In vitro Оценка усиливающих эффектов растительных молекул на традиционные биоциды

Краткое содержание

Этот протокол предоставляет систематическую основу для оценки того, как фитохимикаты могут усиливать бактерицидные эффекты традиционных биоцидов с помощью моделирования бактерицидной активности и комбинаторных тестов взаимодействия, которые направлены на выявление синергетических смесей, улучшающих микробный контроль и снижающие общее использование биоцидов.

Аннотация

Разработка инновационных и эффективных подходов к повышению антимикробной активности традиционных биоцидов является перспективной стратегией для улучшения микробного контроля в целях дезинфекции в здравоохранении. В этом контексте мы описываем подробный протокол оценки усилительного эффекта растительных фитохимикатов на синтетические биоциды. Эти растительные продукты являются привлекательными кандидатами в качестве адъювантов биоцида благодаря своему структурному разнообразию, биоактивности и часто более низкой токсичности. Описанный здесь рабочий процесс позволяет определять минимальные концентрации бактерицидов (MBC) и систематически генерировать как кривые доза-ответ, так и временной реакции для каждого тестируемого продукта отдельно (биоциды и фитохимикаты), а также для их двойных или тройных комбинаций. Полученные данные позволяют проводить продвинутое математическое моделирование, включая определение индекса дробной бактерицидной концентрации (FBCI) и оценку взаимодействий между тестируемыми продуктами в отношении синергетических, аддитивных или антагонистических эффектов с помощью программного обеспечения Combenefit. В этом смысле можно выявить перспективные натуральные продукты в качестве усилителей биоцидов, оптимизировать антимикробную эффективность и разработать более устойчивые и безопасные стратегии дезинфекции, которые могут снизить концентрацию, необходимую для синтетических биоцидов. Это улучшает микробный контроль и минимизирует экологические и общественные риски, связанные с чрезмерным использованием биоцидов.

Введение

Инфекции, связанные с здравоохранением (HAI), являются одними из самых серьёзных и тревожных проблем общественного здравоохранения в^{мире 1}. Тревожно, что они тесно связаны с распространением мультилекарственно-устойчивых микроорганизмов (MDR) и сохранением бактериальной бионагрузки на поверхности больниц, часто из-за неправильной или неэффективной^{дезинфекции 2,3}. Кроме того, перекрёстное загрязнение между пациентами, медицинским персоналом и медицинским оборудованием ещё больше усугубляет эту^{проблему 4,5}. В Европе, например, оценивается, что почти 80 000 госпитализированных пациентов страдают как минимум от одного HAI в любой день, что составляет примерно 16 миллионов дополнительных больничных дней каждый^{год 2}. Пандемия COVID-19 ещё больше усложнила эту проблему, способствуя всплеску бактериальных инфекций MDR из-за высокого использования антимикробных средств/дезинфицирующих средств и увеличения числа^{госпитализаций 6,7}. Рост числа бактерий, устойчивых к антибиотикам, включая Escherichia coli с расширенным спектром β-лактамазы (ESBL), и метициллин-резистентный Staphylococcus aureus (MRSA), привёл к росту бремени для здоровья и экономики во всём мире. Фактически, эти штаммы подчёркивают срочность разработки инновационных решений для профилактики и контроля ^{инфекций 1,8,9}.

С учётом этого биоциды стали ключевыми инструментами для контроля распространения устойчивых бактерий и бактериальных инфекций, широко применяясь для дезинфекции больничных поверхностей, стерилизации оборудования, очистки водных систем и предотвращения загрязнения медицинских^{изделий 10,11}. В отличие от антибиотиков, которые действуют на специфические микробные^{мишени 12}, биоциды одновременно нарушают несколько клеточных структур, включая мембраны, ферменты, рибосомную РНК и метаболические^пути 13,14,15. Изначально считалось, что такое широкое действие снижает риск сопротивления. Однако данные показывают, что микроорганизмы способны адаптироваться к воздействию биоцидов, что приводит к толерантности, устойчивости и даже перекрёстной устойчивости к^{антибиотикам 10,16}. Например, воздействие Pseudomonas aeruginosa бензалкония хлориду, отобранного для вариантов, устойчивых к ципрофлоксацину и новобиоцину, через избыточную экспрессию насосов^{вытока 17}. Аналогично, триклозан активирует насосы выброса при Stenotrophomonas maltophilia, а воздействие хлоргексидина связано с повышенной устойчивостью к антибиотикам у S. aureus¹⁸.

