Количественная оценка изменений в колониообразующих единицах бифидобактерий и лактобацилл во время обработки рифаксимином и синбиотическим гелем у здоровых добровольцев

Summary

В этом клиническом исследовании были оценены показатели бифидобактерий и лактобацилл после 1 недели лечения рифаксимином и синбиотического геля, состоящего из Lactobacillus acidophilus NCFM и Bifidobacterium lactis Bi07, с агавой инулином, во время обработки рифаксимином и через 4 недели после этого по сравнению с гелем плацебо, что показало, что синбиотический гель может способствовать поддержанию лактобацилл и бифидобактерий.

Abstract

Хотя микробиота кишечника в целом стабильна, на неё может влиять лечение антибиотиками. Рифаксимин, используемый для лечения желудочно-кишечных заболеваний, часто вводят с пробиотиками для снижения риска дисбиоза. Lactobacillus acidophilus взаимодействует с клетками кишечника и использует пребиотические соединения. Бифидобактерия, особенно Bifidobacterium infantis ssp. lactis Bi07, — это пробиотик, который связан с полезным воздействием в кишечнике. Исследования in vitro показали превосходство агав-фруктанов над цикорийным инулином. Ни одно исследование не задокументировало изменения в количестве лактобацилл в кале и бифидобактерий после одновременного введения рифаксимина и синбиотиков. Нашей целью было оценить изменения в количестве КФУ кишечных бифидобактерий и лактобацилл у здоровых добровольцев после приема синбиотического геля, который содержит Lactobacillus acidophilus NCFM, Bifidobacterium lactis Bi07 и агаве инулин в качестве пребиотика, в течение 1 недели лечения рифаксимином и в течение 4 недель после. В рандомизированном, плацебо-контролируемом двойном слепом клиническом исследовании здоровые участники, не имевшие антимикробного лечения в предыдущем месяце, были рандомизированы 1:1 в двух группах (по 10 участников в группе). Группа Synbiotic Gel получила 10,32 г агаве инулина в качестве пребиотика и 4 × 10⁹ ФУ/г Lactobacillus acidophilus NCFM и 4 ×^{10 9} CFU/г Bifidobacterium lactis Bi07 в день в течение 5 недель, и 200 мг рифаксимина дважды в день в первую неделю. Группа плацебо получала плацебо-гель в течение 5 недель и 200 мг рифаксимина дважды в день в первую неделю. Бактериальные изменения оценивались путём количественной оценки КФУ с помощью микробиологической оценки фекалий. Пять недель спустя популяции лактобацилл и бифидобактерий не изменились. Обнаружение Lactobacillus acidophilus NCFM и Bifidobacterium lactis Bi07 в некоторых образцах кала указывает на временную и частичную колонизацию, что подчёркивает необходимость исследований доза-ответ с этим синбиотическим продуктом.

Introduction

Микробиота кишечника человека — это густонаселённое сообщество, включающее постоянно присутствующие местные виды и другие временные микроорганизмы. Хотя его состав может различаться у разных людей, он обычно считается стабильным. Однако на него могут влиять возраст, инфекция и лечение^{антибиотиками 1,2,3}. Рифаксимин, антибиотик широкого спектра действия с низким уровнем всасывания кишечника, используется для лечения кишечных заболеваний и может изменять микробиоту. Пробиотические бактерии родов Lactobacillus и Bifidobacterium используются для смягчения этих^{эффектов 2}.

Штамы Bifidobacterium spp. были признаны устойчивыми к^{рифаксимину 2}, что оказывает интересный эффект в стимулировании формирования кишечной биоты, содержащей популяции Bifidobacterium spp. в достаточном количестве для положительного пробиотического эффекта.

Кроме того, Lactobacillus acidophilus широко признан своей способностью взаимодействовать с эпителием 4 желудочно-кишечного тракта и способностью использовать пребиотики, такие как полисахариды, олигосахариды и фруктулигосахариды. Однако выявлено лишь несколько пробиотических штаммов, таких как штамм Lactobacillus acidophilus North Carolina Food Microbiology (NCFM). Поэтому важно изучать их эффекты in vivo, как и наличие Bifidobacterium lactis Bi07 в желудочно-кишечном тракте, что связано с различными полезными свойствами^{для здоровья 2,5}. Эти пробиотики требуют пребиотика для оптимального роста, поэтому синбиотик, содержащий как пробиотик, так и пребиотик работает синергетически; то есть его благоприятный эффект выше, чем у одного пробиотика. Вместе с пребиотиками, которые служат субстратами для пробиотиков, этот симбиоз, как ожидается, повысит выживание пробиотических микроорганизмов в желудочно-кишечном тракте, что способствует большему восстановлению^{микробиоты 6}.

