Этот протокол стандартизирует криоэлектронную томографию (крио-ЭТ) для толстых тканей путём интеграции замораживания под высоким давлением (HPF) с методом, криогенного фокусирующего ионного пучка (крио-FIB) подъёма и дозовосимметричного параллельного набора метода, что позволяет получить равномерно тонкие ламеллы и витрифицированные образцы для воспроизводимого in situ анализа в гиппокампе мыши.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Рабочий процесс криоэлектронной томографии для толстых тканей, продемонстрированный на гиппокампе мышей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Криоэлектронная томография (крио-ЭТ) позволяет 3D-визуализировать нативную клеточную ультраструктуру, но её применение к толстым тканям ограничено отсутствием надёжной витрификация и низкопроизводительной подготовкой ламелли. Здесь представлен сквозный рабочий процесс, интегрирующий замораживание при высоком давлении (HPF; ~2100 бар; время от диссекции до замерзания ≤90 с) с использованием «вафельной» сборки с медной фольгой для предварительной разреживания тканей, крио-FIB подъёма и контролируемого истончения до ламелл 120–200 нм с компенсацией избыточного наклона. Проводящее покрытие стандартизировано (sputter-Pt 30 мА/15 с; ГИС конденсатор 0,5–1,0 мкм) для минимизации занавески. Автоматизированный, дозово-симметричный сбор данных (0°, ±3°, ±6°... до ±60–66°; размер шага 2–3°; общая доза 100–150 e⁻/Å 2) реализуется с помощью скриптов PACEtomo, при этом начальный угол наклона определяется на основе угла фрезера и ориентации образца. Обработка с помощью AreTomo 3 предоставляет функции для коррекции движения, оценки CTF, выравнивания и реконструкции WBP в почти реальном времени; IsoNet может опционально снижать анизотропию пропущенного клина. Усреднение субтомограммы (RELION 4.0) следует стратегии псевдосубтомограммы с отчетностью по разрешению, основанной на пороге FSC 0.143. Продемонстрированный на гиппокампе мышей, этот рабочий процесс регулярно даёт хорошо витрифицированные образцы и однородные ламели (целевая толщина 150 ± 40 нм), а также обеспечивает высокопроизводительный сбор по серии наклона (обычно 5–8 мин/наклон). Этот протокол предлагает воспроизводимый путь для изучения структурной биологии in situ непосредственно из сложных тканевых сред.
Введение
Криоэлектронная томография (крио-ЭТ) стала ключевым методом визуализации макромолекулярных комплексов и клеточных архитектур в их родном, гидратированномсостоянии 1,2,3,4,5. Реконструируя трёхмерные объёмы из наклонных серий проекционных изображений, крио-ET преодолевает разрыв между клеточным контекстом и почти атомарным разрешением, предлагая беспрецедентные знания в структурную биологию in situ6. Хотя рабочие процессы криоэлектронной томо....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры с тканями животных соответствовали требованиям SUSTech IACUC (Протокол SUSTech-JY202501019). Регенты и используемое оборудование указаны в Таблице материалов.
1. Подготовка образцов поддержки
- Подготовка носителей HPF (см. рисунок 1A)
- Получите пару медных носителей HPF толщиной 6 мм (тип B). Убедитесь, что одна из переносок имеет ровную поверхность.
- Смочите плоскую поверхность переноски и приступите к шлифовке. Сначала используйте наждачную бумагу с зернистостью 8000, пока исходные отметки не будут ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Успешное применение этого протокола позволяет получить высококачественные витрифицированные тканевые ламеллы и последующую реконструкцию томограмм, выявляющих нативную клеточную ультраструктуру. Следующие результаты, продемонстрированные на ткани гиппокампа мышей, являются показателями успешного эксперимента.