Кроме того, четвертичные аммониенные соединения (QAC), хлоргексидин, диамидины, акридины и триклозан считаются возможными причинами отбора и сохранения устойчивости бактерий к нескольким^{антибиотикам 19,20}. Гены устойчивости, такие как qacA/B и SMR, известны тем, что обеспечивают толерантность к QAC, а также сообщались о клинических сбоях, таких как бактериемия, связанная с катетерами, хранящимися в загрязнённых растворах QAC, и внутреннее микробное загрязнение йодофоров^(16,17,21). Эти результаты подчёркивают острую необходимость оптимизированного использования биоцидов, что подтверждается механистическими исследованиями и рациональными стратегиями дезинфекции.

Биопленки — это высококлеточные и хорошо структурированные бактериальные сообщества, встроенные во внеклеточный матрикс полисахарид, белков и нуклеиновых кислот, — представляют собой дополнительное и значимое препятствие для контроля^{инфекций 22,23}. Они демонстрируют выдающуюся толерантность к антибиотикам и биоцидам, что способствует сохранению инфекций у пациентов. Кроме того, биопленки часто связаны с устойчивым загрязнением медицинских изделий, хирургических инструментов и больничных^{поверхностей 24}. Несмотря на клиническую значимость, биоплёнки признаны основными факторами хронических инфекций и антимикробной устойчивости лишь в последние десятилетия. Их устойчивость такова, что даже агрессивные дезинфицирующие средства часто не могут их уничтожить, оставляя позащитные клетки, способные пересеять^{инфекцию} 20,25,26. Поэтому поиск эффективных стратегий антибиоплёнки крайне важен для контроля HAI и снижения общественного здоровья и экономической нагрузки от патогенов^{MDR 27,28}.

В качестве перспективного решения фитохимикаты, являющиеся вторичными метаболитами, производящимися и извлекаемыми из растений, представляют собой в значительной степени неиспользованный ресурс для новых антимикробных и антибиопленочных^{агентов 29}. Однако ни один фитохимикат не используется в качестве антибиотика из-за его умеренной антимикробной активности по сравнению с обычными антибиотиками. Фитохимикаты обычно классифицируются как антимикробные препараты на основе тестов на восприимчивость, которые дают минимальную концентрацию ингибитора (MIC) в диапазоне от 100 до 1000 мкг/мл, что значительно выше показателей обычных^{антибиотиков 30,31}. Важно отметить, что фитохимикаты уже продемонстрировали антибиопленочную активность при использовании отдельно или в качестве потенциаторов традиционных биоцидов. Например, кверцетин может подавлять производство альгината, что приводит к снижению адгезии при развитии^{биопленки} 32,33,34. Эмодин ингибировал развитие биопленок P. aeruginosa, E. coli и S. aureus за счёт снижения экспрессии ключевых генов, участвующих в формировании^{биопленок 35}. Сочетание фитохимикатов с традиционно используемыми, но всё менее эффективными биоцидами в качестве агентов, модифицирующих устойчивость, представляет собой перспективную стратегию повышения антимикробной эффективности³⁶. Такие синергетические взаимодействия могут влиять на механизмы микробной устойчивости, снижая минимальные эффективные концентрации биоцидов, необходимые для достижения удовлетворительной^{дезинфекции 37}. Этот подход оптимизирует биоцидную эффективность, снижает селективное давление для развития устойчивости и снижает экологические и токсикологические последствия, связанные с чрезмерным применением^{биоцидов 15,20}. Фитохимикаты структурно^{разнообразны 38, 39, 40}, широко^{доступны 38, 39, 41},^{недорогие 38, 39, 42} и часто менее токсичны для человека и окружающей среды, чем синтетические^{биоциды 38,39}. Это натуральные продукты, часто получаемые из возобновляемых источников растений и в некоторых случаях, по сообщениям, демонстрируют более низкую экологическую устойчивость и снижение токсичности по сравнению с некоторыми синтетическими^{биоцидами} 43,44,45. Хотя их стоимость, доступность и профили токсичности варьируются в зависимости от соединения и процесса экстракции, несколько фитохимикатов продемонстрировали благоприятные характеристики безопасности и окружающей среды по сравнению с некоторыми традиционными^{биоцидами 46,47}.

