Методическая статья

Рабочий процесс криоэлектронной томографии для толстых тканей, продемонстрированный на гиппокампе мышей

DOI:

10.3791/70192

⸱

27 марта 2026 г.

 ,  , 
1Cryo-EM Center, Southern University of Science & Technology, 2Interdisciplinary Center for Brain Information, the Brain Cognition and Brain Disease Institute, Shenzhen-Hong Kong Institute of Brain Science, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол стандартизирует криоэлектронную томографию (крио-ЭТ) для толстых тканей путём интеграции замораживания под высоким давлением (HPF) с методом, криогенного фокусирующего ионного пучка (крио-FIB) подъёма и дозовосимметричного параллельного набора метода, что позволяет получить равномерно тонкие ламеллы и витрифицированные образцы для воспроизводимого in situ анализа в гиппокампе мыши.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Криоэлектронная томография (крио-ЭТ) позволяет 3D-визуализировать нативную клеточную ультраструктуру, но её применение к толстым тканям ограничено отсутствием надёжной витрификация и низкопроизводительной подготовкой ламелли. Здесь представлен сквозный рабочий процесс, интегрирующий замораживание при высоком давлении (HPF; ~2100 бар; время от диссекции до замерзания ≤90 с) с использованием «вафельной» сборки с медной фольгой для предварительной разреживания тканей, крио-FIB подъёма и контролируемого истончения до ламелл 120–200 нм с компенсацией избыточного наклона. Проводящее покрытие стандартизировано (sputter-Pt 30 мА/15 с; ГИС конденсатор 0,5–1,0 мкм) для минимизации занавески. Автоматизированный, дозово-симметричный сбор данных (0°, ±3°, ±6°... до ±60–66°; размер шага 2–3°; общая доза 100–150 e⁻/Å 2) реализуется с помощью скриптов PACEtomo, при этом начальный угол наклона определяется на основе угла фрезера и ориентации образца. Обработка с помощью AreTomo 3 предоставляет функции для коррекции движения, оценки CTF, выравнивания и реконструкции WBP в почти реальном времени; IsoNet может опционально снижать анизотропию пропущенного клина. Усреднение субтомограммы (RELION 4.0) следует стратегии псевдосубтомограммы с отчетностью по разрешению, основанной на пороге FSC 0.143. Продемонстрированный на гиппокампе мышей, этот рабочий процесс регулярно даёт хорошо витрифицированные образцы и однородные ламели (целевая толщина 150 ± 40 нм), а также обеспечивает высокопроизводительный сбор по серии наклона (обычно 5–8 мин/наклон). Этот протокол предлагает воспроизводимый путь для изучения структурной биологии in situ непосредственно из сложных тканевых сред.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Криоэлектронная томография (крио-ЭТ) стала ключевым методом визуализации макромолекулярных комплексов и клеточных архитектур в их родном, гидратированномсостоянии 1,2,3,4,5. Реконструируя трёхмерные объёмы из наклонных серий проекционных изображений, крио-ET преодолевает разрыв между клеточным контекстом и почти атомарным разрешением, предлагая беспрецедентные знания в структурную биологию in situ6. Хотя рабочие процессы криоэлектронной томографии для клеточныхобразцов 7 (включая крио-FIB-утонченные клетки в суспензиях и приклеенных клетках) уже хорошо зарекомендованы, их прямое распространение на толстые, архитектурно целые ткани остаётся крайнесложным 8,9,10. Это особенно актуально для тканей с высоким содержанием воды, таких какмозг-11, где надёжная витрификация и образование электронно-прозрачных ламелл (обычно <200 нм) продолжают создавать стойкие узкие места12.

Достичь витрификация тканей сложна из-за высокого содержания воды и ограниченного теплообмена. Хотя погружение заморозки эффективно для тонких образцов (≤20 мкм)13, для большинства тканей оно не работает. Замораживание при высоком давлении (HPF) подавляет нуклеацию льда за счёт применения высокого давления, что теоретически позволяет витрификация образцов до ~200 мкм. Однако эффективность традиционного HPF часто оказывается неоптимальной для витрификация тканей. Для улучшения результатов недавние исследования применяли такие стратегии, как добавлениекриопротекторов 14 и предварительное сечение15,16 (например, с использованием вибратома) для механического уменьшения толщины образца перед замораживанием11,17. Хотя эти методы могут повысить качество витрификация, они часто предполагают длительное обращение экс виво и использование химических добавок, которые рискуют изменить естественные структуры. Для устранения этих ограничений в исследовании была модифицирована стратегия «вафельного» носителя, изначально разработанная Келли и др.18, включив критическую оптимизацию: ткань мозга физически сжимается с помощью двух отполированных медных носителей перед заморозкой, что предварительно разреждает образец и одновременно закрепляет его между пленкой сетки и медной фольгой. Такая конструкция не только способствует быстрой и равномерной витрификациям, но и значительно повышает механическую устойчивость, эффективно предотвращая разрыв сетки и потерю образцов при последующей обработке, создавая прочную основу для получения целостных, высококачественных образцов замороженной ткани.

