI:

10.3791/70151

⸱

February 24th, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Core Facilities, Zhejiang University School of Medicine, 2Department of Orthopedics, the Fourth Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 3Department of Sports Medicine of the First Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол подробно описывает передовые применения визуализации и управление совместными ресурсами системы лазерно-сканирующего конфокального микроскопа, интегрированной с мультиплексированным детектором массива для высокоразрешающей клеточной и субклеточной визуализации. Рабочий процесс позволяет мультимодальное изображение от конфокального до сверхразрешения (~120 нм) на одной платформе, делая визуализацию наномасштабов более доступной.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микроскопия с сверхразрешением (SRM) преодолевает дифракционный предел традиционной световой микроскопии, позволяя наномасштабно визуализировать субклеточные структуры. Однако широкое распространение таких методов, как микроскопия с стимулированным эмиссией (STED), фотоактивированная локализационная микроскопия (PALM) / стохастическая оптическая реконструкция (STORM) и микроскопия структурированного освещения (SIM), может быть затруднено такими факторами, как высокая фототоксичность, специализированная подготовка образцов или сложная эксплуатация. Здесь мы представляем комплексный протокол, использующий конфокальную платформу лазерного сканирования, интегрированную с мультиплексированным детектором сверхразрешения. Эта система, в сочетании с вычислительной обработкой, позволяет легко перейти между конфокальными и сверхразрешёнными изображениями в рамках одного рабочего процесса. Протокол обеспечивает удобный для пользователя подход к быстрой, высококачественной и низкофототоксичной визуализации. Детальный метод включает мультимодальные возможности визуализации, включая многоцветную флуоресценцию, дифференциальный интерференционный контраст (DIC), трёхмерную Z-стековую реконструкцию, таймлапс-изображение живых ячеек, крупно-площадную мозаику и различные режимы сверхразрешения, предлагаемые мультиплексированным детектором массива. Систематические сравнения показывают, что режимы сверхразрешения достигают бокового разрешения примерно 120 нм, что примерно вдвое больше, чем дифракционный предел обычной широкоугольной микроскопии, а также значительное улучшение как разрешения, так и отношения сигнал/шум (4–8 раз) по сравнению со стандартной конфокальной работой на той же платформе. Обсуждение также затрагивает ключевые моменты модели совместного управления ресурсами, необходимой для поддержки устойчивой эксплуатации этой технологии. Это интегрированное руководство служит ценным ресурсом как для новичков, так и для опытных исследователей и управляющих объектами, стремящихся внедрить и максимально раскрыть потенциал этой доступной формы передовой визуализации в исследованиях наук о жизни.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Визуализация динамических субклеточных структур является фундаментальной для развития исследований в области наук о жизни. Однако разрешение традиционной оптической микроскопии ограничено дифракцией примерно до 200 нм по горизонту, что ограничивает её способность различать динамические субклеточные процессы. Для преодоления этого барьера были разработаны различные методы сверхразрешения. Однако такие методы, как STED-микроскопия, PALM/STORM и SIM, часто создают препятствия для широкого распространения в многопользовательских средах, включая высокую фототоксичность, необходимость специализированных флуорофоров или подготовки образцов, сложные процедуры выравнивания или интенсивную вычислительнуюобработку 1,2,3.

В этом контексте конфокальные микроскопические системы с мультиплексированным детектором массив предлагают убедительную альтернативу, позволяя сверхразрешающую визуализацию с помощью многопиксельного обнаружения и вычислительного перераспределения, значительно снижая техническийпорог 4. Этот подход использует 32-элементный детекторный массив из арсенида галлия (GaAsP) для сбора большего количества фотонов с каждой точки сканирования. Последующие интеллектуальные алгоритмы деконволюции переназначают эту информацию, эффективно уменьшая объём обнаружения. Этот процесс достигает пространственного разрешения примерно 120 нм по бокам и 350 нм по оси, что примерно в 2 раза превосходит дифракционный предел широкоугольной микроскопии и даёт 4-8 раз увеличение отношения сигнал/шум по сравнению со стандартным конфокальным режимом на том жеприборе 4,5,6. Это уникальное сочетание повышенного разрешения, превосходного качества сигнала и совместимости с распространёнными флуоресцентными метками и протоколами является его основным преимуществом для широкого применения.

В результате эта форма доступной микроскопии с сверхразрешением нашла широкое применение в исследованиях наук о жизни, позволив подробно изучать морфологию органелл, динамику цитоскелетов, взаимодействия вируса и хозяина и молекулярную колокацию как в фиксированных, так и в живыхклетках 7,8. Его относительная мягкость делает его особенно подходящим для длительных таймлапс-наблюдений живых образцов.