Этот протокол направлен на оценку потенциала фитохимикатов по отдельности и в сочетании с традиционными биоцидами для дезинфекции в здравоохранении. Кратко говоря, протокол оценивает взаимодействия биоцида и фитохимических веществ в широких концентрационных диапазонах. Биоциды изначально тестировались на 0,1–500 мг/л и фитохимикаты в 50–10 000 мг/л для определения минимальных бактерицидных концентраций (MBC) (Таблица 1). Для двойных комбинаций суббактерицидные концентрации выбирались следующим образом: бензалконий хлорид (BAC) при 0,1, 0,5 и 0,75 мг/л; переуксусную кислоту (PAA) в дозах 0,1, 0,3 и 0,5 мг/л; салициловая кислота (SAL) при 50, 100 и 250 мг/л; и эвгенол (EUG) при 100, 250 и 750 мг/л (Таблица 1). Тройные комбинации проводились с использованием BAC (0,75 мг/л) или PAA (0,5 мг/л) в сочетании с SAL (100 или 250 мг/л) и EUG (250 или 750 мг/л) (Таблица 1). Анализы с временным ответом проводились в течение 1–90 минут, после чего следовала оценка повторного роста бактерий в течение 24 часов. Антимикробные взаимодействия количественно оцениваются с помощью фракционного бактерицидного индекса концентрации (FBCI) и анализируются с помощью программного обеспечения Combenefit, а кинетика дезинфекции моделируется с помощью моделей Чика-Уотсона и Вейбулла для характеристики зависимости концентрации и динамики инактивации.

Инновация заключается в рациональном проектировании стабильных двойных и тройных взаимодействий между фитохимикатами и биоцидами, оптимизируя дезинфекционную активность при минимизации токсичности и воздействия на окружающую среду за счёт снижения использования традиционных биоцидов. Математические подходы, такие как расчёт FBCI и оценка синергии, также использовались для количественной оценки взаимодействий фитохимических и биоцидов в микробном контроле. В то время как FBCI предлагает категоричную интерпретацию взаимодействия (синергии, антагонизма или равнодушия) при определённых комбинациях концентраций, Combenefit позволяет проводить более всестороннюю оценку паттернов взаимодействия на основе поверхности ответа в более широком диапазоне концентраций. Это позволяет визуализировать и количественно оценивать эффекты взаимодействия, зависящие от концентрации, которые могут не быть отображены одноточечными^{индексами 48,49}. Кроме того, кинетика дезинфекции моделируется с использованием моделей Чика-Уотсона (для доза-ответа) и Вейбулла (для временного ответа)⁵⁰. Эти модели обеспечивают кинетическое моделирование микробной инактивации, предлагая количественные параметры, описывающие скорость дезинфекции и поведение кривой^{выживаемости 50}. Они помогают определить, следует ли убийство логично-линейной или нелинейной динамике, и позволяют более механистически интерпретировать эффекты лечения, что выходит за рамки описания^{FBCI 51,52}.

Этот протокол обеспечивает систематическое выявление перспективных комбинаций фитохимических и биоцидов и разработку эффективной, устойчивой стратегии дезинфекции в здравоохранении. В отличие от классических MIC или шахматных тестов, которые обеспечивают статические измерения концевых точек, этот протокол интегрирует динамическое бактерицидное моделирование и анализ взаимодействия для фиксации масштаба и кинетики потенциации. Хотя классические шахматные анализы дают ценную информацию о тормозных взаимодействиях на основе конечных точек MIC, они ограничиваются измерениями роста и индексами единичного взаимодействия. Описанный здесь протокол выходит за рамки этой структуры, количественно оценивая бактерицидную активность, а не тормоз роста, оценивая повторный рост после обработки для оценки устойчивого антимикробного эффекта, оценивая как двойные, так и тройные комбинации биоцида-фитохимикатов, моделируя кинетику дезинфекции с помощью подходов Чика-Уотсона и Вейбулла, а также применяя анализ поверхности концентрации и реакции с помощью Combenefit. Эта многомерная стратегия позволяет проводить более надёжную и предсказательную оценку потенциации биоцидов-фитохимических веществ.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Предлагаемая методология была адаптирована из европейского стандарта EN 1276⁵³.

