Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Проволочная миография для спинной аорты и мезентериальных резистентных артерий у мышей и крыс

595 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70186

⸱

27 февраля 2026 г.

 ,  ,  , 
1Department of Physiology and Pharmacology, Center for Hypertension and Personalized Medicine, University of Toledo, College of Medicine and Life Sciences

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Мы предлагаем подробный протокол для миографии проволоки бок о бок для оценки сосудистой реактивности в артериях с кондуитом и резистентностью, выделенных у мышей и крыс.

Аннотация

Проволочная миография — это широко используемая техника ex vivo для количественной оценки сосудистой функции изолированных артерий. Поскольку крупные каналы и малые резистентные артерии принципиально различаются по структуре и физиологической роли, анализ обоих классов сосудов параллельно с использованием артерий, взятых у одной мыши или крысы, позволяет проводить парные сравнения, которые снижают изменчивость между животными и выявляют функциональные изменения, специфичные для сосудов. В этой статье представлен пошаговый протокол оценки сосудистой реактивности в изолированных мышиных каналах и резистентных артериях с использованием изометрической проволочной миографии. Мы описываем приготовление свежего, насыщенного кислородом физиологического буфера; тщательное вскрытие, очистку и монтаж артериальных сегментов; и нормализация для установки сосудов близко к оптимальной длине для генерации активной силы. Предоставлены руководство по устранению неполадок и пример экспериментальной последовательности для генерации кривых накопления концентрации и отклика стандартных вазоконстрикторов и вазодилататоров. Этот протокол позволяет количественно измерять функцию как эндотелиальных, так и гладких мускулатур, а также облегчает выявление сосудистых изменений сосудистой реактивности, связанных с сосудистыми заболеваниями, такими как гипертония.

Введение

Гипертония характеризуется изменённой сосудистой реактивностью, такой как дисфункция эндотелиума и гиперреактивность сосудов гладкой мышцы на вазоконстрикторы1. Эти функциональные изменения, вместе с микрососудистой ремоделированием и разредкой, способствуют нарушению перфузии тканей и дисрегулированному артериальномудавлению 2,3,4. Экс-виво анализы изолированных сосудов являются мощным инструментом для анализа клеточных и молекулярных механизмов, контролирующих сосудистый тонус при здоровье и заболеваниях, поскольку они позволяют точно контролировать сосудистую микросреду и селективно манипулировать гладкими мышцами и эндотелиальными сигнальными путями.

Сосудистая реактивность в изолированных артериях обычно оценивается с помощью двух комплементарных ex vivo методов: проволочной миографии и давлениямиографии 5,6. В проволочной миографии кольца или сегменты сосудов устанавливаются на штифты или провода, а изометрическая сила фиксируется 7,8. В миографии давления целостные сегменты сосуда канюляются и нагружаются под давление до определённого внутрилюминального давления, а диаметр сосуда отслеживается с помощьювидеомикроскопии 9. В отличие от проволочной миографии, миография давления позволяет контролировать трансмуральное давление и внутрилюминальный поток. Таким образом, он более точно воспроизводит in vivo гемодинамическую среду резистентных артерий и часто используется для изучения миогенного тонуса, потоковых реакций и сосудистых структурных или механических свойств 9,10. Напротив, проводная миография технически проще в реализации (без канюляции или видеомикроскопии), поддерживает большую пропускную способность при использовании коммерческих многокамерных систем и хорошо подходит для создания воспроизводимых фармакологических кривых концентрационного отклика в малых и средних артериях диаметром порядка от десятков до нескольких сотенмикрометров (5,6).. Соответственно, проволочная миография часто предпочитается для фармакологического профилирования сосудистой реактивности в трубопроводах и резистентных артериях, изолированных от мышей или крыс.

Кондуитные (крупные эластичные) и резистентные (малые мышечные) артерии принципиально различаются по структуре и функциям, и эти различия определяют различные экспериментальные аспекты и конечные показатели. Проводные артерии (например, нисходящая грудная аорта) содержат большое количество эластичной ткани и значительную гладкую мышечную массу; Резистентные артерии (например, брыжейки) имеют относительно большее соотношение гладких мышц к просвету и являются основными факторами, определяющими периферическое сопротивление и локальнуюауторегуляцию 11,12. Поскольку один и тот же агонист может активировать разные молекулярные реакции в этих сосудистых слоях, сравнение сосудов трубопровода и резистентности у одного и того же животного даёт полезную дополнительную информацию. Например, в кондуктных артериях выделение оксида азота, полученного из эндотелия, является основным релаксантным путём, по которому ацетилхолин (ACh) индуцируетвазорелаксацию 13,14. В отличие от этого, в малых резистентных артериях ACh индуцирует релаксацию с помощью оксида азота, простациклина и, что важно, гиперполяризующих факторов эндотелия (EDHF)15,16. Соответственно, боковая миография артерий каналов и резистентности, взятых у одной мыши или крысы, позволяет проводить парные сравнения, облегчающие обнаружение функциональных изменений, специфичных для сосудов, при этом снижая изменчивость между животными.