После витрификация разбавление остаётся серьёзным барьером как для пропускной способности, так и для качества. Крио-ультрамикротомия, будучи ранней и широко распространённой методикой, позволяет проводить многочисленные фундаментальные структурные исследования in situ. Тем не менее, он часто встречает артефакты сжатия и режания, которые нарушают структурную целостность. В отличие от этого, крио-фокусированный ионный пучок (крио-FIB) фрезер21 обеспечивает превосходную точность и минимальноеискажение 7,22. Изначально крио-FIB-фрезер применялся непосредственно к витрификациям образцов на сетках для полученияламелл 23; Однако этот подход in situ в первую очередь эффективен для тонкихобразцов 24,25 (например, культивированных клеток или периферических областей тканей) и не может получить доступ к более глубоким структурам внутри толстых, массивных тканей. Для преодоления этого ограничения глубины были разработаныстратегии подъёма 26, позволяющие извлекать интересующие области (ROI) внутри образцов на конкретном месте. Последующие методологические достижения, включая серийноевыдвижение 27 и сериализированное сечение на сетке (SOLIST)28, дополнительно повысили пропускную способность, стабильность ламелляров и точность 3D-корреляционного наведения в сложных тканях. В последнее время инновации продолжают продвигать эту область, включая шестигранный метод крепления Танга и др.29, который улучшает механическую стабилизацию при подъёме и истончении металла, а также новые методы на сетке фрезера от Бенджамина С. Крикмора и др.11, обеспечивающие доступ к глубоким структурам, сохраняя при этом контекст нативной ткани. Несмотря на эти достижения, протоколы всё ещё различаются по эффективности, воспроизводимости и адаптации в разных типах тканей. Существует критический пробел в создании стандартизированного, легко воспроизводимого и широко применимого рабочего процесса, который интегрирует эти оптимизации в целостный конвейер для различных толстых тканей.

Этот пробел здесь устраняется синтезом ключевых технических деталей из устоявшихся методологий и их уточнением в обобщённый, сквозной конвейер. Этот протокол не только использует усовершенствованный метод HPF-для устойчивой витрификации, но и включает ряд оптимизированных этапов подъёма и истончения крио-FIB, таких как систематическая компенсация избыточного наклона, стандартизированное проводящее покрытие и калиброванные последовательности фрезера, которые вместе улучшают однородность ламелли, уменьшают количество артефактов (например, занавески) и повышают пропускную способность. В отличие от протоколов, адаптированных для конкретных типов клеток или моделей организмов, этот рабочий процесс разработан с универсальностью, обеспечивая универсальную структуру, адаптируемую к широкому спектру толстых, сложных тканей, включая относительно мягкие и подверженные сжатию, выходящие за рамки демонстрированного гиппокампа мыши.

Это продемонстрировано на сложной модели мышиного гиппокампа, известной своей уязвимостью к повреждениям льдом и структурной сложностью; этот интегрированный и обобщённый рабочий процесс надежно обеспечивает высококачественные ламеллы (120–200 нм) и обеспечивает эффективное наклонное последовательное захватывание (5–8 мин/серию). Это объединение лучших практик в последовательный, доступный и широко применимый протокол обеспечивает воспроизводимую структуру, снижающую технический барьер для внедрения крио-ЭТ в исследованиях толстых тканей в различных биологических и биомедицинских контекстах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры с тканями животных соответствовали требованиям SUSTech IACUC (Протокол SUSTech-JY202501019). Регенты и используемое оборудование указаны в Таблице материалов.