1. Подготовка культуры

1. Криоконсервировать тестируемые бактериальные штаммы Escherichia coli CECT 434 и Staphylococcus aureus CECT 976, храня их в криовиалах с глицерином 30% (v/v) при -80 °C.
2. Для восстановления культивируйте бактерии в пластинах с подсчётом пластин (PCA) и дайте им расти в течение 24 часов при 25 °C, инкубируя пластины.
3. Подготовьте культуры, выращенные за ночь изучаемых сортов, инокуляцируя одну бактериальную колонию из полосатой пластины в триптичном соевом бульоне (TSB) для достижения экспоненциальной фазы роста (согласно калибровочной кривой, полученной на следующих шагах), и инкубировать на встряхивающем инкубаторе при 100 об/мин и 25 °C.
4. С помощью спектрофотометра получите калибровочную кривую единиц формирования колоний (CFU)/мл в зависимости от оптической плотности при 600 нм (_{OD 600}) для каждого бактериального штамма при вышеупомянутых условиях культивирования.
   1. Выращивать бактериальную культуру за ночь в TSB при 25 °C с перемешиванием (100 об/мин).
   2. Приготовьте 10-кратное серийное разбавление культуры в стерильном физиологическом растворе (0,85% с NaCl).
   3. Измерьте_{OD 600} каждого разбавления с помощью спектрофотометра.
   4. Разбавления, соответствующие пластине, на PCA. Инкубировать тарелки при 25 °C в течение 24 часов.
   5. Выберите пластины с количеством от 10 до 100 колоний и определите соответствующие значения CFU/mL.
   6. Постройте значения CFU/mL с соответствующими показаниями_{OD 600} в линейном диапазоне (0,04–0,8).
   7. Проведите как минимум два независимых анализа с минимум двумя репликами. Выполнить линейный регрессионный анализ для получения калибровочного уравнения.
   8. Используйте полученное уравнение для оценки концентрации бактерий в последующих экспериментах.
5. Центрифугуйте инокулу при концентрации 3772 x г в течение 10 минут и промыйте один раз солевым раствором фосфатного буфера (PBS) (8 г/л NaCl, 0,2 г/л KCl, 1,44 г/л Na_{2HPO 4} и 0,24 г/л KH₂PO₄).
6. Используя спектрофотометр, отрегулируйте_{OD 600} инокулы в PBS до 1 x 10 единиц по⁸ колоний (CFU)/mL.

2. Подготовка и контроль молекулярных растворов

1. Рассмотрим отбор, изучение и приготовление тестируемых молекул следующим образом: используйте два биоцида — BAC и PAA (15% (w/v) — и два фитохимиката — SAL и EUG 99%.
   ПРИМЕЧАНИЕ: BAC был выбран в этом исследовании, поскольку это широко используемый QAC, эффективный против бактерий через разрушение^{мембраны 54,55}. Переуксусная кислота — это широкоспектральный окисляющий дезинфицирующий препарат, который всё чаще используется для стерилизации медицинских^{приборов 56,57}. Салициловая кислота представляет интерес фенольное соединение, поскольку проявляет антибактериальную и антибиоплёночную активность, а также влияет на бактериальную вирулентность и механизмы устойчивости к антибиотикам, что указывает на потенциальную роль в дезинфекции и микробном^{контроле 58,59}. Эугенол — это натуральное терпеноидное/фенольное ароматическое соединение с признанными антимикробными свойствами, которое может служить более безопасной и экологичной альтернативой синтетическим^{дезинфицирующим средствам 60,61}.
2. Подготовьте BAC и PAA свежими в ультрачистой воде.
3. Растворённые EUG и SAL растворялись в диметилсульфоксиде (DMSO), что гарантирует, что клетки никогда не подвергались воздействию концентрации DMSO выше 5%.
4. Подготовьте тестируемые концентрации BAC, PAA, EWG и SAL согласно таблице 1.
5. Подготовьте тестируемые концентрации в центрифугных трубках по 15 мл, регулируя объёмы стандартного раствора и суспензии ячейки, чтобы получить желаемую конечную концентрацию молекулы и плотность ячеек.
6. Для всех последующих анализов включайте два отрицательных контрольных фактора: (i) бактерии без обработки и (ii) бактерии, подвергшиеся воздействию 5% DMSO (так как это максимальная концентрация DMSO, которой подвергаются клетки на протяжении всего анализа).

3. Воздействие бактерий на биоцид или фитохимикаты

1. Добавьте 1 мл клеточной суспензии в 1 мл ультрачистой воды и подождите 2 минуты.
2. Затем добавьте 8 мл биоцида или фитохимического раствора (в сверхчистой воде или 5% DMSO) и инкубируете на встряхивающем инкубаторе при 100 об/мин и 25 °C в течение 30 минут.
3. Смешайте соединения с клетками путём вихря.