Точная интерпретация данных проволочной миографии зависит от внимательного внимания к набору технических переменных: составу и оксигенации физиологического соляного раствора (ПСС), обработке тканей и вскрытию, технике монтажа, оптимальной претензии в состоянии покоя (нормализация), температуре ванны и выборе соответствующих фармакологическихконтролей 6. Нормализация — это техническая процедура установления механической рабочей точки судна с целью оптимизации развития активной силы и приближения к физиологическим условиямработы 5. На практике, для аортальных колец обычно используют фиксированную претензию, часто определяемую эмпирически, чтобы избежать чрезмерного растяжения и при этом обеспечивать стабильные реакции. Для артерий с малым сопротивлением нормализация проводится путем определения внутренней окружности, соответствующей эквивалентному трансмуральному давлению 100 мм рт. ст. (IC100). Затем сосуд устанавливается на определённую долю этого значения для формирования нормированной внутренней окружности (IC1). На практике многие протоколы устанавливают IC1 около 0,9× IC 100 для MRA крыс и около 1,0× IC 100 для MRA мышей, хотя эти значения могут корректироваться в зависимости от типа сосуда, вида и экспериментальныхцелей 5,17.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Следующий протокол соответствует установленным рекомендациям и был одобрен Комитетом по уходу за животными на кампусе Health Science Университета Толедо.

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ Перед началом, пожалуйста, всегда соблюдайте рекомендации Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) и Институционального комитета по биобезопасности (IBC); использование соответствующих средств индивидуальной защиты (СИЗ); осторожность при использовании хирургических или других острых инструментов; консультироваться и соблюдать соответствующие Сертификаты безопасности (SDS) при обращении с химикатами и биологическими тканями; обрабатывать карбоген как газовый баллон под давлением с использованием одобренных регуляторов и безопасного хранения; и утилизировать биологические и химические отходы в соответствии с институциональными процедурами.

1. Подготовка буфера PSS/модифицированного бикарбоната Кребса (Кребса)

ПРИМЕЧАНИЕ: Состав буфера Кребса (конечные концентрации, pH 7,4): 130 мМ NaCl, 4,7 мМ KCl, 1,17 мМ MgSO4, 1,18 мМ KH2PO4, 1,6 мМ CaCl2, 25 мМNaHCO 3, 5,5 мМ глюкозы и 0,03 мМ EDTA.

  1. Приготовьте бульон большого объёма: растворите все компоненты, кромеNaHCO 3, глюкозы иCaCl2 , в двойной дистиллированной воде для получения бульона. Храните этот бульон при 4 °C.
  2. В день эксперимента аликвотируйте необходимый объём запаса (например, 1 л), последовательно добавляйтеNaHCO 3, глюкозу иCaCl2, и непрерывно насыщайте кислородом углеводами (95%O2/5%CO2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы минимизировать осадки кальциевой соли, приготовьте и храните бульонCaCl2 объемом 1 М при 4 °C и медленно добавляйте необходимый объём в буфер только после полного растворенияNaHCO 3 , при непрерывном помешивании. Поддерживайте пузырьки карбогена во время добавленияCaCl2 (см. шаг 1.3), чтобы уменьшить образование карбоната кальция. Если наблюдаются осадки, сбросьте и подготовьте свежий буфер.
  3. Для равновесия pH пузырьте буфер карбогеном минимум на 20 минут, затем измерьте pH и при необходимости отрегулируйте pH до 7,4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Типичный pH предпузырьков ≈ 7,7; непрерывное пузырьканье снижает pH до физиологического ≈7,4.
  4. Подготовьте камеры для миографа, наполнив их свежеприготовленным буфером Кребса, и начните мягкое пузырьканье с карбогеном. Отрегулировать скорость пузырьков для обеспечения достаточного газообмена без сильного перемешивания.
  5. Зарезервируйте аликвот свежеприготовленного, насыщенного кислородом буфера Кребса и охладите его на льду для вскрытия тканей. Прогрейте оставшийся оксигенный буфер до 37 °C (с непрерывным бульканием карбогена) для использования во время экспериментов.