1. Подготовка образцов поддержки

  1. Подготовка носителей HPF (см. рисунок 1A)
    1. Получите пару медных носителей HPF толщиной 6 мм (тип B). Убедитесь, что одна из переносок имеет ровную поверхность.
    2. Смочите плоскую поверхность переноски и приступите к шлифовке. Сначала используйте наждачную бумагу с зернистостью 8000, пока исходные отметки не будут полностью удалены. Затем переходите на наждачную бумагу с зернистостью 12000 и продолжайте шлифовку, пока царапины с предыдущего этапа не будут практически устранены, что приведёт к равномерно гладкой поверхности. На рисунке 2 показаны типичные изображения поверхности носителя во время процесса шлифовки и полировки.
    3. Полировать поверхность с помощью мягкой металлографической ткани и алмазной пасты W0.5: сначала нанесите пасту на ткань, затем полируете поверхность круговым движением в течение 1–2 минут, пока не получите гладкую, хорошо отполированную поверхность. Тщательно прополосните переноску этанолом, затем используйте дистиллированную воду, чтобы удалить все абразивные остатки.
    4. Погрузите полированные носители в 1-гексадецен минимум на 4 часа (или на ночь) перед их использованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отполированные и обработанные носители можно хранить под водой в 1-гексадецен.
      ВНИМАНИЕ: 1-Гексадецен горюча и вредна при вдыхании; работать в вытяжке с СИЗ.
  2. Подготовка сетки поддержки TEM (см. рисунок 1B)
    1. Используйте медные сетки с 100-сеткой с непрерывной плёнкой Formvar/углеродной поддержки.
    2. Покрытие золотом с обеих сторон сетки с помощью распыляющего слоя: установите ток на 50 мА и покрытие каждой стороны на 120 секунд, чтобы получить слой примерно по 6 нм с каждой стороны.
  3. Подготовка медной фольги (см. рисунок 1C)
    1. Получите медную фольгу высокой чистоты толщиной 1 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Теплопроводность меди зависит от чистоты, а более низкая чистота приводит к меньшей теплопроводности. Поэтому требуется медная фольга высокой чистоты (Cu ≥ 99,9%).
    2. Пробуйте медную фольгу в диски диаметром 3 мм с помощью круглого отверстия.

2. Замерзание при высоком давлении

  1. Поместите каплю 10 мкл раствора сахарозы 10% на чистую стеклянную поверхность.
  2. Быстро вскрыть гиппокамп у только что усыпленной мыши. Вырезать мелкие кусочки ткани размером примерно 0,5–1мм 3 с помощью острого лезвия (см. рисунок 1D).
  3. Перенесите ткань на медные опорные TEM-сетки (100 сетки) внутри носителя HPF с помощью зубочистки или тонкой щётки. Используйте 2-метилбутан (изопентан), чтобы аккуратно переместить ткань на место, минимизируя механическое напряжение на сетку.
    ВНИМАНИЕ: 2-метилбутан (изопентан) чрезвычайно воспламеняющийся. Держите её в вытяжке без источников зажигания.
  4. Накройте ткань и сетку медным фольговым диском диаметром 3 мм. Завершите сборку, разместив второй носитель HPF (плоский лицом вниз) сверху, чтобы получить герметичный «вафельный» сэндвич (см. рисунок 1E).
    ПРИМЕЧАНИЕ: медная фольга выполняет критически важную механическую функцию в сборке вафельницы. Она зажимает ткань между сеткой TEM и самой фольгой. Во время сборки такая конфигурация оказывает мягкое давление, помогая сформировать более тонкий и однородный слой ткани, идеально подходящий для витрификация. Кроме того, фольга предотвращает потерю тканей при работе и помогает распределять давление при заморозке высокого давления, снижая риск разрыва решётки. После заморозки фольга также облегчает отделение носителей от витрифицированной сетки образцов. Однако такой метод подготовки может привести к механическим повреждениям сжатия и может быть неподходящим для образцов, чувствительных к артефактам, вызванным давлением. Для таких образцов следует рассмотреть альтернативные методы резки, достигающие нужной толщины без сжатия, такие как секционирование вибратома или пробивка.
  5. Немедленно начните процедуру заморозки под высоким давлением в соответствии с операционным протоколом производителя. Установите целевое давление на уровне ~2100 бар и убедитесь, что общее время от рассечения ткани до заморозки не превышает 90 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вся процедура — от вскрытия до заморозки — должна быть завершена в течение 90 секунд, чтобы минимизировать структурные изменения, связанные с длительным временем экс-виво . Диапазон толщины тканей для мозга составляет около 20–40 мкм.

3. Фрезерование и подъём FIB

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие шаги с использованием микроскопа с двумя лучами, оснащённым крио-ступенем. Поддерживайте температуру образца ниже -170 °C на протяжении всего процесса.