Интеграция таких передовых систем в ключевые объекты крайне важна для демократизации доступа, но их устойчивая и эффективная эксплуатация представляет собой особые вызовы. В основных учреждениях учреждения, таких как Медицинская школа Чжэцзянского университета, оптимальная производительность и влияние критически зависят от трёх столпов: (1) стандартизированных и воспроизводимых протоколов визуализации, (2) строгого рутинного обслуживания и (3) эффективной управленческой структуры совместного доступа. Хотя существуют ценные ресурсы по отдельным аспектам, таким как методы визуализации для более ранних систем9или общие принципы управленияобъектами 10,11, в настоящее время отсутствует комплексное руководство, интегрирующее детализируемые воспроизводимые протоколы для современных мультиплексированных платформ детекторов массив с проверенной моделью управления совместными ресурсами. Эта статья о протоколе направлена на преодоление этого разрыва.

Главная цель — предоставить комплексное, пошаговое руководство по эффективной реализации и использованию конфокальной системы с мультиплексированным детектором массивы для сверхразрешения в условиях совместного ресурса. It is designed for two primary audiences: researchers requiring resolution beyond conventional confocal limits (~250‬-300 nm) but for whom live-cell compatibility, ease of use, and throughput are also critical; а также управляющими объектами, создающими или оптимизирующими такие услуги. Здесь мы систематически подробно описываем конфигурацию системы, мультимодальные протоколы визуализации (охватывающие многоцветные, 3D, живые ячейки, тайлинг и режимы сверхразрешения), а также проверенную модель совместного управления. Это интегрированное руководство служит ресурсом для максимального раскрытия потенциала и доступности этого мощного метода визуализации.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты с биологическими образцами проводились в соответствии с руководящими принципами и нормативами Core Facilities Медицинской школы Чжэцзянского университета и были одобрены Институциональным комитетом по биобезопасности (Сертификат одобрения No BSL20235710079).

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры, связанные с клеточными культурами, должны проводиться в стерильных условиях в шкафе биологической безопасности класса II, если не указано иное. Этот протокол предполагает установку микроскопической системы и калибровку мощности лазеров. Подробные спецификации и рекомендуемые поставщики для ключевых реагентов, расходников и оборудования (например, тарелки для съёмки, стекло крышки, монтажная среда) приведены в таблице материалов.

1. Подготовка образца

ПРИМЕЧАНИЕ: Успешная сверхразрешающая визуализация начинается с оптимальной подготовки образца. Использование высококачественных стеклянных антенн с крышкой толщиной 1,5 (0,17 мм) крайне важно для соответствия корректирующему воротнику высокоэнергетических масляных иммерсионных объективов и предотвращения сферических аберраций. Все этапы центрифугации должны выполняться при 300 × г в течение 5 минут, если это не указано.