2. Диссекция нисходящей грудной аорты и брыжейной аркады

  1. Усыпить животное согласно рекомендациям IACUC. Стандартизировать время эвтаназии животных и извлечения тканей в течение 2 часов, чтобы минимизировать возможные циркадные эффекты.
  2. Немедленно откройте грудную и брюшную полости через средний разрез и отражайте грудную стенку вбок, чтобы обнажить сердце и большие сосуды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не проводите системную перфузию в стандартных условиях, так как это может случайно привести к повреждению эндотелия. Кроме того, задержанная кровь в брыжейных сосудах усиливает визуальную дискриминацию между артериями и венами и облегчает оценку целостности артерий. Однако в некоторых патологических моделях (например, тромботические расстройства) может быть рекомендована мягкая, низконапорная перфузия с гепаринизированным, ледяным физиологическим буфером для устранения закупорующих тромбов и минимизации повреждения эндотелия.
  3. Исключите нисходящую грудную аорту. Для облегчения вскрытия удалите лёгкие и пищевод, чтобы улучшить визуализацию. Не хватайте напрямую нисходящую грудную аорту; Вместо этого аккуратно держите дугу аорты или периадвентициальный жир, немного поднимите и аккуратно перерезайте межреберные ветви сосудов снизу аорты. Удалите нисходящую грудную аорту, разрезав непосредственно перед тем, как она пройдёт через диафрагму, и поместите её в чашку Петри, покрытую Сильгардом, содержащую ледяной кислород буфер Кребса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте холодную температуру, чтобы минимизировать спонтанный тон и сохранить жизнеспособность. Чёрный Сильгард увеличивает контраст при вскрытии сосудов.
  4. Исключите весь брижейный аркадный зал. Аккуратно поднимите мезентериальную аркаду, чтобы найти верхнюю брыжейку артерию, которая ветвится от хвостовой брюшной аорты к диафрагме. Перерезать верхнюю брыжейную артерию проксимально и освободить мезентериальную аркаду от окружающей соединительной ткани без прямых манипуляций сосудами. Разместите брыжейную аркаду в отдельную чашу Петри, покрытую Сильгардом, содержащую ледяной кислород буфер Кребса.

3. Изоляция и монтаж аортальных колец на штифтовых миографах

  1. Закрепите проксимальные и дистальные концы нисходящей грудной аорты диссекционными штифтами для выпрямления сосуда. Избегайте чрезмерного растяжения, чтобы избежать механических повреждений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вставьте штифты в периадвентициальный жир, а не через стенку сосуда, чтобы минимизировать повреждения.
  2. Под стереомикроскопом с внешним источником света аккуратно удаляйте периадвентиальный жир и соединительные ткани с помощью тонких ножниц и щипцов Ванна. Избегайте повреждений стенки сосуда.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно удаляют периадвентиальный жир, если цель не в изучении роли периваскулярных адвентициальных тканей в регуляции сосудистого тонуса.
  3. Вырезать аортальные кольца толщиной 2 мм, сделав чистые, перпендикулярные разрезы. Сбрасывайте кольца, которые проколоты или заметно повреждёны. По возможности выбирайте сопоставимые места у разных животных, чтобы минимизировать вариативность.
  4. Отсоедините одну камеру с насыщенным кислородом буфером Кребса от миографического аппарата и аккуратно перенесите её в стереомикроскоп.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Толчок камеры может повлиять на работу преобразователя и повлиять на результат, поэтому аккуратно держите камеру и аккуратно опускайте её.
  5. Под стереомикроскопом используйте микрометр, чтобы соединить контакты миографа и наместить аортальное кольцо на штифты, минимизируя манипуляции с поверхностью света.
  6. Обратите внимание на показания микрометра при полностью расслабленном кольце; Немного растяните ткань, чтобы закрепить ткань для транспортировки.
  7. Подключите камеру к прибору и восстановите сосуд до исходного микрометра.
  8. После установки всех колец нагрейте камеры до 37 °C и контролируйте температуру с помощью поставляемого датчика (обычно 20-30 минут до 37 °C).
  9. Обнулите показания силы на пользовательском интерфейсе, запустите программное обеспечение для сбора данных и начните запись.
  10. Постепенно применяйте претензии к аортным колцам до сосуду фиксированного значения с помощью микрометра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Типичное значение претензии для аортальных колец мыши составляет 5 миллиньютонов (мН)5. Хотя представленные значения претензии для аортальных колец крыс различаются в разных исследованиях, предыдущая оптимизация подтверждает претензии 10 мН в этомпротоколе 18.
  11. Уравновесить аортальные кольца в течение 45-60 минут при выбранном претензии с повторными заменами буфера при 37 °C Кребса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Часто аортальные кольца частично теряют натяжение, и поэтому требуется несколько раз тонкой корректировки претензии с помощью микрометра, прежде чем натяжение стабилизируется.
  12. Занулить показания силы на пользовательском интерфейсе перед началом экспериментальных протоколов.

4. Изоляция и монтаж MRA на проволочные миографы

  1. Приколите брыжейную аркаду по часовой стрелке, чтобы выпрямить ветви брыжейки. Начните с закрепления слепой груди, затем закрепите последующие участки тонкого кишечника по часовой стрелке, чтобы мягко напрягать сосудистую массу брыжейки, не перенапрягая их. По необходимости заменяйте буфер на свежие Krebs, чтобы удалить кровь или мусор.
  2. Определите верхнюю брыжейку в центре антенны, где расходятся аркады.
  3. Выберите подходящую MRA для изоляции; Типичные цели: внутренний диаметр 200–250 мкм (определяется позже при нормализации).
    ПРИМЕЧАНИЕ: У взрослых экспериментальных животных это обычно соответствует двум ветвямтретьего порядка у мышей и трём ветвямтретьего–четвёртого порядка у крыс. Порядок ветвей определяется последовательными бифуркациями от верхней брыжейковой артерии. 1 ветви 1-го порядка берут начало непосредственно из верхней брыжейковой артерии, две ветвитретьего порядка — из 1-го порядка ветвей и так далее.
  4. Под стереомикроскопом вскрытие сопутствующей вены и удаление периадвентициального жира и соединительной ткани с помощью ножниц Ванны и тонких щипцов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: МРА можно отличить от вен по их толстым стенкам и меньшим просвете, которые легко визуализируются по наличию остаточной внутрилюминальной крови.
  5. Расслабьте ближайшие кишечные штифты, которые растягивают стенку кишечника рядом с выбранным сосудом, прежде чем вырезать артерию, чтобы предотвратить отдачу сосуда.
  6. Вырезать всю длину выбранного МРА (должно быть >2 мм), сделав чистые, перпендикулярные разрезы. Используя тонкие щипцы, захватите один конец артерии и переложите его в чистую чашку Петри с ледяным буфером Кребса (обычные посуды без покрытия Sylgard способствуют последующей установке). Осмотреть артерию на наличие повреждений; Наличие внутрилюминальной плазмы облегчает визуальную оценку целостности.
  7. Вырезать примерно 2 мм сегмента из неповреждённой области. Убрать все зоны, которые были обработаны во время транспортировки или показаны видимые повреждения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование прозрачных блюд без покрытия Sylgard позволяет разместить линейку под блюдом для точного измерения длины сосуда.
  8. Подготовьте две проволоки длиной 2,5 см из нержавеющей стали 40 мкм для крепления.
  9. С помощью тонких щипцев аккуратно протяните провода по одному через люмен, чтобы с обоих концов было достаточно проволоки для крепления. Минимизировать эндотелиальную травму. После вставки обоих проводов запишите точную длину линейкой для использования в процедуре нормализации (см. шаг 5.2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это один из самых технически сложных и трудоёмких этапов протокола, требующий терпения и повторяющихся практик для минимизации повреждения эндотелия. После вставки первого провода часто проще зажать оба провода вместе и продвинуть их через сосуд.
  10. Отсоедините одну камеру с насыщенным кислородом буфером Кребса от миографического аппарата и аккуратно перенесите её в стереомикроскоп.
  11. Под стереомикроскопом переведите MRA (провода с обоих концов) в камеру миографа. С помощью микрометра соедините миографические челюсти, чтобы зажать концы провода между челюстями, чтобы артерия свободно подвешивала между ними.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе рекомендуется зажимать провода так, чтобы они лежали друг на друге. Это закрепляет провода на месте и предотвращает их скручивание.
  12. Закрепите верхний провод под крепящими винтами с близкой к микрометровой стороне, обмотая концы по часовой стрелке; Повторяйте со вторым проводом на стороне преобразователя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно, но твёрдо затяните винты. Если винты слишком ослаблены, сосуд может соскользнуть; Если сильно затянуть, провод или преобразователь могут быть повреждены. После закрепления первого конца немного откройте зазор между челюстями миографа, а затем закрепите противоположный конец для равномерного натяжения проволоки.
  13. Немного разведите челюсти и выровняйте провода так, чтобы они лежали параллельно и в копланарном положении, почти соприкасаясь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все настройки проводов вдали от установленного судна, чтобы минимизировать повреждения.
  14. Повторяйте монтаж для всех MRA.
  15. Нагревающие камеры до 37 °C и мониторинг температуры (обычно 20-30 минут).
  16. Обнулите показания силы на пользовательском интерфейсе перед началом процедуры нормализации.

5. Процедура нормализации для MRA

ПРИМЕЧАНИЕ: Аортальные кольца крепятся с фиксированной, заранее определённой претензией. Поэтому отдельный шаг нормализации не выполняется.