  1. Подготовка приёмной сетки
    1. Получите новую сетку золота на 300 мешей, которая будет служить последней приемной сеткой для процедуры подъёма.
    2. Под стереомикроскопом при комнатной температуре аккуратно обрезайте сетку в совместимое крио-FIB AutoGrid кольцо.
    3. Храните собранный AutoGrid непосредственно в сухой печи с температурой примерно 40 °C, чтобы минимизировать накопление инея перед использованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время обрезки убедитесь, что решётка лежит ровно и по центру, чтобы предотвратить изгиб или смещение.
  2. Извлечение и монтаж витрифицированной тканевой сетки
    1. При непрерывном погружении сборки в жидкий азот (LN₂) аккуратно отделяйте витрифицированную TEM-сетку (содержащую ткань и медную фольгу) от окружающих компонентов «вафельной» сборки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Медный фольгированный проставитель обычно облегчает отделение сетки от носителей.
    2. На предварительно охлажденной рабочей станции с крионагрузкой смонтировать изолированную тканевую сетку во второе кольцо крио-FIB AutoGrid под защитой LN₂.
  3. Совместная загрузка сеток на криотрансферный шаттл
    1. Загрузите обе АвтоСети в назначенные слоты криотрансферного шаттла.
    2. Ориентируйте каждую AutoGrid так, чтобы фрезерная вырезка была наружу и была вертикальной.
    3. Держите загруженный шаттл под погружением LN₂ или предварительно охлаждённым до передачи в микроскоп FIB/SEM.
  4. Локализация и проводящее покрытие в FIB/SEM
    1. После криопереноса в микроскоп перейдите к тканевой сетке с низким увеличением SEM.
    2. Нанесите проводящее и защитное покрытие на всю поверхность сетки.
      1. Покрыть поверхность сетки платиной (Pt) при 30 мА на 15 секунд.
      2. Отложить органометаллическую крышку Pt толщиной 0,5–1,0 мкм с помощью системы впрыска газа (GIS).
      3. Нанесите финальный слой Pt, покрытый sputter-покрытием, на поверхность сетки при 30 мА на 15 секунд.
        ПРИМЕЧАНИЕ: ГИС-колпачок критически важен для уменьшения количества артефактов занавесок.
  5. Изоляция и подъём тканевых блоков (см. Рисунок 3)
    1. Выбор места и ориентация
      1. Переместитесь к выбранной области интереса (ROI) на сетке тканей с помощью изображения электронного луча SEM.
      2. Ориентируйте образец для фрезера с фронтальной стороны. Типичное положение ступени установлено на 110° вращения и наклоне 7°, и это положение показывает поверхность образца под углом, подходящим для доступа к ионному пучку.
        ПРИМЕЧАНИЕ: При отсутствии флуоресцентных маркеров может применяться стратегия предварительного скрининга. Эта стратегия направлена на обнаружение целевой области ткани и исключение областей с криопротектором или другими нетканевыми компонентами. После выбора области, по-видимому, свободной от поверхностного льда, измельчите небольшую испытательную траншею с более высоким лучевым током (например, 15 нА при 30 кВ) в стандартной фронтальной ориентации и полируемые с помощью меньшого лучавого тока (например, 1 нА при 30 кВ). Переключитесь на электронный пучок для изучения поперечного сечения: ткань демонстрирует отличный контраст под электронным пучком, что особенно заметно в мембранных структурах и областях, богатых тяжёлыми элементами; В отличие от этого, криопротектор обычно демонстрирует равномерный контраст под электронным пучком. Это позволяет быстро проверить перед полной процедурой подъёма.
    2. Траншейное фрезерование для изоляции блока (рисунок 3A)
      1. Определите прямоугольную траншею вокруг блока целевой ткани с помощью ионного пучка, управляемого при напряжении 30 кВ.
      2. Начинайте фрезерование на определённом расстоянии от блока с относительно высоким током 15 нА для быстрого удаления материала.
      3. Когда стены траншеи приближаются к блоку на расстояние нескольких микрометров, уменьшите ток ионного пучка до 7 нА. Снижение тока обеспечивает более точное управление и минимизирует повреждение ионного пучка и нагрев биологического материала в интересующей области.
      4. Оставьте одну сторону блока прикреплённой к основному материалу как «язычку», чтобы временно удерживать его на месте.
    3. Опциональное подкопное фрезерование для толстых блоков (рисунок 3B)
      1. Для тканевых блоков с оценочной толщиной более 20 мкм выполните ступень подрезки с обратной стороны для окончательного подъёма.
      2. Поверните ступень (например, до -70°) и отрегулируйте наклон ступени (например, на 23°), чтобы добраться до нижней части блока.
      3. Фрезеруйте нижний контакт с помощью FIB при напряжении 30 кВ и токе 3 нА.
    4. Крепление к игле микроманипулятора (рисунок 3C)
      1. Для прикрепления образца к игле выполните последовательные фрезерные схемы поперечного сечения.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Золотой блок можно извлечь из слитка сетки с 300 сетками.
    5. Подъём тканевого блока (рисунок 3D)
      1. Отрезать оставшуюся «вкладку», соединяющую блок с объёмным образцом, с помощью FIB (30 кВ, 1 нА).
      2. Аккуратно маневрируйте иглой микроманипулятора, чтобы поднять теперь изолированный блок ткани так, чтобы он полностью освободился от траншеи и окружающей исходной сетки. Затем втяните иглу и переместите блок к приёмной сетке.
    6. Перенос блоков, сварка и повторное покрытие
      1. Наведите иглу к предварительно охлажденной сетке золотого приемника на 300 сеток.
      2. Опустите блок на выбранный квадрат сетки. Подведите блок ткани к пленке на сетке, затем поднимите блок вертикально, чтобы разорвать контакт. Измельчите срез толщиной ~3–4 мкм от блока на сетчатую пленку с помощью ионного луча (30 кВ, 1 нА) (рисунок 3E).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Если есть ледяные остатки, предварительно очистите место крепления прямоугольным узором (30 кВ, 50 пА). Убедитесь, что блок контактирует с пленкой сетки, чтобы уменьшить электростатический заряд, который может случайно сместить срез.
      3. Сварьте срез надёжно, фрезеруя с использованием узоров поперечного сечения с обеих сторон соединения (30 кВ, 30 пА) (рисунок 3F).
      4. Нанесите повторно проводящее/защитное покрытие, как описано в шаге 3.4.2 (рисунок 3G).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого этапа ГИС длительность может сокращаться в зависимости от размера блока.
    7. Истончение ламелли
      1. Поверните ступень (например, на -70°) и установите начальный наклон ступени (например, 15°) (рисунок 3H).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Держатель для сэмпла имеет предварительный наклон 45°.
      2. Определите окончательное положение ламелли в гладкой области блока ткани.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что выбранная зона свободна от загрязнения льдом.
      3. Проведите систематическое фрезерование с использованием токов ионного пучка, указанных в таблице 1. По мере приближения к целевой плоскости происходит прогресс от более высоких к меньшим токам (рисунок 3I, J). Опционально, если от ламели находится в пределах 1–2 мкм, можно прорезать траншею для снятия напряжений примерно на 1,5 мкм, чтобы предотвратить сгиб или скручиваниеламелли 30,31.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Когда оставшийся материал находится в пределах ~1 мкм от предела целевой плоскости, убирайте толщину за проход.