  1. Подготовка образца фиксированной ячейки для многоцветной сверхразрешающей визуализации (например, COS7-элементы)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол описывает иммунное окрашивание микротрубочек (Alexa Fluor 568) и митохондрий (Alexa Fluor 488) с ядерной контрокрашенностью 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI), как показано на рисунке 1.
    1. Культивировать клетки COS7 в модифицированной среде Eagle (DMEM) Dulbecco, дополненных 10% сывороткой плода (FBS) при 37°C в увлажнённом инкубаторе с содержанием 5%CO2 .
    2. Поставьте ячейки на 35 мм стеклянные антенны с плотностью 1,0 × 105 элементов на тарелку. Дайте клеткам прилипнуть и вырасти до 60-70% слияния (обычно 24 часа).
    3. Аспирируйте посевную среду и аккуратно промывайте клетки предварительно нагретым (37°C) фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS). Фиксируйте клетки, добавив 1 мл 4% параформальдегида (PFA) в PBS и инкубируйте 15 минут при комнатной температуре (RT).
    4. Аспирировать раствор PFA (считать опасные отходы). Промывайте клетки три раза 2 мл PBS, инкубируя по 5 минут за стирку с аккуратным покачиванием.
    5. Проницаемость и блокировка: Инкубировать клетки с 1 мл проницаемого/блокирующего буфера (0,1% v/v) Triton X-100, 1% (w/v) бычьей сыворотки альбумина (BSA) в PBS) в течение 30 минут на RT.
    6. Инкубация первичных антител: Инкубировать клетки смесью первичных антител против α-тубулина (мышиный моноклональный) и TOMM20 (кроличий поликлональный) в буфере разведения антител (1% BSA при PBS) при 4°C ночью (или 1-2 часа при RT). Используйте 300 мкл на одну тарелку, чтобы покрыть стеклянную поверхность.
    7. Промывка: аккуратно аспирируйте первичный раствор антител. Промыйте клетки три раза 2 мл PBS с содержанием 0,05% Tween-20 (PBST), по 5 минут за одну промывку.
    8. Вторичное антитело и ядерное окрашивание: Приготовьте смесь флуоресцентных вторичных антител и DAPI в буфере разбавления антител (1% BSA/PBS), защищённой от света.
      1. Используйте IgG против мышей осла, конъюгированный с Alexa Fluor 568 (1:500), и IgG против кроликов с Alexa Fluor 488 (1:500).
      2. Включайте DAPI в конечной концентрации 1 мкг/мл для ядерного окрашивания. Нанесите 300 мкл этой смеси на клетки и инкубируете 1 час при RT в темноте.
    9. Финальная стирка: Аспирируйте раствор для окрашивания и трижды промывайте клетки 2 мл PBS, по 5 минут на одну стирку.
    10. Нанесите монтажную среду: Аккуратно вдыхайте PBS из тарелки, оставив образец слегка влажным. Немедленно нанесите небольшую каплю (~20 мкл) затвердевшей антифейдной монтажной среды (например, ProLong Gold) непосредственно на стеклянное дно.
    11. Накрыть и затвердеть: Аккуратно опустите на каплю стекло #1.5 высокой точности, чтобы избежать пузырей. Дайте монтированию затвердеть на ночь при RT в темноте или в течение 2-4 часов при 37°C, если требуется более быстрое отверждение.
  2. Подготовка образца живых клеток для таймлапс-визуализации (например, клетки Hep3B, экспрессирующие флуоресцентный белковый метку).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол описывает визуализацию клеток Hep3B, стабильно экспрессирующих флуоресцентный белок (например, EGFP), направленный на митохондрии.
    1. Культивировать клетки Hep3B в минимально необходимой среде (MEM) с добавлением 10% FBS. Ячейки пластин на 35-мм стеклянные контейнеры (1,5 крышного стекла) при плотности 0,8 × 10⁵элементов на тарелку. Позволяйте клеткам расти примерно до 70-80% совпадения для оптимального здоровья и плотности изображения (обычно 18-24 часа).
    2. Подготовка к визуализации: В день визуализации аккуратно замените стандартную культурную среду на 2 мл предварительно уравновешенного (37°C, 5%CO2 не менее 30 минут), без фенол-красного и низкофлуоресцентного субстрата, дополненного 10% FBS и, при необходимости, 25 мМ буфера HEPES для стабилизации pH вне инкубатораCO2 . Это минимизирует фоновую флуоресценцию и поддерживает физиологический pH во время визуализации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дайте тарелке акклиматизироваться на предварительно нагретой стадии микроскопа внутри камеры окружающей среды не менее 30-45 минут перед началом таймлапс-сбора для обеспечения температуры, концентрации и стабилизации здоровья клетки.

2. Запуск, инициализация и базовое выравнивание системы микроскопа

  1. Питание основного блока микроскопа, лазерного пускового модуля (с твердотельными лазерами на 405, 488, 561 и 640 нм), светодиодного источника света и управляющего компьютера.
    1. Дайте лазерам прогреться и стабилизироваться минимум 15-20 минут. Это критически важно для стабильной мощности лазера, особенно для количественных или таймлапс-экспериментов.
  2. Запускайте операционное ПО микроскопа.
  3. В основном интерфейсе выберите «Микроскоп» > «Инициализировать» или следуйте мастеру запуска программы.
  4. В программном обеспечении перейдите к панели «Приобретение». В выпадающем меню объектива выберите 'Plan-Apochromat 63 x/ 1.40 Oil ' или подходящий объектив для вашего эксперимента.
  5. Нанесите каплю погружного масла (показатель преломления = 1.518) непосредственно на переднюю линзу объектива. Избегайте появления пузырьков.
  6. Для изображения живых клеток активируйте камеру окружающей среды и систему активной стабилизации фокуса (например, «Определенный фокус» >) не менее чем за 45-60 минут до начала съёмки. Установите температуру на 37°C,CO2 –5% и влажность на >60%. Позвольте системе стабилизироваться. Проверьте устойчивость с помощью датчиков камеры.
  7. Система готова к загрузке образцов и установке параметров изображения.