  1. Задайте параметры нормализации в программном обеспечении для сбора данных: калибровка окуляра = 1; целевое давление = 13,3 кПа ( ≈ 100 мм рт.ст.); нормализованная внутренняя окружность (IC1) = 0,9 для MRA у крыс и 1,0 для мышиных MRA; среднее время = 2 с; задержка = 60 с.
  2. Введём параметры, специфичные для сосуда, в модуль нормализации следующим образом:
    1. Для концевых точек ткани (мм): установить a1 = 0 и a2 = измеренная длина МРА в миллиметрах (точная длина, зафиксированная во время удаления).
    2. Введите диаметр провода: 40 мкм.
    3. Показания микрометра: введите базовое значение микрометра, зафиксированное при установке сосуда и полностью расслабленном состоянии.
  3. Начинайте процедуру нормализации, поэтапно растягивая установленный MRA на шаги по 50 мкм. После каждой растяжки вводите новые показания микрометра в модуль нормализации и ждите 60 секунд между шагами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Резкое падение натяжения после микрометровой регулировки обычно указывает на проскальжение сосуда. Крепящие винты следует аккуратно, но надёжно затянуть.
  4. Дождитесь, пока нормализационный модуль отобразит натяжение стенок покоя (mN/mm) и внутреннюю окружность (μm) и подгонит экспоненциальную кривую. Используя микрометр, продолжайте поэтапное растяжение до тех пор, пока кривая натяжения-окружности не пересечется с изобаром 100 мм рт. ст. При близости к перекрёстку уменьшайте размер ступени до 10-30 мкм, чтобы избежать чрезмерного растяжения судна.
  5. Когда кривая пересекает изобар 100 мм рт. ст., обратите внимание на программное обеспечение внутренней окружности и установите микрометр на соответствующее значение, вычисленное модулем, чтобы подготовка находилась на целевой нормированной внутренней окружности (IC₁).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Неправильная подгонка кривой обычно указывает на неправильные параметры, введённые в программное обеспечение, такие как длина ткани, диаметр провода или показания микрометра.
  6. Повторите процедуру нормализации для всех установленных MRA, затем дайте судам уравновеситься на 30-45 минут с повторными заменами буфера при использовании 37 °C Кребс.
  7. Нуль показаний силы на пользовательском интерфейсе непосредственно перед началом экспериментов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ключевые различия параметров между мышами и крысами изложены в таблице 1.
ПараметрМышьКрыса
Значение претензии для аортальных колец5 мН10 мН
Целевой коэффициент IC1 для MRA10.9
Типичный заказ ветви MRA для внутреннего диаметра 200–250 мкм2-й3-4-й

Таблица 1: Ключевые различия параметров между мышами и крысами.

6. Экспериментальный протокол (примерная последовательность)

  1. Проверка жизнеспособности: вызов сократительной реакции с деполяризующим вызовом с высоким уровнем K⁺ (например, 120 мМ KCl).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер с высоким уровнем K⁺ (KPSS) готовится путем эквимолярной замещения NaCl на KCl из стандартного буфера Кребса для поддержания осмолярности и постоянно насыщается кислородом с 95%O2/5%CO2. Чтобы избежать холодного шока, нагрейте KPSS до 37 °C перед использованием. Состав буфера KPSS (конечные концентрации, pH 7,4): 120 мМ KCl, 14,7 мМ NaCl, 1,17 мМMgSO 4, 1,18 мМ KH2PO₄, 1,6 мМ CaCl2, 25 мМNaHCO 3, 5,5 мМ глюкозы и 0,03 мМ EDTA.
  2. Проведите как минимум три последовательных промывки свежим оксигенированным буфером Кребса при температуре 37 °C до восстановления стабильного пассивного базального напряжения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы промывки выполняются путём полного удаления раствора для купания и замены его свежим буфером Krebs с насыщенным кислородом 37 °C. Коммерческие миографы обычно имеют встроенную функцию промывки, которая дренирует миографические камеры.
  3. Сгенерировать кривую накопленного отклика концентрации и отклика (CRC) к фенилэфрину (PE), добавляя увеличивающиеся концентрации (например, диапазон от 10⁻9 до 10⁻4 M). Дайте каждой концентрации заплато, прежде чем добавить следующую, пока не будет достигнуто стабильного максимального плато.
  4. Проведите как минимум три последовательных промывки свежим оксигенированным буфером Кребса при температуре 37 °C до восстановления стабильного пассивного базального напряжения.
  5. Оценить функцию эндотелия: предварительное сужение с субмаксимальной концентрацией ПЭ, дать реакции стабилизироваться, а затем оценить эндотелийно-зависимую релаксацию с помощью ACh (например, диапазон от 10⁻⁹ до 10⁻⁵ M). Дайте каждой концентрации выстоять перед добавлением следующей до достижения стабильного максимального релаксации. Рекордный процент релаксации относительно предварительно суженного тона (см. шаг 7.4). Препараты с расслаблением <70% исключаются.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Заболевания сосудистых стенок, такие как гипертония, часто связаны с эндотелиальной дисфункцией, что часто приводит к нарушению эндотелиево-зависимого вазорелаксационного ответа наACh 19. В таких условиях препараты с релаксацией <70 % не следует исключать автоматически, так как это может свидетельствовать о настоящей болезненной эндотелиальной дисфункции, а не о техническом сбое.
  6. Проведите как минимум три последовательных промывки свежим оксигенированным буфером Кребса при температуре 37 °C до восстановления стабильного пассивного базального напряжения.
  7. Проверьте другие вазоактивные агенты с и без специфических для пути ингибиторов, как требует экспериментальный вопрос.
  8. В конце эксперимента снимите все установленные сосуды, очистите все камеры 8% уксусной кислотой, затем трижды промывайте водой и, наконец, выключите бензобак и машину.
  9. Утилизировать биологические и химические отходы в соответствии с институциональными процедурами.

7. Анализ данных и отчетность

  1. Базовое определение и запись. Запишите базовое напряжение непосредственно перед началом любого вызова с вазоконстриктором (например, вызов с высоким K⁺, CRC с вазоконстриктором или предконстрикция перед вазодилататорным CRC).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для дальнейшего анализа практически проще обнулить показания силы на пользовательском интерфейсе после достаточной промывки любой предыдущей стимуляции, непосредственно перед началом любого испытания с вазоконстриктором (то есть показан базовый натяжение = 0).
  2. Вызов High-K⁺. Вычислите активную силу как: активная сила = максимальный тон после KCl — базовое напряжение (единицы: мН). Выражать активную силу, нормализованную либо до единицы длины (мН/мм), либо площади сечения (мН/мм 2) установленного артериального сегмента. Измерение площади поперечного сечения требует последующей гистологической анализировки установленных сегментов артерии для определения толщины стенок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку аортальные кольца часто вызывают неплатообразующий ответ, измерьте максимальный высокий отклик K⁺ в заранее определённое время (например, 10 минут) по всем препаратам, чтобы минимизировать вариабельность. В МРА максимальная реакция с высоким K⁺ обычно достигается в течение нескольких секунд после стимуляции.
  3. Сократительные CRC . Для каждой концентрации в сокращающем кумулятивном CRC (например, PE) вычислите активную силу следующим образом. Выражайте активную силу при каждой концентрации в процентах от ответа, вызванного вызовом с высоким K⁺. Используйте эти процентные значения для установки сократительных CRC (см. шаг 7.5).
    Активная сила = Максимальный тон после применения препарата - Базовое напряжение (единицы: мН)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Определённые состояния могут вызывать вариабельность максимальных высокок-K⁺ ответов между препаратами (например, изменения гладкой мускулатуры или состояние дифференцировки, вызванные патологией). В таких условиях выражайте активную силу при каждой концентрации, нормализированную либо до единицы длины (мН/мм), либо к площади поперечного сечения (мН/мм 2) установленного артериального сегмента.
  4. Релаксанты CRC. Для релаксационных CRC после субмаксимальной предсужения (предсуждающего тона) вычислите процентную релаксацию при каждой концентрации следующим образом. Используйте эти процентные значения для подгонки релаксационных CRC (см. шаг 7.5).
    Релаксация = (тон предсужения — тон после применения препарата) / (тон предсужения — базовое напряжение) × 100.
  5. Подгонка по кривой. Для сокращения или релаксантных кумулятивных CRC график [концентрация агониста] по оси x против нормализованного ответа по оси y. Подгонить начертанную кривую с четырёхпараметрической логистической моделью с использованием нелинейной регрессии. Выделите Emax (максимальный эффект) и pEC50 (−logEC50) для статистических сравнений, где EC50 — концентрация агониста, дающая 50% отE max.
  6. Презентация данных: Представьте нормализованные КРК. Для каждой точки данных на кривой используйте групповое среднее ± стандартную ошибку среднего (SEM) или стандартное отклонение (SD). Включайте репрезентативные исходные следы и предоставляйте таблицу параметров, суммирующую значения Emax и pEC50 (средние ± SEM или SD).
  7. Статистический анализ:
    1. Сравните CRC между экспериментальными группами с использованием двухнаправленного повторяющего анализа дисперсии (ANOVA) с соответствующим пост-хок тестом (например, Бонферрони). Однако проверять предположения (сферичность, нормальность) и использовать альтернативные подходы (например, смешанные эффекты), если данные отсутствуют или несбалансированы.
    2. Сравните pEC50 иE max между двумя экспериментальными группами с помощью непарного t-теста или одностороннего ANOVA при сравнении более двух экспериментальных групп. Альтернативно, при нарушении предположений о однородности дисперсии и нормальности используют непараметрические тесты. Установите статистическую значимость на p < 0,05.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Схема, изображающая общий рабочий процесс миографии проволоки в артериях с трубопроводом и сопротивлением, изолированных от мышей или крыс, показана на рисунке 1. Репрезентативные изображения изоляции и монтажа грудного аортального кольца мыши и МРА2-го порядка показаны соответственно на рисунках 2 и 3. Программные скриншоты с процедурами претензии и нормализации с использованием кольца а...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Проволочная миография остаётся мощным, высокоразрешающим подходом для изучения сосудистой функции ex vivo. При тщательном выполнении этот метод обеспечивает надёжные количественные показатели, решающие разные биологические вопросы, позволяя при этом строго сравнивать макро- и микрососудистые слои внутри одного животного. Исследования кондукторных артерий показывают изменения в глобальной механике артерий и реактивности крупных сосудов, связанные с давлением импульса и жесткостью...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликтов интересов, которые нужно раскрывать.