4. Сбор крио-ET данных

  1. После успешной подготовки ламелли аккуратно загрузите сетку в пропускательный электронный микроскоп (TEM), оснащённый криодержателем, энергетическим фильтром и программным обеспечением для томографии (например, SerialEM).
  2. Получите карту атласа всей сетки (например, рисунок 4A; типичное увеличение — 155×).
  3. Перейдите к положению ламели и получите карту монтажа (например, рисунок 4B; типичное увеличение составляет 3600× с дефокусировкой -100 мкм).
  4. Установите номинальное увеличение записи и убедитесь, что размер пикселя соответствует предполагаемому разрешению; в настоящем исследовании использовался размер пикселя 2,109 Å. Отрегулировать соответствующие параметры освещения, включая размер пятна, диаметр апертуры C2 и площадь освещения, чтобы получить оптимальную дозу для детектора прямых электронов.
  5. Настройте условия фокусировки и пробного освещения так, чтобы они соответствовали параметрам Record.
  6. Проводите сбор данных с помощью скриптовPaceTomo 32, следуя следующим следующим шагам:
    1. Заранее выберите цели на карте монтажа с помощью функции «добавить точки» в навигаторе, чтобы первая функция демонстрировала достаточный контраст.
    2. Выбирайте цели с помощью скрипта PACEtomo_selectTargets.py32, при необходимости корректируя избранную область при увеличении предварительного просмотра. Типичные области интереса показаны на рисунке 4C.
    3. Получить серию наклона с помощью дозово-симметричной схемы (например, 0°, +3°, -3°, +6°, -6°... до ±60°–66°) с шагом на 2° или 3°. Задайте параметры захвата в скрипте PACEtomo.py: угол стартового наклона определяется углом фрезера, указанным в шаге 3.7.1 (то есть 8°), при этом его знак зависит от ориентации нагрузки образца в крио-ЭМ; минимальные и максимальные углы наклона относятся к абсолютным значениям; а размер шага соответствует приросту наклона (например, 3°).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот стартовый угол наклона предназначен для горизонтального и перпендикулярного расположения ламелли к электронному пучку. Если угол фрезера неизвестен, наклоните изображение, чтобы показать ламеллю на её максимальной видимой высоте; это обеспечивает достаточно точное выравнивание.
    4. Поддерживайте кумулятивную дозу электронов 100–150 e⁻/Å2, распределённую по всем наклонам. Если есть возможность, используйте энергетический фильтр с шириной щели 10 эВ.
    5. Запустить сбор данных. Автоматизированная фокусировка и трекинг реализованы при каждом углу наклона. Типичное время набора для одной серии наклона составляет 5–8 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Руководство по устранению неисправностей приведено в Таблице 2.