Важным источником пребиотиков являются агав-фруктаны, которые, как сообщается, оказывают превосходящее эффект in vitro на микробиоту, чем корень цикория (Cichorium intybus L.).⁷. Исследования сообщали о влиянии употребления пробиотиков; например, Энгельбректсон и соавторы оценили, может ли прием пробиотиков во время и после введения антибиотиков уменьшить изменения в микробиоте, вызванные^{антибиотиками 8}. Они обнаружили, что группа, получившая пробиотическую смесь, показала более быстрое восстановление нормальной микробиоты, чем у тех, у кого его^{не было 8}. Кроме того, Конинг и соавторы изучали дисбиоз в кишечной микробиоте 40 здоровых добровольцев, получавших 500 мг амоксициллина дважды в день в течение 7 дней, а также возможное восстановление микробиоты после употребления пробиотической смеси. Результаты показали, что лечение амоксициллином влияет на состав родной микробиоты. При введении пробиотической смеси микробиота значительно восстанавливалась через два месяца^{потребления 9}.

Однако в литературе сообщается, что ни одно исследование не изучало влияние употребления синбиотиков (с агав-фрукттанами в качестве пребиотика) на кишечную микробиоту во время и после введения антибиотиков, например, рифаксимин; Мы нашли только исследования с пробиотиками. Поэтому в этом исследовании были оценены изменения в количестве КФУ кишечных бифидобактерий и лактобацилл у здоровых добровольцев после употребления синбиотического геля, который содержит Lactobacillus acidophilus NCFM, Bifidobacterium lactis Bi07 и агаве инулин в качестве пребиотика, в течение 1 недели лечения рифаксимином и в течение 4 недель после этого.

Protocol

Протокол был утверждён Институциональным комитетом по биомедицинским исследованиям на людях (CIIBH) Национального института медицинских наук и нутрициона Сальвадора Зубирана (INCMNSZ) (REFERENCE 1734). Все участники дали информированное согласие перед тем, как быть включены в это исследование.

Дизайн исследования и население

Это было рандомизированное плацебо-контролируемое, двойное слепое клиническое исследование с 5-недельным периодом наблюдения. Сотрудники INCMNSZ были приглашены принять участие в исследовании, а здоровые волонтёры в возрасте 20–50 лет, не проходившие антимикробное лечение в предыдущем месяце, приняли и подписали форму информированного согласия, были включены в период с 2011 по 2012 годы. Участники исследования были рандомизированы 1:1 в группу Synbiotic Gel с 10,32 г агавы инулина в качестве пребиотика и 4 × 10⁹ CFU/г Lactobacillus acidophilus NCFM и 4 × 10⁹ CFU/г Bifidobacterium lactis Bi07 в день, содержащегося в 4 пакетиках в течение 5 недель, и 200 мг рифаксимина дважды в день в первую неделю. Группа Плацебо Геля получила 4 упаковки по 15 г плацебо-геля с той же презентацией и сенсорными характеристиками, что и синбиотический гель, в течение 5 недель и 200 мг рифаксимина дважды в день в первую неделю (см. рисунок 1).

Клиническая оценка

В обеих группах оценивались симптомы и внешний вид кала с помощью шкалы Бристоля. Также измерялись индекс массы тела, роста и массы тела (ИМТ). Дневник использовался для оценки потребления синбиотического геля, плацебо-геля и рифаксимина, а также для фиксации наличия или отсутствия побочных эффектов, связанных с приемом геля.

Потребление клетчатки

Поступление клетчатки оценивалось с помощью пищевого дневника и 24-часового отзыва каждую неделю в обеих группах.

Соблюдение лечения

Соблюдение приема рифаксимина и геля оценивалось путем подсчёта количества доз рифаксимина и количества пакетиков синбиотических и плацебо-гелей на одного участника. Наличие Lactobacillus acidophilus и Bifidobacterium lactis было обнаружено с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Микробиологическая оценка фекалий

При посещении 0 и еженедельно по 5 (6 визитов) в каждой группе количество лактобацилл, бифидобактерий и энтеробактерий оценивалось в 120 образцах калов методом подсчёта пластин. Этот метод измеряет колониообразующие единицы (CFU) путём размещения разбавленных образцов на специализированные твёрдые среды¹⁰. Образцы кала собирались в начале каждого визита.

Для идентификации микроорганизмов собирались образцы фекалий и хранили в пробирках BBL. Флакон PBG использовался для анаэробных бактерий, а образцы фекалий транспортировались в охладителе из пенопласта с замороженные гелевые пакеты для поддержания низкой температуры перед обработкой в лаборатории. Крышка флакона PBG для копрокультуры была снята, а образец кала взят с помощью мазка, чтобы убедиться, что тампон был пропитан образцом. Затем аппликатор помещали в трубку с твёрдой культурной средой.