4. Нейтрализация, последовательное разбавление и покрытие

1. Проведите нейтрализацию каждого биоцида или фитохимического вещества при каждой тестируемой концентрации с использованием метода разбавления-нейтрализации и универсального нейтрализатора: 30 г/л полисорбата 80, 30 г/л сапонина, 1 г/л L-гистидина, 3 г/л лецитина и 5 г/л тиосульфата натрия в буфере 0,0025 М. фосфат.
2. Добавьте 1 мл образца нейтрализуемого к 8 мл универсального нейтрализатора и 1 мл ультрачистой^{воды 53}.
3. Выполните десятикратное последовательное разбавление, добавив 100 мкл специфического разбавления к 900 мкл стерильного солевого раствора для последующего разбавления (повторите это от разбавления ^10-1 до разбавления ^10-7), и определите оставшиеся клетки на нейтрализированных образцах, нанеся 10 мкл каждого разбавления на PCA, согласно методу drop plate⁶².
4. Инкубировать пластины при 25 °C без перемешивания в течение 24 часов для подсчёта клеток.
5. КФУ визуально подсчитывались для пластин, содержащих более 10 и менее 100 колоний, а концентрация, при которой происходит полное снижение культивируемости, фиксируется как MBC. Согласно уравнению (1), вычислите CFU/mL, где n — количество подсчитанных CFU, SV — объём покрытого образца (0,01 мл), а Dil — разбавление, в котором были подсчитаны CFU.
   CFU/mL = n/(SV Dil) (1)
6. Оцените логарифмическую редукцию, логарифмическую редукцию, согласно уравнению (2), где X₀ и X — это CFU/mL для необработанных бактерий (контрольных) и обработанных бактерий соответственно.
   log reduction = log (X₀) - log (X) = log (X₀/X) (2)

5. Оценка двойных и тройных комбинаций

1. Примените описанную выше методологию для оценки активности всех возможных двойных и тройных комбинаций одного биоцида и одного фитохимического вещества (для двойных комбинаций) или двух фитохимикатов (для тройных комбинаций) с целью поиска возможных эффектов потенцирующего и синергетического эффекта.
2. Рассмотрим следующий выбор концентраций: для двойных комбинаций концентрации BAC составляли 0,1, 0,5 и 0,75 мг/л; для PAA составляли 0,1, 0,3 и 0,5 мг/л; для SAL — 50, 100 и 250 мг/л; а для EUG — 100, 250 и 750 мг/л (Таблица 1). Что касается тройной комбинации, концентрация BAC, измеренная для анализа, составила 0,75 мг/л; для PAA — 0,5 мг/л; для SAL — 100 и 250 мг/л; а для EUG — 250 и 750 мг/л (Таблица 1).
3. Выбирайте концентрации, оцениваясь в тесте доза-ответ для отдельных молекул и приводящих к небактерицидным эффектам.

6. Оценка повторного роста бактерий

1. Для оценки способности к повторному росту бактерий позволите микробным клеткам расти в жидкой среде более 24 часов, при 25 °C и 100 об/мин, после обработки и нейтрализации.
2. Выполнить десятикратное серийное разбавление, покрытие, инкубацию пластин PCA и количественную оценку CFU/mL с использованием тех же методов и условий.

7. Интерпретация комбинаторных результатов — Индекс дробной бактерицидной концентрации (FBCI)

1. Интерпретируем результаты комбинаторного анализа следующим образом:
   1. Для двойственных комбинаций FBCI = FBC(A) + FBC(B), где дробная бактерицидная концентрация A, FBC(A) — это отношение между MBC A в двойной комбинации и MBC только A (^{комбинация} MBC A/MBC_A ^{отдельно}), а FBC(B) — отношение между MBC B в двойной комбинации и MBC B в одиночку (^{MBC B только комбинация}/MBC_B⁾ (уравнение 3).
   2. Для тройных комбинаций FBCI = FBC(A) + FBC(B) + FBC(C), где FBC(A) — это отношение между MBC A в тройной комбинации и MBC только A (^{комбинация} MBC A/MBC_A ^{отдельно}), FBC(B) — отношение между MBC B в тройной комбинации и MBC B только (^{MBC B комбинация}/^{MBC B только} по себе). а FBC(C) — это отношение MBC C в тройной комбинации и MBC C в отдельной комбинации (MBC ^{C в комбинации}/MBC ^{C отдельно}) (Уравнение 4).
   3. Применяя классификацию, предложенную Фернандесом ^{и др.50}, FBCI ≤ 0.5 соответствует синергизму, 0.5 < FBCI ≤ 1 указывает на аддитивность, 1 < FBCI ≤ 4 классифицируется как равнодушие, а FBCI > 4.00 считается антагонизмом.
      FBC(A) + FBC(B) = (^MBC двойная комбинация/_MBC ^A) + (MBC ^{B двойная комбинация}/^{MBC B отдельно}) (3)
      FBC(A) + FBC(B) + FBC(C) = (MBC _A ^{тройная комбинация}/_{MBC A}⁾ + (MBC B ^{тройная комбинация}/MBC_B ^{отдельно}) + (^{MBC C тройная комбинация}/^{MBC C только} по себе) (4)