5. Обработка данных

  1. Обработка коррекции движения по наклону, оценке CTF, выравнивания и реконструкции 3D-томографии с помощью AreTomo 3 33 с помощью AreTomo 333 для выполнения трёх основных этапов: (1) коррекция движения RAW-кадров, (2) оценка контрастной передачи (CTF) для каждого изображения с наклоном и (3) выравнивание полного наклонного ряда.
    1. После выравнивания реконструируйте трёхмерные (3D) томограммы с помощью алгоритма взвешенной обратной проекции. Требуемые входные данные для этого этапа включали: необработанные кадры изображений, файлы метаданных mdoc (документирующие параметры получения наклонных рядов) и заранее заданную ось вращения образца.
  2. Отсутствующая коррекция клина
    1. После реконструкции сгенерированные томограммы подвергаются коррекции отсутствующего клина с помощьюIsoNet 34.
  3. Сбор частиц и кураторство
    1. Проведите выбор частиц в EMAN 2.935 с использованием метода сопоставления шаблонов. После автоматического отбора ложноположительные результаты (то есть нецелевые или ошибочно выбранные области) были вручную исключены для обеспечения качества выбранного набора частиц.
  4. Усреднение по субтомограмме
    1. Импортируйте серию наклона и соответствующие им координаты частиц в RELION 4.0. Выполнять усреднение субтомограммы в соответствии со стандартным рабочим процессом, изложенным в документации RELION 4.0 (https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/STA_tutorial/Introduction.html), что гарантирует соблюдение установленных лучших практик воспроизводимости.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Успешное применение этого протокола позволяет получить высококачественные витрифицированные тканевые ламеллы и последующую реконструкцию томограмм, выявляющих нативную клеточную ультраструктуру. Следующие результаты, продемонстрированные на ткани гиппокампа мышей, являются показателями успешного эксперимента.

Тканевые блоки, обработанные методом замораживания под высоким давлением методом «», демонстрировали равномерный и электронно-прозрачный вид (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представленный здесь рабочий процесс устанавливает обобщённый, оптимизированный и воспроизводимый конвейер для криоэлектронной томографии нативных , толстых тканей in situ. Её основной вклад заключается не в изобретении уникальных методов, а в систематической интеграции, уточнении и детальной стандартизации всего процесса — от надёжной витрификация с использованием модифицированного метода вафельно-HPF до точно откалиброванного крио-FIB-протокола подъёма и протончения. Этот синт...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят сотрудников Крио-ЭМ-центра Южного университета науки и технологий за техническую поддержку. Этот проект поддерживался Национальным институтом инноваций в науке и технологиях (Brain Science and Brain-like Intelligence Technology – Национальный проект по науке и технологиям, грант No 2022ZD0211905) и Национальным фондом естественных наук Китая (гранты No 32200998 и No 32161133022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1-гексадеценСигма-ОлдричH2131Химия и Реагенты
2-метилпентанСигма-ОлдричM65807Химия и Реагенты
Клип-рингТермо Фишер Сайентифик1131750; 1188953Расходные материалы
Медная фольгаМеталлические материалы Фэнчэн1 и микро; m толщинойРасходные материалы
Медные поддержки TEM-сетки (100 mesh)Пекинская технологическая компания Zhongjingkeyi LtdBZ10021bРасходные материалы
Cryo-EMТермо Фишер СайентификKrios G4Оборудование  
Cryo-FIBТермо Фишер СайентификАквилос 2Оборудование  
Cryo-FIB AutogridТермо Фишер Сайентифик1205101Расходные материалы
Сетки (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh)КвантолистAltrAufoilРасходные материалы
Морозильник высокого давленияLeica MicrosystemsEM ICEОборудование  
Носитель HPF, медьLeica Microsystemsтип B (6 мм)Расходные материалы
Ионный распылительКворумQ150RS plusОборудование  
Металлографическая полировочная пастаЛабораторный тестекW0.5Расходные материалы
Полировочная тканьГОРАЛB00809Расходные материалы
Наждачная бумагаНаждачная бумага бренда Eagle8000-зернистость, 12000-зернистостьРасходные материалы
СтереомикроскопLeica MicrosystemsS9i<имя="ДИАПАЗОН! D17">Оборудование и bbsp;
СахарозаСигма-Олдрич200-334-9Химия и Реагенты
Программное обеспечение для приобретения Tilt-Serieshttps://bio3d.colorado.edu/SerialEM/SerialEM 4.0.9Программное обеспечение
Выравнивание и выравнивание наклонной серии Программное обеспечение для реконструкцииhttps://github.com/czimaginginstitute/AreTomo3 AreTomo 3Программное обеспечение
Программное обеспечение для приобретения Tilt-Serieshttps://github.com/eisfabian/PACEtomoPaceTomoПрограммное обеспечение
Выравнивание и выравнивание наклонной серии Программное обеспечение для реконструкцииhttps://github.com/IsoNet-cryoET/IsoNetIsoNetПрограммное обеспечение
Выравнивание и выравнивание наклонной серии Программное обеспечение для реконструкцииhttps://github.com/cryoem/eman2EMAN2Программное обеспечение
Выравнивание и выравнивание наклонной серии Программное обеспечение для реконструкцииhttps://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/index.htmlRelion 4Программное обеспечение