Для анаэробных бактерий флаконы взвешивались, и с помощью ложки собирали 5–10 г кала. Затем табурет смешивали с содержимым флакона и плотно запечатывали. Для обработки образцов взвешивали флаконы с образцами и стерильные пакеты Stomacher. Образец выливался в мешок, центрифугировался в течение 60 секунд, после чего добавляли 4,5 мл воды с пептонами 0,1%. Впоследствии 500 мкл образца передавали в флакон и вихрили для гомогенизации смеси. После того как 100 мкл образца был инъекциирован в дублике на каждую пластину специфической селективной среды, в среде Man Rogosa Sharpe (MRS) для лактобацилл и среде DP Beerens с цистеином + циклогексимидом (для устранения нежелательной флоры) для бифидобактерий, до разбавления 8 (коэффициент разбавления 0,1 мл). Для энтеробактерий среда МакКонки использовалась при разбавлениях 5–8 (коэффициент разбавления 0,1 мл), где отделялись и количественно оценивались бактериальные^{колонии 11}. Каждый средний порошок растворялся в очищенной дистиллированной воде, раствор нагревался до кипения для полного растворения и стерилизовался в автоклаве при 121 °C в течение 15 минут. Смесь охлаждалась до 46,5 °C для выполнения техники налива, заливая по 1 мл на одну тарелку в стерильные чашки Петри с 15–20 мл культурной среды и давая пластинам затвердеть. Инокуляционные образцы инкубировали при 37 °C в атмосфере, обогащённой_CO2, в анаэробных системах GasPak для поддержания анаэробных условий в течение 24–48 часов. Колониообразующие единицы (CFU) отмечались пером и^{насчитывали 12} единиц. Была применена следующая формула:

CFU/mL = (количество колоний × общий коэффициент разбавления)/объём посварённой (mL)

Идентификация морфологических характеристик лактобацилл и бифидобактерий

Для определения морфологических характеристик образца использовался Gram Stain. Образец бактериальных колоний каждого штамма помещался на микроскопический стекло, окрашивался кристаллическим фиолетовым в течение 1 минуты, а затем промывался дистиллированной водой. Раствор йода наносили на 1 минуту, затем промывали дистиллированной водой. В течение 10 секунд использовали спиртово-ацетоновый раствор в качестве обесцветителя и промывали дистиллированной водой. Наконец, сафранин наносили в качестве контрморилки в течение 1 минуты и промывали дистиллированной водой. Микроскопические слайды наблюдались под оптическим микроскопом с использованием погружного масла с объективом 100x.

Общая количественная оценка была проведена с помощью традиционной полимеразной цепной реакции (ПЦР) на случайно отобранных образцах фекалий из пяти участников в каждой группе, в общей сложности 60 образцов за 5 недель. Изоляты из культурных сред были обработаны для извлечения генетического материала. ПЦР проводилось с использованием универсальных бактериальных праймеров для амплификации фрагмента гена 16S^{рРНК 13}. Продукты ПЦР были очищены и секвенированы. Последовательности были проверены и отправлены в базу данных GenBank для подтверждения наличия штаммов лактобацилл и бифидобактерий, выделенных из фекальных образцов.

Статистический анализ

Данные представлены в виде абсолютных и относительных частот или медианы (p25-P75). Совокупная тяжесть симптомов определялась с помощью шкалы Ликерта (лёгкий, 1; умеренный, 2; тяжёлый, 3) при каждом последующем обследовании. Межгрупповые сравнения проводились с использованием теста ранговой суммы Уилкоксона и хи-квадрата или точного теста Фишера. Внутригрупповые сравнения между 0 и 5 неделями проводились с использованием теста Фридмана и множественных сравнений с Дурбина-Коновером. Статистическая значимость была установлена на уровне P < 0,05.

Results

Двадцать здоровых добровольцев были случайным образом разделены на группу синбиотического геля (n = 10) и группу плацебо геля (n = 10) (рисунок 2 и таблица 1). В группе Synbiotic Gel семь мужчин и три женщины с медианным возрастом 31 год (диапазон 27–35 лет); в группе Placebo Gel трое были мужчинами и семью женщинами, медианный возраст 33 года (диапазон 28–38 лет). Группы были похожи по возрасту, полу, весу и ИМТ. Соблюдение...

Discussion

В настоящем исследовании мы обнаружили значительное снижение количества энтеробактериальных веществ в фекальных образцах участников группы плацебо с первой недели вмешательства и у участников группы синбиотического геля в первую и вторую недели. Это изменение можно объяснить с помощью рифаксимина, который описывается как смягчающий патогенный бактериальный^{чрезмерный рост 14}. В нашем исследовании группа Synbiotic Gel после применения рифаксимина показала положитель...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Трубка BBL	NA	NA	Можно использовать любую марку
Среда DP	NA	NA	Можно использовать любую марку
Замороженные гелевые пакеты
Медиа МакКонки	NA	NA
Среда MRS	NA	NA	Можно использовать любую марку
Флакон PBG			Фосфатный буфер, желатин, соли, 0,05% цистеин в качестве восстанавливающего агента for02
Чашки Петри
Плацебо Blend	KuragoBiotek-BabyCat.	NA	Те же физические и сенсорные свойства, что и у сим-йотинного геля, но без активных компонентов
Континер из пенопласта
Симбиотическое смешение	KuragoBiotek-BabyCat.	NA	Немолочный продукт, состоящий из Lactobacillus acidophilus NCMF и Bifidobacterium infantis Bi-07 (2 x 109  CFU/g), а также 17,2 г агавы инулина в качестве пребиотика в упаковке по 15 г