Благодарности

Работа была поддержана премией NHLBI (R00 HL153896 в I.O.) и стартовыми финансами от Университета Толедо.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Конические центрифугные трубки объёмом 15 млТермо Фишер Сайентифик14-959-70C
Конические центрифугные трубки объёмом 50 млТермо Фишер Сайентифик14-959-49A
Уксусная кислотаТермо Фишер СайентификA490-212
АцетилхолинМиллипор СигмаA6625-100G
Аналитический балансМеттлер ТоледоMX304
CaCl2Термо Фишер СайентификC79-500
Карбоген (95% O2/5% CO2)AirgasCD USP50
Микроскоп для диссекции ZEISSZEISS Stemi 305
Диссекция чашки ПетриИнструментация живых системDD-90-S-BLK
Дисекционные штифтыДатская технология Myo400626
Набор инструментов для вскрытияДатская технология Myo101017Набор состоит из ножниц для вскрытия (1), многофункциональных ножниц (1), чашек Петри (5), щипцев (3) и штифтов для вскрытия.
Dumont #5 - Тонкие щипцыТонкие научные инструменты11254-20
EDTAТермо Фишер СайентификBP2482-500
Морозильник (-20 и градусов; C)Термо Фишер СайентификTSG2325FA
Морозильные петляные коробкиUSA Scientific2310-5848
Перчатки (большие)Термо Фишер Сайентифик19-041-171D
Перчатки (средняя величина)Термо Фишер Сайентифик19-041-171C
Перчатки (малые)Термо Фишер Сайентифик19-041-171B
ГлюкозаТермо Фишер СайентификD16-500
Градуированный цилиндрТермо Фишер Сайентифик08-572G
GraphPad PrismПрограммное обеспечение GraphPadН/ДАнализ данных и графическое представление
Раствор соляной кислотыТермо Фишер СайентификSA48-1
Ледяное ведроТермо Фишер Сайентифик03-395-156
KClТермо Фишер СайентификP217-500
KH2PO4Термо Фишер СайентификP380-500
Программное обеспечение LabChart 8AD InstrumentsН/ДПрограммное обеспечение для сбора данных
Лабораторный холодильникТермо Фишер СайентификFBG49RPGA
Светодиодный источник светаТермо Фишер СайентификAMPSILED21
Магнитная мешалкаТермо Фишер СайентификFB30786159
Магнитные перемешивающие стержни (большие)Термо Фишер Сайентифик14-513-68
Магнитные перемешивающие стержни (средний формат)Термо Фишер Сайентифик14-513-61
MgSO4Термо Фишер СайентификM63-500
Набор для отбора проб из микроложки и лопаткиТермо Фишер СайентификS43322
Микроцентрифугальные трубкиUSA Scientific1615-5510
Мини-микроцентрифугаТермо Фишер Сайентифик07-203-954
Мини-отвёрткаТермо Фишер СайентификNC1349489
Многопроводная миографическая системаДатская технология MyoDMT 620M
NaCl Термо Фишер СайентификS271-3
NaHCO3Термо Фишер СайентификS233-500
pH-метрТермо Фишер Сайентифик01-912-351Включает pH-метр, датчик LE420, QuickGuide по установке и стартовый пакет pH-буфера
Фенилэфрин Миллипор СигмаP6126-5G
Контроллер пипетыТермо Фишер Сайентифик01-001-023
Наконечники пипетт в стойках (10 и микро; L)USA Scientific1111-3810
Наконечники пипетт в стойках (1000 и микро; L)USA Scientific1111-2830
Кончики пипетт в стойках (200 и микро; L)USA Scientific1111-1810
Многоразовые бутылки для хранения носителей PYREXТермо Фишер Сайентифик06-414-1D
Серологические пипетки (10 мл)Термо Фишер Сайентифик02-923-204
Серологические пипетки (25 мл)Термо Фишер Сайентифик02-923-205
Одноканальная микропипетка, мультипакетТермо Фишер Сайентифик13-684-2503x пипеток (0,5-10 и мю; L, 10-100 &m; L, 100-1000 &m; L)
Проволока из нержавеющей стали (40 & mu; m)Датская технология Myo400447
ТаймерТермо Фишер Сайентифик02-261-840
Система ультрачистой водыСарториусH2O-MM-UV-SET-US
Весенние ножницы ВаннасТонкие научные инструменты15000-00
Объёмная колбаТермо Фишер Сайентифик13-756-400
Вихревой миксерТермо Фишер Сайентифик10-320-807
Водяная баняТермо Фишер Сайентифик07-202-155
Взвешивание тарелокТермо Фишер Сайентифик02-202-101

Ссылки

  1. De Oliveira, M. G., Nadruz, W. Jr, Mónica, F. Z. Endothelial and vascular smooth muscle dysfunction in hypertension. Biochem Pharmacol. 205, 115263(2022).
  2. Gallo, G., Volpe, M., Savoia, C. Endothelial dysfunction in hypertension: current concepts and clinical implications. Front Med. 8, (2022).
  3. Touyz, R. M., et al. Vascular smooth muscle contraction in hypertension. Cardiovasc Res. 114 (4), 529-539 (2018).
  4. Serné, E. H., de Jongh, R. T., Eringa, E. C., Ijzerman, R. G., Stehouwer, C. D. A. Microvascular dysfunction. Hypertension. 50 (1), 204-211 (2007).
  5. Wenceslau, C. F., et al. Guidelines for the measurement of vascular function and structure in isolated arteries and veins. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 321 (1), H77-H111 (2021).
  6. Del Campo, L., Ferrer, M. Wire myography to study vascular tone and vascular structure of isolated mouse arteries. Methods Mol Biol. 1339, 255-276 (2015).
  7. Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260 (5552), 617-619 (1976).
  8. Sun, J., et al. Isometric contractility measurement of the mouse mesenteric artery using wire myography. J Vis Exp. (138), e58064(2018).
  9. Halpern, W., Osol, G., Coy, G. S. Mechanical behavior of pressurized in vitro prearteriolar vessels determined with a video system. Ann Biomed Eng. 12 (5), 463-479 (1984).
  10. Jadeja, R. N., Rachakonda, V., Bagi, Z., Khurana, S. Intravital assessment of vascular function. J Vis Exp. (101), e50997(2015).
  11. Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. Structure and mechanical properties of resistance arteries in hypertension. Hypertension. 36 (3), 312-318 (2000).
  12. Lee, R. M. K. W., Dickhout, J. G., Sandow, S. L. Vascular structural and functional changes in hypertension: models, remodeling and relevance. Hypertens Res. 40 (4), 311-323 (2017).
  13. Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in arterial smooth muscle relaxation. Nature. 288 (5789), 373-376 (1980).
  14. Palmer, R. M., Ferrige, A. G., Moncada, S. Nitric oxide release accounts for endothelium-derived relaxing factor activity. Nature. 327 (6122), 524-526 (1987).
  15. Brandes, R. P., et al. An endothelium-derived hyperpolarizing factor distinct from nitric oxide and prostacyclin. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (17), 9747-9752 (2000).
  16. Garland, C. J., Hiley, C. R., Dora, K. A. EDHF: spreading the influence of the endothelium. Br J Pharmacol. 164 (3), 839-852 (2011).
  17. Mulvany, M. J., Halpern, W. Contractile properties of resistance vessels in hypertensive rats. Circ Res. 41 (1), 19-26 (1977).
  18. Grano De Oro, A., et al. Spontaneous vascular dysfunction in Dahl salt-sensitive rats without high-salt diet. Physiol Rep. 12 (14), e16165(2024).
  19. Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
  20. Mulvany, M. J. Structure and function of small arteries in hypertension. J Hypertens Suppl. 8 (7), S225-S232 (1990).
  21. Huda, K., Lawrence, D. J., Thompson, W., Lindsey, S. H., Bayer, C. L. In vivo noninvasive systemic myography in pregnant mice. Nat Commun. 14 (1), (2023).
  22. Choi, R., et al. Optimization of resting tension for wire myography in rat pulmonary arteries. Physiol Rep. 12 (1), e15911(2024).
  23. Lu, X., Kassab, G. S. Assessment of endothelial function across vessel sizes using a unified myograph. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 300 (1), H94-H100 (2011).
  24. Hou, T., Guo, Z., Gong, M. C. Circadian variations of vasoconstriction and blood pressure. Curr Opin Pharmacol. 57, 125-131 (2021).
  25. Li, T., et al. sex-dependent vascular responsiveness mediated by estrogen receptor pathways. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 306 (8), H1105-H1115 (2014).
  26. Schubert, R., Gaynullina, D., Shvetsova, A., Tarasova, O. S. Myography of isolated blood vessels. Front Physiol. 14, 1176748(2023).
  27. Ruddy, J. M., Jones, J. A., Spinale, F. G., Ikonomidis, J. S. Regional heterogeneity within the aorta. J Thorac Cardiovasc Surg. 136 (5), 1123-1130 (2008).
  28. Ameer, O. Z., et al. Regional abnormalities within the aorta in metabolic syndrome. Exp Physiol. 106 (3), 771-788 (2021).
  29. Mezhenskyi, O. R., Philyppov, I. B. Regional differences in endothelium-dependent relaxation of rat thoracic aorta. Physiol Rep. 12 (6), (2024).
  30. Zhang, L., Rong, S., Dong, H. Functional heterogeneity of endothelium-dependent vasorelaxation in mesenteric arteries. Microvasc Res. 158, 104777(2025).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Сосудистая реактивностьбрыжеечные артерииизометрическая миографиярасслоение артериифункция сосудовфункция эндотелияфункция гладких мышц

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.