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Young, L. N., Villa, E. Bringing structure to cell biology with cryo-electron tomography. Annu Rev Biophys. 52 (1), 573-595 (2023).
  2. Baumeister, W. Cryo-electron tomography: A long journey to the inner space of cells. Cell. 185 (15), 2649-2652 (2022).
  3. Hong, Y., Song, Y., Zhang, Z., Li, S. Cryo-electron tomography: The resolution revolution and a surge of in situ virological discoveries. Annu Rev Biophys. 52 (1), 339-360 (2023).
  4. Nogales, E., Mahamid, J. Bridging structural and cell biology with cryo-electron microscopy. Nature. 628 (8006), 47-56 (2024).
  5. Schur, F. K. M. Toward high-resolution in situ structural biology with cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Curr Opin Struct Biol. 58, 1-9 (2019).
  6. Briggs, J. A. G. Structural biology in situ—the potential of subtomogram averaging. Curr Opin Struct Biol. 23 (2), 261-267 (2013).
  7. Berger, C., et al. Cryo-electron tomography on focused ion beam lamellae transforms structural cell biology. Nat Methods. 20 (4), 499-511 (2023).
  8. McCafferty, C. L., et al. Integrating cellular electron microscopy with multimodal data to explore biology across space and time. Cell. 187 (3), 563-584 (2024).
  9. Pöge, M., et al. Making plant tissue accessible for cryo-electron tomography. Elife. 106455, 1-41 (2025).
  10. Bäuerlein, F. J. B., et al. Cryo-electron tomography of large biological specimens vitrified by plunge freezing. Preprint. bioRxiv. , (2023).
  11. Creekmore, B. C., Kixmoeller, K., Black, B. E., Lee, E. B., Chang, Y. -W. Ultrastructure of human brain tissue vitrified from autopsy revealed by cryo-ET with cryo-plasma fib milling. Nat Commun. 15 (1), 2660(2024).
  12. Chen, Z., Guo, Q. Innovations in cryo-electron tomography for tissues: Challenges and future prospects. Curr Opin Struct Biol. 93, 103112(2025).
  13. Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Q Rev Biophys. 21 (2), 129-228 (2009).
  14. Matsui, A., et al. Cryo-electron tomographic investigation of native hippocampal glutamatergic synapses. Elife. 13, RP98458(2024).
  15. Ning, J., et al. Uncovering synaptic and cellular nanoarchitecture of brain tissue via seamless in situ trimming and milling for cryo-electron tomography. Preprint. bioRxiv. , (2025).
  16. Zhang, J., et al. Vhut-cryo-fib, a method to fabricate frozen hydrated lamellae from tissue specimens for in situ cryo-electron tomography. J Struct Biol. 213 (3), 107763(2021).
  17. Glynn, C., et al. A generalizable and targeted molecular biopsy approach for in situ cryogenic electron tomography of vitreous brain tissue. Cell Rep Methods. 5 (7), 101080(2025).
  18. Kelley, K., et al. Waffle method: A general and flexible approach for improving throughput in fib-milling. Nat Commun. 13 (1), 1857(2022).
  19. Pierson, J., Ziese, U., Sani, M., Peters, P. J. Exploring vitreous cryo-section-induced compression at the macromolecular level using electron cryo-tomography; 80s yeast ribosomes appear unaffected. J Struct Biol. 173 (2), 345-349 (2011).
  20. Alamoudi, A., Studer, D., Dubochet, J. Cutting artefacts and cutting process in vitreous sections for cryo-electron microscopy. J Struct Biol. 150 (1), 109-121 (2005).
  21. Rigort, A., et al. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (12), 4449-4454 (2012).