3. Многоцветная флуоресцентная визуализация

  1. Поместите подготовленный образец на стадию микроскопа. Аккуратно поднимайте ступень до контакта стекла крышки с погружным маслом.
  2. В программном обеспечении для приобретения перейдите во вкладку «Приобретение» и выберите «Создать новый эксперимент».
  3. Добавьте несколько каналов изображения, соответствующих используемым флуорофорам. Для примера на рисунке 1 настройте:
    1. Трек 1 (DAPI): возбуждение 405 нм, обнаружение 410-480 нм.
    2. Трек 2 (Alexa Fluor 488): возбуждение 488 нм, обнаружение 495-550 нм.
    3. Трек 3 (Alexa Fluor 568): возбуждение 561 нм, обнаружение 570-620 нм.
  4. Для каждой дорожки установите диаметр конфокального отверстия на 1 единицу Эйри (1 AU).
  5. Оптимизировать мощность лазера и усиление детектора для каждого канала с помощью следующего итеративного процесса:
    1. Выберите первый канал (например, DAPI). Переключитесь в режим сканирования «Live».
    2. Установите начальную мощность лазера на низком уровне (например, 0,1-0,5%). Установить усиление детектора на умеренный уровень в его линейном диапазоне (например, 700 В для GaAsP-PMT).
    3. Постепенно увеличивайте мощность лазера, пока целевые структуры не станут чётко видимы на фоне на живом изображении.
    4. Откройте дисплей с гистограммой . Убедитесь, что нет насыщенности пикселями (гистограмма не наложена на правом краю). При необходимости уменьшайте мощность лазера.
    5. Отрегулируйте усиление детектора для получения яркого, низкошумного изображения. Избегайте усиления выше 850 В, чтобы избежать чрезмерного шума.
    6. Повторите шаги 3.5.1-3.5.5 для всех оставшихся флуоресцентных каналов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сбалансируйте мощность лазера, усиление и время задержки пикселей, чтобы максимизировать отношение сигнал/шум при минимизации фотоповреждения. Для живых ячеек делайте приоритет на меньшую мощность и сокращение времени пребывания.
  6. Задайте формат изображения (количество пикселей) и время задержки пикселей.
    1. Установите размер пикселя так, чтобы удовлетворять критерию Найквиста: размер пикселя ≤(разрешение / 2.3). Для стандартной конфокальной съёмки (боковое разрешение ~250 нм) установите размер пикселя ≤108 нм.
    2. Используйте кнопку сэмплинга 'Nyquist ' в программе, чтобы автоматически рассчитать этот показатель, если это возможно.
    3. Установите время задержки пикселей. Используйте более длительное время задержки (например, 1,0-2,0 мкс) для более высокого отношения сигнал/шум или более короткое время задержки (например, 0,5-1,0 мкс) для более быстрой съёмки.
  7. Убедитесь, что между треками выбран режим «Последовательного сканирования», чтобы минимизировать перекрёстные контакты.
  8. Нажмите «Старт», чтобы получить одно изображение. Сохраните изображение с соответствующими метаданными.

4. Дифференциальная интерференционная контрастная (DIC) визуализация

  1. Во вкладке «Acquisition» программного обеспечения выберите «Добавить новый канал » и настройте его для обнаружения передаваемого света.
  2. Выберите подходящий детектор передаваемого света (часто называемый T-PMT (лампа фотоумножителя передаваемого света) или ESID (детектор внешнего системного интерфейса) в программном обеспечении).
  3. Призма и конфигурация поляризатора DIC:
    1. Из аппаратной панели управления или программного интерфейса выберите призму DIC, соответствующую вашей цели (например, 'DIC III' для объектива 63x).
    2. Вставьте выбранную призму в световой путь.
  4. Отрегулируйте поляризатор и ползунок DIC для оптимального контраста:
    1. Вращайте анализатор (поляризатор), пока фон на «Live» не станет тёмным или очень тусклым.
    2. Во время наблюдения за живым изображением медленно корректируйте положение ползунка DIC, постепенно постепенно.
    3. Оптимизируйте до тех пор, пока клеточные особенности (например, мембраны, ядра) не появятся с отчетливым тенем, псевдотрёхмерным рельефом на нейтральном сером фоне.
  5. Установите длину волны освещения для DIC на значение в видимом диапазоне (например, 488 нм или 546 нм).
  6. Регулировать интенсивность передачи (мощность лазера или лампы) и усиление детектора для передаваемого светового канала, чтобы получить чёткое изображение без насыщения.
  7. Получите изображение DIC.

5. Z-стек для трёхмерной реконструкции

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед определением Z-стека настройте все параметры изображения (мощность лазера, усиление, пинхол, размер пикселя) на одной оптимальной фокальной плоскости, как описано в разделе 3. Это обеспечивает единообразные настройки во всех оптических секциях.

  1. Во вкладке «Получение» выберите режим «Z-стек».
  2. Определите объем интереса:
    1. Используя быстрое сканирование в реальном времени, сосредоточьтесь на самой верхней структуре, которая интересует.
    2. Нажмите «Set First» (или «Top»).
    3. Внимательно сосредоточьтесь на самой нижней структуре, которая интересует.
    4. Нажмите «Установить последний» (или «Вниз»). Программа отображает общую глубину.
  3. Установите размер Z-шага так, чтобы удовлетворить критерий выборки Найквиста в осевой направленности. (обычно dr/2.3, где dr — осевое разрешение). Для масляного объектива 63x/1.4 NA используйте 0.3–0.4 мкм.
  4. В качестве альтернативы используйте кнопки «Optimal» или «Nyquist» в программе, чтобы автоматически рассчитать размер шага.
  5. Настройте параметры изображения (мощность лазера, усиление, отверстие = 1 AU) для каждого канала, как описано в разделе 3. Для слабых сигналов рассмотрите возможность небольшого увеличения мощности или усиления лазера по сравнению с одним двумерным изображением.
  6. Начните сбор, чтобы собрать весь стек изображений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общее время сбора = (Время кадра с одного среза) × (Количество срезов)
    Планируйте соответственно, особенно для живых сэмплов.
  7. 3D-реконструкция и визуализация:
    1. Используйте модуль «Processing» (например, функцию 3D-проекции) или откройте стек изображений в специализированном ПО, например ImageJ/Fiji.
    2. Генерируйте проекции максимальной интенсивности (MIP) для просмотра всех сигналов в фокусе на одном 2D-изображении.
    3. Для настоящего 3D-представления примените рендеринг громкости. Регулируйте яркость, прозрачность и освещение по мере необходимости.
    4. Генерируйте ортогональные виды (сечения XZ и YZ) для проверки осевой протяжённости и регистрации.

6. Таймлапс-визуализация живых клеток

  1. Подготовьте живые клетки, как описано в разделе 1.2. и установить тарелку на предварительно нагретой стадии микроскопа в камере окружающей среды.
  2. Дайте образцу акклиматизироваться не менее 45-60 минут, как описано в разделе 2.6, чтобы обеспечить стабилизацию.
  3. Переместитесь в поле зрения с здоровыми, хорошо расположенными клетками и получите один качественный снимок, используя параметры, оптимизированные в соответствии с разделом 3.5.
  4. Включите систему активной стабилизации фокуса (например, Definite Focus или аналогичную). Это не обсуждается в долгосрочных экспериментах с целью компенсации теплового дрейфа.
  5. Во вкладке «Получение» выберите режим «Временные ряды».
  6. Выберите подходящий режим изображения в зависимости от необходимого баланса между скоростью, разрешением и фототоксичностью:
    1. Для максимального пространственного разрешения в менее динамичных процессах выберите режим 'SR' (SuperResolution).
    2. Для баланса, подходящего для многих динамики органелл, выберите 'SR 2 Y ' или 'SR 4 Y ' (ускоренные режимы сверхразрешения).
    3. Для очень высокоскоростной съёмки без сверхразрешения выберите режим 'Confocal' или 'Co 2 Y'.
  7. Определите экспериментальную хронологию: установите общую продолжительность эксперимента и интервал времени (Δt) между последовательными кадрами. (например, 5-30 с для митохондриальной подвижности)
  8. Оптимизируйте параметры изображения для минимизации фотоповреждений:
    1. Начните с минимальной мощности лазера, которая даёт обнаруживаемый сигнал.
    2. Регулировать усиление детектора в его линейном диапазоне (600-850 В) для достижения рабочего уровня сигнала, предпочитая усиление лазерной мощности.
    3. Используйте самую быструю скорость сканирования (минимальное время задержки пикселей), совместимую с требованиями качества изображения.
  9. Начинайте таймлапс-приобретение. Следите за первыми кадрами для устойчивости фокуса и здоровья клетки.

7. Изображение сканирования плиток с большой площадью

  1. Во вкладке «Получение» выберите режим «Сканирование плитки».
  2. Определите область мозаики с помощью одного из двух методов:
    1. Раскладка: Укажите количество плиток в направлениях X и Y (например, 3 x 3).
    2. ROI: вручную нарисуйте прямоугольник над изображением «Live», чтобы определить интересующую область. Программа автоматически вычислит количество необходимых плиток.
  3. Установите перекрытие между соседними тайлами на 10-15%.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это пересечение даёт достаточно информации для алгоритма сшивания программного обеспечения, чтобы создать бесшовное составное изображение.
  4. Настройте параметры изображения (мощность лазера, усиление, разрешение) для одной плитки, как для статического изображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для очень больших плиточных площадей рассмотрите возможность использования более быстрого режима сканирования (например, 'Co 2 Y'), чтобы сделать общее время сбора практичным и минимизировать фотоотбеливание.
  5. Начинайте приобретение плитки. Программа автоматически забирает и сшивает плитки.
  6. После получения тщательно осмотрите вышитое изображение, особенно на границах плитки, на предмет артефактов. При необходимости используйте инструменты для ручной корректировки строчки.

8. Сверхразрешённая визуализация с использованием мультиплексированного детектора массивы

  1. Во вкладке «Получение» перейдите к селектору режимов, нажмите «Smart Setup » и выберите режим «Airyscan». Затем выберите режим работы «SuperResolution» для мультиплексированного детектора массива.
  2. Выберите конкретный режим приобретения в зависимости от экспериментальных приоритетов:
    1. Режим «SR»: для максимально возможного пространственного разрешения (~120 нм латерально). Используйте фиксированные сэмплы.
    2. Режим 'SR 2 Y': обеспечивает баланс между разрешением и скоростью.
    3. Режим 'SR 4 Y': самый быстрый режим сверхразрешения (до ~25 fps, теоретически), оптимизированный для съёмки живых клеток с целью минимизации дозы света.
    4. Режим 'Co 2 Y': Обеспечивает конфокальную скорость изображения с улучшенным соотношением сигнал/шум, когда сверхразрешение не требуется.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Значения разрешения (например, 120 нм) — это спецификации системы при идеальныхусловиях 12. Фактическое разрешение зависит от подготовки образцов, соотношения сигнал/шум и правильной обработки.
  3. Настройте параметры изображения (мощность лазера, усиление детектора).
    1. Для живой ячейки начинайте с меньшей мощности лазера, чем в конфокальном режиме, чтобы снизить фотоповреждения.
    2. Для тусклых фиксированных сэмплов может потребоваться более высокая мощность лазера и/или усиление для достижения достаточного отношения сигнал/шум.
    3. Найдите минимальную мощность лазера, которая обеспечивает чистое, высококонтрастное изображение в режиме «Live».
  4. Задайте размер пикселей и время задержки.
    1. Чтобы получить улучшенное разрешение, установите размер пикселя так, чтобы удовлетворять критерию Найквиста: размер пикселя ≤(желаемое разрешение / 2.3). Для SR-режима (целевой 120 нм) установите размер пикселя ≤~52 нм.
    2. Используйте кнопки 'Optimal' или 'Nyquist' в программе, чтобы автоматически рассчитать этот показатель, если это возможно.
  5. Получите изображение. Исходные данные содержат мультиплексированные сигналы и пока не являются суперразрешёнными.
  6. Обрабатывайте полученные данные для достижения сверхразрешения:
    1. Перейдите к модулю обработки программного обеспечения.
    2. Выберите набор данных и выберите функцию 'SuperResolution Processing'.
    3. Начните с настроек «Авто». Для низкоSNR данных вручную настройте 'Strength' и 'Noise Filter', чтобы повысить резкость без добавления артефактов.
    4. (По желанию) Для максимальной точности, особенно в 3D-стеках, примените дополнительный шаг деконволюции соединений (jDCV).
    5. Выполнить обработку. Сравнивайте обработанные и необработанные виды для подтверждения улучшения реальных деталей.
  7. (По желанию) Для количественного сравнения отношения сигнал/шум (SNR) между модами:
    1. Получите изображения одного и того же образца в разных режимах.
    2. В программном обеспечении для анализа определите область интереса (ROI) на однородной структуре и измерите среднюю интенсивность сигнала.
    3. Определите фоновую ROI и измерьте стандартное отклонение фоновой интенсивности.
    4. Вычислите SNR = (средний сигнал) / (стандартное отклонение фона).
  8. (По желанию) Для эмпирического измерения разрешения системы с использованием флуоресцентных шариков:
    1. Подготовьте образец 100-нм флуоресцентных шариков.
    2. Получите Zstack изолированного шарика в режиме SR с помощью сэмплинга по Найквисту.
    3. Обрабатывайте стек с суперразрешением и (по необходимости) jDCV.
    4. Используйте инструмент 'PSF Measurement' , чтобы подогнать 3D-гауссовец и зафиксировать полную ширину на половинных значениях (FWHM).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Многоцветная флуоресцентная визуализация
Многоцветная флуоресцентная визуализация фиксированных клеток COS7 была выполнена, как описано в разделе 3. Антитела против α-тубулина (микротрубочки) и TOMM20 (митохондрии) использовались вместе с контрокрашиванием ядра DAPI. Как показано на рисунке 1, ядра (синие), митохондрии (зелёный, Alexa Fluor 488) и микротрубочки (красные, Alexa Fluor 568) были чётко выделены с высокой специфичностью и мини...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представленный здесь интегрированный протокол представляет собой комплексную дорожную карту для реализации передовых возможностей визуализации современной системы конфокального микроскопа с мультиплексированным антенным детектором сверхразрешения в рамках устойчивой системы совместного использования ресурсов. В этом разделе представлены ключевые аспекты метода, его практическое применение и его позиция в области биовизуализации. Успешное выполнение этого протокола зависит от нескольких к...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не заявляют о конкурирующих финансовых или нефинансовых интересах. Авторы использовали DeepSeek для помощи с языковой отшлифовкой и форматированием при подготовке рукописи.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы выражают признательность за техническую поддержку от Основных учреждений Медицинской школы Чжэцзянского университета и благодарят Яо Яо Чжуна за предоставление образца Hep3B с живыми клетками рака печени человека. Эта работа была поддержана Фондом естественных наук провинции Чжэцзян (LZ25H060002), проектом экспериментальных технологий Чжэцзянского университета (SYBJS202321), Департаментом образования провинции Чжэцзян (Y202351321) и Открытым исследовательским проектом Ключевой лаборатории животноводческой вирусологии Министерства сельского хозяйства и сельских дел (202201).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
  Ячейки COS7ATCC (или аналогичный)CRL-1651Клеточная линия фибробластов почек африканской зелёной обезьяны. Используется для подготовки образцов с фиксированными элементами для многоцветной сверхразрешённой визуализации 
  IgG, противомышиный IgG, Alexa Fluor 568 с сопряжениемИнвитроген (или аналогичный)A10037Вторичные антитела для окрашивания микротрубочек. Используется при разбавлении 1:500
  Дульбекко Модифицированная орлиная среда (DMEM), высокий уровень глюкозыGibco (или аналогичный)11965092Стандартная среда для культивирования клеток COS7, дополненная 10% FBS.
  Сыворотка для плода (FBS), инактивированная тепломGibco (или аналогичный)10082147Сывороточная добавка, используемая в концентрации 10% (v/v) во всех клеточных культурных средах.
  Стеклянная антенна для визуализации (35 мм, & микро-антенна, #1.5 полимерная капка, толщина 0.17 мм)Ибиди (или аналогичный)81156Субстрат для клеточной пластины и визуализации. Критично для совместимости с масляными объектами с высоким уровнем NA.
  Обработка изображений и программное обеспечение для анализа (модули ZEN)Carl Zeiss AGZEN 3.5 (синий)Используется для 3D-реконструкции, обработки сверхразрешения (например, обработка Airyscan), измерения PSF и анализа SNR.
  ImageJ / ФиджиОткрытый исходный кодН/ДИспользуется для дополнительной 3D-реконструкции, генерации ортогональных видов и общего анализа изображений.
  Погружное масло (показатель преломления = 1,518)Карл Цейсс (или аналогичный)444960-0000-000Для использования с масляными иммерсионными объективами (например, 63x/1,4 NA).
  Лазерно-сканирующая конфокальная микроскопическая система с мультиплексным антенным детектором (например, ZEISS LSM 900 с Airyscan 2)Carl Zeiss AGLSM 900 (Airyscan 2)Основная платформа для визуализации, используемая для всех конфокальных и сверхразрешённых режимов, описанных в протоколе.
  Минимально необходимая среда (MEM) с Эрлом s SaltsGibco (или аналогичный)11095080Стандартная среда для культивирования клеток Hep3B, дополненная 10% FBS.
  Мышиный анти-альфа;-тубулин моноклональное антитело (клон DM1A)Сигма-Олдрич (или аналогичный)T6199Первичное антитело для маркировки микротрубочек. Используется при разбавлении 1:500
  Параформальдегид (PFA), 4% в PBS  Jinpan  (или что-то подобное)TBS5083Фиксатор клеток. Используйте при комнатной температуре 15 минут. Обращайтесь с соответствующими мерами предосторожности.
  Среда для визуализации без фенолаGibco (или аналогичный)21063029Среда с низкой автофлуоресценцией, используемая для изображения живых клеток. Предварительно уравновешенный с 5% CO<суб>2 при 37 градусах; C до использования.
  Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS), 1X, pH 7,4CellWorld (или что-то подобное)C0162-311Используется как буфер для промывания и разбавления на протяжении всего протокола.
  Золотой антифейд-монтант ProLongИнвитроген (или аналогичный)P36930Закалённая монтажная среда для сохранения флуоресценции в фиксированных образцах.
  Triton X-100Сигма-Олдрич (или аналогичный)T8787Используется при 0,1% (v/v) для проницаемости клеток
  Tween-20Сигма-Олдрич (или аналогичный)P9416Используется при 0,05% (v/v) в PBS (PBST) для этапов промывания после инкубации антител.
Бычий сывороточный альбумин (BSA), Fraction VСигма-Олдрич (или аналогичный)A7906Используется при 1% (w/v) в PBS для блокировки и как компонент буфера разбавления антител.
DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол)Сигма-Олдрич (или аналогичный)D9542Ядерная контрокрашивание. Используется при конечной концентрации 1 и микро; g/mL.
IgG, Alexa Fluor 488 с сопряжениемИнвитроген (или аналогичный)A21206Вторичное антитело против окрашивания митохондрии. Используется при разбавлении 1:500
Флуоресцентные микросферы (шарики), диаметром 100 нмInvitrogen (например, TetraSpeck™) или подобныеT7279Используется для эмпирического измерения системы» функция разброса точек (PSF) и разрешение.
Клетки Hep3B стабильно экспрессируют митохондрии EGFPIMMOCELLIM-H367Линию клеток человеческой гепатомы, спроектированной для стабильной экспрессии EGFP, направленного на митохондриальную матрицу. Используется для таймлапс-визуализации живых клеток.
Буферное решение HEPES, 1 млнGibco (или аналогичный)15630080Используется при конечной концентрации 25 мМ в среде для стабилизации pH во время живой съёмки вне CO2 инкубатора.
Высокоточное стекло (#1,5, толщина 0,17 мм)Мариенфельд (или аналогичный)107052Используется для монтажа фиксированных образцов.
Операционное программное обеспечение для микроскопа (например, ZEN Blue Edition)Carl Zeiss AGZEN 3.5 (синий)Используется для управления системой, получения изображений и базовой обработки.
Объективная линза: Plan-apochromat 63x/1.40 NA Oil DICCarl Zeiss AG421462-9900-000Основная цель, используемая для высокоразрешающей съёмки.
Поликлональное антитело кролика против TOMM20Abcam (или аналогичный)ab186735Первичное антитело для маркировки митохондрий. Используется при 1:1000 разбавления 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Prakash, K., et al. Resolution in super-resolution microscopy - definition, trade-offs and perspectives. Nat Rev Mol Cell Biol. 25, 677-682 (2024).
  2. Schermelleh, L., et al. Super-resolution microscopy demystified. Nat Cell Biol. 21, 72-84 (2019).
  3. Bond, C., et al. Technological advances in super-resolution microscopy to study cellular processes. Mol Cell. 82, 315-332 (2022).
  4. Huff, J., et al. The new 2D super-resolution mode for ZEISS Airyscan. Nat Methods. 14, 1223(2017).
  5. Wu, X., Hammer, J. A. ZEISS Airyscan: Optimizing Usage for Fast Gentle, Super-Resolution Imaging. Methods Mol Biol. 2304, 111-130 (2021).
  6. Yin, W., Liu, S. S., Zhao, Q. B. Optimization strategy for fast super-resolution imaging parameters based on LSM 900. Chin J Cell Biol. 47, 1644-1655 (2025).
  7. Moore, A. S., et al. Actin cables and comet tails organize mitochondrial networks in mitosis. Nature. 591, 659-664 (2021).
  8. Ranjan, R., Chen, X. Super-resolution live cell imaging of subcellular structures. J Vis Exp. (167), e61563(2021).
  9. Harmer, J., et al. Airyscan super resolution microscopy to study trypanosomatid cell biology. Methods Mol Biol. 2116, 449-461 (2020).
  10. Lin, M. N., et al. Advanced functions and management of laser scanning confocal microscopy LSM880 with Airyscan. J Chin Electron Microsc Soc. 38, 271-275 (2019).
  11. Li, H. J., et al. Comparative study on imaging characteristics and applications of LSCM880 with Airyscan and spinning disk confocal microscopy. Technol Innov Appl. 32, 4-8 (2020).
  12. Huff, J., Bergter, A., Luebbers, B. Multiplex mode for the LSM 9 series with Airyscan 2: fast and gentle confocal super-resolution in large volumes. Nat Methods. 16, 1159-1163 (2019).
  13. Chen, C. Y., et al. Depletion of Vasohibin 1 speeds contraction and relaxation in failing human cardiomyocytes. Circ Res. 127, 14-27 (2020).
  14. Sandin, J. N., et al. Near simultaneous laser scanning confocal and atomic force microscopy (conpokal) on live cells. J Vis Exp. (162), e61433(2020).
  15. Castagnini, D., Palma, K., Jara Wilde, J., et al. Super-resolution Imaging of Proteus mirabilis biofilm by expansion microscopy. J Vis Exp. (221), e67932(2025).
  16. Wolf, D. M., et al. Method for live-cell super-resolution imaging of mitochondrial cristae and quantification of submitochondrial membrane potentials. Methods Cell Biol. 155, 545-555 (2020).
  17. Wu, Z. H., et al. Near-infrared perylene carboximide fluorophores for live-cell super-resolution imaging. J Am Chem Soc. 146, 7135-7139 (2024).
  18. Pfanzelter, J., Mostowy, S., Way, M. Septins suppress the release of vaccinia virus from infected cells. J Cell Biol. 217, 2911-2929 (2018).
  19. Kolossov, V. L., et al. Airyscan super-resolution microscopy of mitochondrial morphology and dynamics in living tumor cells. Microsc Res Tech. 81, 115-128 (2018).
  20. He, J., et al. Renal macrophages monitor and remove particles from urine to prevent tubule obstruction. Immunity. 57, 106-123 (2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Super Resolution MicroscopyConfocal MicroscopyMultiplex DetectionLive Cell ImagingMulticolor FluorescenceZ Stack ReconstructionTime Lapse ImagingAiryscan SRImage AnalysisSample Preparation

Related Articles