8. Процедура теста со временной реакцией

1. Подготовьте ночные культуры E. coli CECT 434 и S. aureus CECT 976 согласно описанным ранее условиям роста (раздел 1).
2. Добавьте 1 мл клеточной суспензии в 1 мл ультрачистой воды и подождите 2 минуты. На этом этапе добавьте 8 мл биоцидного/фитохимического раствора (в сверхчистой воде или 5% DMSO), чтобы достичь желаемых концентраций для каждой молекулы: 1/4 x MBC и MBC, а для бактериальной суспензии (регулировкой OD) при 100 об/мин и 25 °C. Смешайте молекулы с клетками путём вихря.
3. Оцените следующие времена экспозиции: 1, 3, 5, 15, 30, 45, 60 и 90 мин.
4. Как описано в разделе 4, оценивайте антимикробную активность, рассчитывая логарифмическую (CFU/mL) редукцию в логарифме (X/_{X 0}).
5. Проведите биоцид или фитохимическую нейтрализацию для каждой пары концентраций/испытанных временем методом разбавления-нейтрализации и универсального нейтрализатора — серийного разведения и покрытия, как описано ранее в разделе 4.

9. Анализ комбинаторных данных с помощью программного обеспечения Combenefit

1. Откройте предоставленный файл 'REPLICATE_TEMPLATE.xls' в https://sourceforge.net/projects/combenefit/files/ , чтобы убедиться в правильной структуре и форматировании.
2. Организуйте свои данные в матрицу согласно Дополнительной таблице 1, где:
   1. Увеличить концентрацию продукта A сверху вниз (от самой низкой к самой высокой пронумерованных строк). Включите как минимум три разные концентрации для продукта A.
   2. Увеличить концентрацию продукта B слева направо (от самого низкого к самому высокому пронумерованному столбцу): включить как минимум три разные концентрации для продукта B.
   3. Обозначим верхний ряд (0 мг/л продукта A) одноагентный продукт B.
   4. Обозначим первый столбец (0 мг/л продукта B) одноагентный продукт A.
   5. Представляем ячейку (0,0) как необработанный контроль.
   6. Нормализуйте для каждого случая используемые значения с помощью уравнения (5), где treat_0h — логарифм (CFU/mL) для конкретной обработки сразу после экспозиции (0h); treat_24h — это журнал (CFU/mL) для конкретного лечения, через 24 часа после воздействия (восстановления); control_0h — это журнал (CFU/mL) для соответствующего контроля (только клетки или клетки, подвергшиеся воздействию 5% DMSO), сразу после воздействия (0 ч); и control_24h — это журнал (CFU/mL) для соответствующего контроля (только клетки или клетки, подвергшиеся воздействию 5% DMSO), через 24 часа после воздействия (восстановления).
   7. Во всех случаях проводите перечисление CFU после 24-часовой инкубации пластинчатых образцов на PCA.
      (treat_0h - treat_24h)/(control_0h - control_24h) 100 (5)
      ПРИМЕЧАНИЕ: Включайте контрольные/нелечённые условия, определяющие 100% жизнеспособность, и положительный контроль, определяющий максимальное торможение (опционально); Используйте только числовые значения, без формул; Используйте одинаковое количество строк и столбцов в разных репликах; Используйте '.' для десятичных знаков.
3. Сохраните файл как .xls или .xlsx.
4. Создайте Excel-файл для каждой реплики, как описано ранее и как в Дополнительной таблице 1, и добавьте все файлы в одну папку.
5. Откройте программное обеспечение Combenefit (Cancer Research UK Cambridge Institute, Кембридж, версия 2.021, доступно по адресу https://sourceforge.net/projects/combenefit/).
6. Загрузите эту папку в Combenefit.
   1. Откройте программное обеспечение Combenefit
   2. Нажмите «Выбрать папку проекта» и выберите правильную папку.
   3. Выбор эталонной модели: аддитивность Лёве, предполагающая точный механизм для обоих произведений; Независимость Блисса, предполагающая независимое действие, или HAS, которая является консервативной моделью (сравнивает комбинацию с лучшим единичным агентом). Лучшая практика заключается в том, чтобы использовать как минимум две модели и выбрать лучшую.
   4. В этом случае была выбрана модель Блисса с учётом режима действия исследуемых молекул.
   5. Выберите нужные графические выходы, зная, что для дистрибутива Synergy нужно выбрать хотя бы один ещё один.
   6. Анализ Press Run (дополнительный рисунок 1). Совет: в окне «Выбрать сохранение» во время анализа выберите «Всё», чтобы сохранить все графические выводы в оригинальной папке.

10. Применение моделей Чика-Уотсона и Вейбулла к данным о дозе и временной реакции

1. Подготовьте свои данные, отформатировав набор данных в Excel или CSV перед импортом: для доза-ответ столбец A соответствует дозе (концентрация, мг/л), а столбец B — логарифму (X/X₀); Для данных временной реакции столбец A соответствует времени (минутам), а столбец B — логарифма (X/X₀).
2. Сохраните файл в '.csv' или копируете напрямую в Prism.
3. Open GraphPad Prism (используемая версия: 9.0 для Windows 11; Ла-Хойя, Калифорния, США).
4. В новой таблице и графике выберите XY, а в таблице данных выберите Ввести или импортировать данные в новую таблицу (дополнительный рисунок 2).
5. В разделе Options для X выберите Число, для Y выберите Ввести реплицировать значения в боковые подстолбцы и нажмите Создать (Дополнительный рисунок 2).
6. Введите данные о дозе/времени в X и ведите данные о выживаемости в Y.
7. Перейдите в раздел Анализ, Нелинейная регрессия (подгонка кривой), выберите наборы данных, которые хотите проанализировать, и нажмите OK (дополнительный рисунок 2).
8. Выберите «Новое», а затем «Создать новое уравнение».
9. В уравнении для типа уравнения выберите явное уравнение: Y = функция от X и параметров; для названия напишите модель Chick-Watson/модель Weibull; а в определении записать Y = -a*x^(n)*30 Модель Чика-Уотсона (дополнительный рисунок 3) и Y = -1/(2.303)*(x/a)^(b) для модели Вейбулла (дополнительный рисунок 4).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Модель Чика-Уотсона выражена уравнением 6, где X₀ и X — это CFU/mL для необработанных бактерий (контрольных) и обработанных бактерий, C — концентрация (доза), k_dis — коэффициент скорости инактивации, C — концентрация (доза), n — показатель концентрации, а t — время воздействия (в данном случае, 30 мин) ⁵⁰. Модель Чика-Уотсона была применена для наблюдения доза-ответа и характеристики связи между концентрацией дезинфицирующего средства и восстановлением микробов.
   log (X/X₀) = -k_dis · Cⁿ · t (6)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Модель Вейбулла выражена уравнением 7, где X₀ и X — это CFU/mL для необработанных (контрольных) и обработанных бактерий, t — время, α — параметр масштаба (характеристическое время), а β — параметр^{формы 50}. Модель Вейбулла применялась для наблюдения временной реакции и характеристики формы кривых выживания. Параметр масштаба представляет характерное время инактивации, а параметр формы — отклонения от логарифмичного поведения (β = 1 логарифмично; β < 1 хвост; β > 1 плечо).
   log (X/_{X 0}) = -1/2.303 (t/α)^β (7)
10. В разделе «Роли для начальных значений» выберите 0 в качестве начального значения для каждого параметра и (начальное значение, чтобы было подгонено) как правило (дополнительный рисунок 5).
11. Оставьте остальные настройки по умолчанию и нажмите OK.
12. Проверьте подгонку и проверьте предполагаемые параметры.

11. Биологическая репликация

1. Для всех анализов проведите как минимум два независимых эксперимента с минимум двумя репликами.

Результаты

В этом исследовании оценивалась бактерицидная активность всех четырёх протестированных соединений — BAC, PAA, SAL и EUG — по E. coli CECT 434 и S. aureus CECT 976. Как показано на рисунках 1 и рисунке 2, BAC, PAA, SAL и EUG проявили очевидное влияние концентрационного влияния на культивируемость. В таблице 2 представлены значения MBC для протестируемых молекул после экспозиции и 24 часа после в...

Обсуждение

Протокол, представленный в данном исследовании, предоставляет интегрированную основу для оценки бактерицидной активности двух широко используемых биоцидов — BAC и PAA — и двух перспективных фитохимикатов — EUG и SAL — по отдельности и в комбинации (двойные и тройные комбинации) против E. coli и S. aureus. Несколько этапов в этом протоколе особенно важны для обеспечения воспроизводимости и точной интерпретации антимикробных взаимодействий. К ним относятся стандартизация бактериального ино...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Бензалконий хлорид	Merck, Испания	8.14363.0100	Биоцид
Центрифугированный Mega Star 600R	VWR, США	VWR Mega Star 600R	-
Combenefit - версия 2.021	Cancer Research UK Кембриджский институт, Кембридж, Великобритания	-	Программное обеспечение для оценки синергизма
Кюветты	VWR, Германия	VWRI634-0678	Кюветы объёмом 1,5 мл для оптической плотности
Дестилатированная вода	-	-	Для подготовки медиа
Диметилсульфоксид (DMSO)	VWR, Франция	23500.322	Органический растворитель
Одноразовые инокуляционные петли	VWR, Италия	VWRI612-9357	10 μ L-инокуляционные петли
Трубы Эппендорфа	VWR, Китай	VWRI525-1164	1,5 мл сейф-замковых трубок Эппендорфа и bbsp;
Escherichia coli	Коллекция испанской культуры (CECT)	434	Эталонный штамм, использованный в этом исследовании
Этанол	VWR, Франция	83813.36	Для распознавания произведения, материалов и рук
Эугенол 99%	Sigma-Aldrich, США	163333	Фитохимические
Трубы Falcon	VWR, США	VWRI525-1085	Трубки Falcon объемом 15 мл
Трубы Falcon	VWR, Бельгия	VWRI525-1109	Трубы Falcon объёмом 50 мл
GraphPad Prism 9.0 для Windows 11	Ла-Хойя, Калифорния, США	-	Программное обеспечение для математического и статистического анализа
Лецитин	Alfa Aesar, Германия	Q04A010	-
L-гистидин	Merck, США	1.04351.0025	-
Орбитальный инкубатор	VWR, США	VWR 5000I Инкубационный шейкер 230V	-
Переуксусная кислота 15%	AppliChem, Германия	143495-1211	Биоцид
Чашки Петри	VWR, Италия	VWRI391-0582	-
Пипетта 1 - 10 мл	VWR, США		-
Пипетты 100 - 1000 и мю; L	VWR, США		-
Кончики пипеток 100 - 1000 и мю; L	Фрилабо, Португалия	1-202-50-0	-
Pippette 20 - 200 &m; L	VWR, США		-
Наконечники пиппетт 1 - 10 мл	VWR, Бельгия	vwri613-7094	-
Кончики пиппетт 2 - 200 μ L	VWR, Мексика	vwri613-6418	-
Граф пластин Агар	VWR, Бельгия	84608-0500	Выделение и культивирование микроорганизмов
Полисорбат 80	VWR, США	20E2756726	-
Хлорид калия — KCl	VWR, Бельгия	11D110008	-
Дигидроген фосфат калия — KH2PO4	VWR, Германия	26931.263	-
Сацилицовая кислота	Sigma-Aldrich, США	84210-500G	Фитохимические
Сапонины	VWR, Германия	21A124103	-
Хлорид натрия — NaCl	VWR, Бельгия	27788.297	-
Натрий-водород-фосфат — Na2HPO4	VWR, Бельгия	28026.26	-
Тиосульфат натрия — Na2S2O3	VWR, США	18D2056589	-
Спектрофотометр	VWR, США	Спектрофотометр UV-1600PC	Корректировка оптической плотности
Staphylococcus aureus	Коллекция испанской культуры (CECT)	976	Эталонный штамм, использованный в этом исследовании
Триптический соевый бульон	Merck, Германия	1.05459.0500	Выделение и культивирование микроорганизмов
Ультрачистая вода	-	-	Для подготовки образцов