Тканевые блоки, обработанные методом замораживания под высоким давлением методом «», демонстрировали равномерный и электронно-прозрачный вид (
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Представленный здесь рабочий процесс устанавливает обобщённый, оптимизированный и воспроизводимый конвейер для криоэлектронной томографии нативных , толстых тканей in situ. Её основной вклад заключается не в изобретении уникальных методов, а в систематической интеграции, уточнении и детальной стандартизации всего процесса — от надёжной витрификация с использованием модифицированного метода вафельно-HPF до точно откалиброванного крио-FIB-протокола подъёма и протончения. Этот синт.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Авторы благодарят сотрудников Крио-ЭМ-центра Южного университета науки и технологий за техническую поддержку. Этот проект поддерживался Национальным институтом инноваций в науке и технологиях (Brain Science and Brain-like Intelligence Technology – Национальный проект по науке и технологиям, грант No 2022ZD0211905) и Национальным фондом естественных наук Китая (гранты No 32200998 и No 32161133022).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1-гексадецен | Сигма-Олдрич | H2131 | Химия и Реагенты |
| 2-метилпентан | Сигма-Олдрич | M65807 | Химия и Реагенты |
| Клип-ринг | Термо Фишер Сайентифик | 1131750; 1188953 | Расходные материалы |
| Медная фольга | Металлические материалы Фэнчэн | 1 и микро; m толщиной | Расходные материалы |
| Медные поддержки TEM-сетки (100 mesh) | Пекинская технологическая компания Zhongjingkeyi Ltd | BZ10021b | Расходные материалы |
| Cryo-EM | Термо Фишер Сайентифик | Krios G4 | Оборудование |
| Cryo-FIB | Термо Фишер Сайентифик | Аквилос 2 | Оборудование |
| Cryo-FIB Autogrid | Термо Фишер Сайентифик | 1205101 | Расходные материалы |
| Сетки (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh) | Квантолист | AltrAufoil | Расходные материалы |
| Морозильник высокого давления | Leica Microsystems | EM ICE | Оборудование |
| Носитель HPF, медь | Leica Microsystems | тип B (6 мм) | Расходные материалы |
| Ионный распылитель | Кворум | Q150RS plus | Оборудование |
| Металлографическая полировочная паста | Лабораторный тестек | W0.5 | Расходные материалы |
| Полировочная ткань | ГОРАЛ | B00809 | Расходные материалы |
| Наждачная бумага | Наждачная бумага бренда Eagle | 8000-зернистость, 12000-зернистость | Расходные материалы |
| Стереомикроскоп | Leica Microsystems | S9i | <имя="ДИАПАЗОН! D17">Оборудование и bbsp; |
| Сахароза | Сигма-Олдрич | 200-334-9 | Химия и Реагенты |
| Программное обеспечение для приобретения Tilt-Series | https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | SerialEM 4.0.9 | Программное обеспечение |
| Выравнивание и выравнивание наклонной серии Программное обеспечение для реконструкции | https://github.com/czimaginginstitute/AreTomo3 | AreTomo 3 | Программное обеспечение |
| Программное обеспечение для приобретения Tilt-Series | https://github.com/eisfabian/PACEtomo | PaceTomo | Программное обеспечение |
| Выравнивание и выравнивание наклонной серии Программное обеспечение для реконструкции | https://github.com/IsoNet-cryoET/IsoNet | IsoNet | Программное обеспечение |
| Выравнивание и выравнивание наклонной серии Программное обеспечение для реконструкции | https://github.com/cryoem/eman2 | EMAN2 | Программное обеспечение |
| Выравнивание и выравнивание наклонной серии Программное обеспечение для реконструкции | https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/index.html | Relion 4 | Программное обеспечение |
Ссылки
- Young, L. N., Villa, E. Bringing structure to cell biology with cryo-electron tomography. Annu Rev Biophys. 52 (1), 573-595 (2023).
- Baumeister, W. Cryo-electron tomography: A long journey to the inner space of cells. Cell. 185 (15), 2649-2652 (2022). <....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