  22. Mahamid, J., et al. A focused ion beam milling and lift-out approach for site-specific preparation of frozen-hydrated lamellas from multicellular organisms. J Struct Biol. 192 (2), 262-269 (2015).
  23. Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy. Nat Methods. 4 (3), 215-217 (2007).
  24. Engel, B. D., et al. Native architecture of the Chlamydomonas chloroplast revealed by in situ cryo-electron tomography. Elife. 4, e04889(2015).
  25. Hayles, M. F., et al. The making of frozen-hydrated, vitreous lamellas from cells for cryo-electron microscopy. J Struct Biol. 172 (2), 180-190 (2010).
  26. Rubino, S., et al. A site-specific focused-ion-beam lift-out method for cryo transmission electron microscopy. J Struct Biol. 180 (3), 572-576 (2012).
  27. Schiøtz, O. H., et al. Serial lift-out: Sampling the molecular anatomy of whole organisms. Nat Methods. 21 (9), 1684-1692 (2023).
  28. Nguyen, H. T. D., et al. Serialized on-grid lift-in sectioning for tomography (solist) enables a biopsy at the nanoscale. Nat Methods. 21 (9), 1693-1701 (2024).
  29. Tang, X., et al. Step-by-step procedure for an optimized serial lift-out cryo-focused ion beam milling technique in tissue analysis. Biophys Rep. 11, 1-13 (2025).
  30. Wolff, G., et al. Mind the gap: Micro-expansion joints drastically decrease the bending of fib-milled cryo-lamellae. J Struct Biol. 208 (3), 107389(2019).
  31. Berger, C., Watson, H., Naismith, J. H., Dumoux, M., Grange, M. Xenon plasma focused ion beam lamella fabrication on high-pressure frozen specimens for structural cell biology. Nat Commun. 16 (1), 2286(2025).
  32. Eisenstein, F., et al. Parallel cryo electron tomography on in situ lamellae. Nat Methods. 20 (1), 131-138 (2022).
  33. Peck, A., et al. Aretomolive: Automated reconstruction of comprehensively-corrected and denoised cryo-electron tomograms in real-time and at high throughput. Preprint. bioRxiv. , (2025).
  34. Liu, Y. -T., et al. Isotropic reconstruction for electron tomography with deep learning. Nat Commun. 13 (1), 6482(2022).
  35. Chen, M., et al. A complete data processing workflow for cryo-ET and subtomogram averaging. Nat Methods. 16 (11), 1161-1168 (2019).
  36. Yang, Q., et al. The reduction of fib damage on cryo-lamella by lowering energy of ion beam revealed by a quantitative analysis. Structure. 31 (10), 1275-1281.e4 (2023).
  37. Tacke, S., et al. A streamlined workflow for automated cryo focused ion beam milling. J Struct Biol. 213 (3), 107743(2021).
  38. Boltje, D. B., et al. A cryogenic, coincident fluorescence, electron, and ion beam microscope. Elife. 11, e82891(2022).
  39. Yang, J., et al. Integrated fluorescence microscopy (IFLM) for cryo-fib-milling and in-situ cryo-ET. Preprint. bioRxiv. , (2023).
  40. Li, S., et al. Eli trifocal microscope: A precise system to prepare target cryo-lamellae for in situ cryo-ET study. Nat Methods. 20 (2), 276-283 (2023).
  41. Medeiros, J. M., et al. Robust workflow and instrumentation for cryo-focused ion beam milling of samples for electron cryotomography. Ultramicroscopy. 190, 1-11 (2018).
  42. Goetz, S. K., et al. A modular platform for automated cryo-fib workflows. Elife. 10, e70506(2021).
  43. Eisenstein, F., Fukuda, Y., Danev, R. Smart parallel automated cryo-electron tomography. Nat Methods. 21 (9), 1612-1615 (2024).
  44. Swulius, M. T., et al. Deep learning-based segmentation of cryo-electron tomograms. J Vis Exp. (189), e64435(2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи