Протокол по обогащению липидных капель по размеру из эпителиальных клеток молочной железы и тканей молочной железы крупного рогатого скота

Краткое содержание

Этот протокол направлен на достижение размерного разделения и обогащения липидных капель посредством последовательного центрифуга, что позволяет точно и воспроизводимо исследовать механизмы метаболизма липидов и биологические процессы, связанные с липидными каплями.

Аннотация

Этот протокол описывает последовательный дифференциальный подход к центрифугированию для обогащения липидных капель (LD) разных размеров из эпителиальных клеток молочной клетки (BMEC) и молочных тканей крупного рогатого рогатого скота, что позволяет проводить анализ с разрешением размера, выходящий за рамки традиционных методов выделения объёмных LD. В качестве динамических регуляторных центров внутриклеточного липидного метаболизма LD выполняют важные функции, накапливая нейтральные липиды (такие как триглицериды и холестериловые эфиры) и координируя их синтез, гидролиз и транспорт. Они играют центральную роль в поддержании энергетического гомеостаза, поддержке биогенеза мембран и облегчении передачи клеточного сигнала. Экстракция LD необходима для изучения регуляторных механизмов липидного метаболизма. Изучение метаболизма липидов молочных желез имеет значительное значение для развития младенцев, здоровья человека, аграрной экономики и фундаментальной клеточной биологии. Поэтому мы описываем метод дифференциальной центрифугации для извлечения LD из BMEC и ткани молочных желез. В отличие от традиционных методов объёмной изоляции LD, этот протокол позволяет обогащать субпопуляции LD на основе размера, последовательно корректируя центробежные силы. Целостность и относительное обогащение фракций LD предварительно оцениваются с помощью окрашивания BODIPY493/503, что обеспечивает практичный и воспроизводимый подход для дальнейших анализов липидного метаболизма и связанных с LD процессов.

Введение

Липидные капли (LDs) — это динамические органеллы внутри клеток, которые служат основными местами хранения нейтральных^{липидов 1}. Аномальное накопление LD связано с широким спектром заболеваний, выходящих за рамки ожирения и включая такие заболевания, как жировая болезнь^{печени 2}, сердечно-сосудистые^{заболевания 3},^{диабет 4} и^{рак 5}. Наоборот, недостаток LD может иметь серьёзные последствия, приводя к потере клеточных энергетических запасов и последующим нарушениям^{функциональных функций 6}. В контексте аграрной экономики недостаток LD у жвачных животных может привести к недостаточной секреции молочного жира, что приводит к снижению молочного жира, что, в свою очередь, снижает питательную ценность и рыночную привлекательность молочных продуктов⁷. В настоящее время регуляция метаболизма LD стала значимой областью исследований.

Развитие технологий экстракции LD с XX века постоянно направлено на экстракцию LD в больших количествах, с более высокой чистотой и лучше сохраненной биологической активностью. Это включает непрерывное установление и оптимизацию методологий. В настоящее время несколько компаний разработали коммерческие наборы для LD^{separation 8}. Хотя эти наборы значительно сокращают время разделения и требуют использования только обычных центрифуг, для образцов, которые трудно диссоциировать, реагент нельзя регулировать, и сложно оптимизировать этапы тестирования. Кроме того, извлечение LDs играет незаменимую роль в выяснении механизмов заболеваний, включая метаболические заболевания, такие как жировая^{печень 9}, рак¹⁰ и нейродегенеративные^{заболевания 11}, служа многомерным исследованием патологических путей. Состав белков и липидов также можно разобрать, экстракция LD, чтобы выявить разнообразие биологических функций LD¹².

Образование молочного жира — это не просто процесс разрушения субстрата; скорее, это представляет собой высокоорганизованный процесс синтеза и упаковки липидов, осуществляемый эпителиальными клетками молочной железы. ¹³. Образование молочного жира у молочных коров зависит от механизма секреции апикальной мембраны этих клеток: триглицериды, синтезированные в эндоплазматическом ретикулуме, образуют цитоплазматические LDs, которые затем транспортируются в апикальную мембрану и выделяются путём попочкания. В ходе этого процесса LDs покрываются мембраной молочного жира, происходящей из апикальной мембраны, что приводит к образованию структурно устойчивых молочных жировых^{шаров 14}. Молочная железа крупного рогатого скота служит классической моделью для изучения лактации у млекопитающих, а основные механизмы, регулирующие синтез и секрецию LD, у человека^{очень консервативны 15}. Разработка методов извлечения LD как из BMEC, так и из молочной ткани может связать производство скота и здоровье человека. Протеомные и липидомные анализы извлеченных LD могут впоследствии быть использованы для улучшения урожайности и качества молока, обеспечивая безопасность и защиту.

Настоящий метод основан в первую очередь на низкоплотной характеристике LD, которая позволяет им подниматься к вершине градиента во^{время центрифугации 16}. Процедура экстракции состоит из трёх основных этапов: сбор образцов, ультрацентрифугирование для LD-флотации и LD-промывка. Сахароза (2,5 м) добавляется в буфер для защиты LD, затем скорость центрифугирования регулируется в соответствии с экспериментальными требованиями; обычно большие LD могут обогащаться при силах ниже 10 000 x g, тогда как для извлечения малых LD применяются более высокие скорости (выше 10 000 x g), так как крупные LD могут разорваться при таких условиях. Наконец, извлечённые LD подвергаются многократной промывке для предотвращения загрязнения, а чистота экстракции предварительно оценивается с помощью окрашивания BODIPY493/503.

Традиционные методы изоляции LD в основном обеспечивают массовое восстановление гетерогенных популяций LD, ограничивая анализ структурных и функциональных различий, зависящих от размера. Настоящий протокол расширяет стандартные подходы, позволяя обогащение субпопуляций LD на основе размера посредством последовательной дифференциальной центрифугации, облегчая исследование роста, оборота LD, внутриклеточного трафика и дифференцированного использования липолитическими или аутофагическими путями. Этот подход достигает обогащения, а не абсолютного очищения, и частичное перекрытие между долями размера может возникать из-за непрерывного распределения размеров и общих физических свойств.

Протокол

Определите размер целевых липидных капель для обогащения (рисунок 1).

1. Настройка реагента

1. PBS: Вес 8 г NaCl, 0,2 г KCl, 3,58 г Na₂HPO₄·12H₂O, и 0,24 г KH₂PO₄ в 800 мл ddH₂O. Отрегулируйте pH до 7,4 с помощью HCl, тщательно перемешайте и увеличите объём до 1 л. Храните при 4 °C до 1 года после автоклава.
2. Сахароза (2,5 м): Взвешивайте 856 г сахарозы и растворяйте её в 400 мл ddH₂O. Тщательно перемешайте до полного растворения сахарозы, затем отрегулируйте объём до 1 л. Автоклав раствора храните при 4 °C до 3 месяцев.
3. Буфер A: взвесьте 1,79 г трицина и растворите его в 400 мл ddH₂O. Отрегулируйте pH до 7,8 с помощью KOH. После корректировки pH добавьте 50 мл предварительно подготовленного раствора сахарозы 2,5 м. Тщательно перемешайте и отрегулируйте объём до 500 мл. После автоклава буфер можно хранить при 4 °C до 3 месяцев.
4. Буфер B: вес 0,95 г HEPES, 1,49 г KCl и 0,038 г MgCl₂·6H₂O отдельно на 180 мл ddH₂O. Отрегулируйте pH до 7,4 с KOH, тщательно перемешайте и увеличите объём до 200 мл. После автоклава храните при 4 °C до 3 месяцев.
5. PMSF (1 000x, 0,2 M): Взвесьте 0,175 г PMSF и растворите его в 5 мл DMSO. Храните защищённой от света при -20 °C до одного года.
   ПРИМЕЧАНИЕ: PMSF очень токсичен; Необходимо принять соответствующие меры защиты. Во время подготовки обеспечьте полную защиту от света; ПМСФ трудно растворять и может быть перемещена в микроцентрифугные трубки объёмом 1,5 мл.

2. Извлечение LD из клеток

1. Культура BMEC
   1. Достать пять трубок замороженных клеток BMEC из холодильника при температуре -80 °C и быстро их разморозить в водяной бане при температуре 37 °C. Центрифугуйте трубки при температуре 250 x g на 4 минуты 30 секунд после полного отмораивания.
   2. Сбросьте криоконсервационную среду пипеттором, добавьте 1 мл 10% FBS для повторной суспензии клеток, перемешайте и аккуратно добавьте клетки в 100-мм контейнер с 6 мл 10% FBS. Аккуратно покачивайте тарелку, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток, и инкубируйте при 37 °C с 5% CO₂.
   3. Следите за морфологией клеток под микроскопом и проводите субкультурирование, когда клетки достигают слияния 80–90%.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте оптимальное состояние клетки и достаточное количество клеток перед экстракцией LD для повышения выхода и воспроизводимости.
   4. Выбросьте исходную культурную среду в чашку Петри с помощью пипетки и добавьте 1 мл PBS вдоль стенки каждой чашки. После дважды мытья добавьте в каждую миску 1 мл трипсина и инкубировать при 37 °C в течение 3 минут 30 секунд.
   5. Проверьте, полностью ли клетки перевариваются под микроскопом, добавьте 1 мл 10% FBS, чтобы прекратить пищеварение после завершения пищеварения. Аккуратно подвесьте клетки с помощью пипетирования, перенесите их в микроцентрифугную трубку объемом 2 мл и центрифугуйте при 250 x г в течение 4 минут 30 с.
   6. Отбросьте супернатант и повторите процедуры, описанные в шаге 1.2.
   7. Расширяйте клетки, используя примерно 30 культурных тарелок или более крупные сосуды, либо используйте более крупные культурные чаши для клеточной культуры. Добавьте 150 мкмоль/л t10,c12-CLA (разбавленный в DMEM) для обработки клеток накануне извлечения. Используйте 7 мл посевной среды на 100 мм посевную чашу. Время культуры зависит от размера LD, которые нужно разделить.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На основе предварительной оптимизации обрабатывайте BMEC t10,c12-CLA в течение 6 часов для обогащения крупных LD или 12–24 часа для обогащения малых LD. Поскольку клетки содержат мало LD, обычно добавляют экзогенные жирные кислоты для стимулирования накопления LD. В этом исследовании добавьте t10,c12-CLA к культивируемым клеткам для индуцирования накопления LDs.
2. Сбор образцов
   1. Отбросьте исходный материал, добавьте 1 мл ледяного PBS и постирайте три раза. Не выбрасывайте PBS во время финальной стирки. Используя 30 антенн по 100-мм ячейкам в качестве примера, соберите ячейки из каждых 10 пластин в одну 15-мл-центрифугную трубку, каждая из которых содержит примерно 1x108, в результате чего получается 3 центрифугные трубки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте все образцы при ≤4 °C на протяжении всего процесса экстракции, чтобы предотвратить разрушение белков в LDs.
   2. После балансировки центрифугуйте при 1000 x g, 4 °C в течение 10 минут.
   3. Отбросьте PBS. Добавьте 10 мл предварительно подготовленного буфера A и 10 мкл PMSF (1000x, 0,2 м) в трубку центрифуги. Тщательно перемешайте и инкубуйте на льду 20 минут.
3. Лизис клеток и начальное фракционирование
   1. Клетки с помощью ультразвукового гомогенизатора типа зонда работали в импульсных циклах 5 с включённым и 10 с выключенным, что приводило к общему эффективному времени соникации 10 минут за 30 минут. Установите мощность прибора на 40% (что соответствует амплитуде зонда примерно 76 мкм) с помощью зонда диаметром 3 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Храните образцы на льду на протяжении всей процедуры, чтобы предотвратить перегрев.
   2. Центрифугуйте гомогенат при 3 000 x g и 4 °C в течение 10 минут, чтобы удалить ядра и клеточный мусор. Соберите супернатант как постядерный супернатант (ПНС).
4. Ультрацентрифугирование плавающих LD
   1. Фильтруйте супернатант через 100 мкм ячейку.
   2. Пипетта 10 мл PNS в центрифугную трубку на 15 мл. Добавьте 2 мл сахарозы (2,5 м) и 2 мл буфера B последовательно к верхней части PNS (объем сахарозы можно соответствующим образом уменьшить при увеличении объёма буфера B для повышения чистоты LD), а затем впервые центрифугировать (5 000 x g, 4 °C, 20 мин).
   3. После центрифугирования соберите молочное, сливочное слое LD в верхней части трубки. Для сбора LD сначала добавьте 100 мкл буфера B в микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл, затем используйте пипетку на 20 мкл, чтобы аккуратно аспирировать плавающий слой LD несколько раз, собирая как можно больше LD.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сверху образуют плавающий кремовый слой; Избегайте аспирирования раствора как можно больше, чтобы предотвратить загрязнение.
   4. Проведите вторую центрифугу (10 000 x g, 4 °C, 30 мин) и соберите LDs.
   5. Переведите раствор в ультрацентрифугную трубку, совместимую с вращающимся ротором, закройте её и уравновесите трубки. Проведите третью центрифугу в ультрацентрифуге (50 000 x g, 4 °C, 40 минут) и соберите LD.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Точно сбалансируйте трубки (до 0,0001 г) для обеспечения безопасной работы ультрацентрифуга.
   6. После балансировки выполните четвёртую центрифугу (150 000 x g, 4 °C, 50 мин), чтобы продолжить сбор LD. Оптимизируйте скорость и длительность в соответствии с целевым размером LD.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Длительное или повторяющееся высокоскоростное центрифугирование может нарушать LD. В отличие от этого, кратковременное центрифугирование при 10 000 x g во время промывки в основном удаляет примеси и оказывает минимальное влияние на целостность LD. Этот метод адаптивен; Оптимизация может потребоваться для различных типов клеток или тканей.
5. Стирка LD
   1. Суспензировать собранные LD в холодном буфере B и центрифугировать при температуре 10 000 x g и 4 °C в течение 5 минут.
   2. Аккуратно удалите супернатант и повторите этап промывки не менее четырёх раз, используя тот же буферный объём, центробежную силу и время центрифуга. Для малых LD увеличивайте центробежную силу по мере необходимости, чтобы обеспечить эффективное разделение.
   3. После окончательной промывки сберите LD-фракции, аккуратно перемешайте и храните при −80 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не упускайте этапы мытья, даже если некоторая потеря болезни неизбежна. Продолжайте мыть, пока не останется видимый мусор мембраны.

3. Извлечение LD из ткани

1. Сбор образцов
   1. Получить образцы молочной ткани крупного рогатого скота из жидкого азота. Взвесьте 5 г ткани и разморозите её на льду, пока не останется ледяных кристаллов.
   2. Прополосните ткань PBS или физиологическим физиологическим раствором.
   3. Нарежьте ткань на кусочки диаметром 1-2 мм хирургическими ножницами.
   4. Переместите измельчённую ткань в предварительно охлаждённую ступку, содержащую 12 мл буфера A и 10 мкл PMSF (1 000x, 0,2 м). Измельчите смесь на льду примерно 10 минут.
   5. Инкубировать гомогенат на льду в течение 20 минут.
   6. После тщательного измельчения соберите гомогенат в центрифугную трубку на 15 мл.
   7. Центрифуга при температуре 2 500 x g, 4 °C в течение 10 минут. Полученный супернатант — это PNS.
2. Ультрацентрифугирование плавающих LD
   1. Фильтруйте супернатант через 100 мкм ячейку.
   2. Пипетта 10 мл PNS в центрифугную трубку на 15 мл. Добавляйте 2 мл сахарозы и 2 мл буфера B последовательно. Выполните первую центрифугу (4 000 x g, 4 °C, 20 мин). Соберите молочное, сливочное покрытие.
   3. Проведите вторую центрифугу (7 000 x g, 4 °C, 30 мин) и соберите LD.
   4. Проведите третью центрифугу (10 000 x g, 4 °C, 40 минут) и соберите LDs.
   5. Переведите супернатант в трубку SW40 и выполните ультрацентрифугирование (50 000 x g, 4 °C, 50 мин). Собирайте LDs.
   6. Выполните пятую центрифугу (100 000 x g, 4 °C, 60 мин). Собирайте LDs.
3. Стирка LD
   Обратитесь к методу промывания для клеточных извлекаемых LD.

4. Предварительное подтверждение чистоты LD с помощью окрашивания

1. Заранее подготовьте 10 мкг/мл раствора нейтрального липидного флуоресцентного красителя в условиях защиты от света (BODIPY: Буфер B = 1:100, V/V).
2. Добавьте соответствующее количество смешанных LD и буфера B в микроцентрифугную трубку. В условиях защиты от света добавьте соответствующее количество раствора нейтрального липидного флуоресцентного красителя. Тщательно перемешайте и инкубуйте 10 минут.
3. Подготовьте чистый микроскопический стекло. Нанесите 2,5 мкл смеси на накладку. Аккуратно положите слайд поверх смеси, избегая пузырьков воздуха. Наблюдайте под инвертированным флуоресцентным микроскопом.

5. Подтверждение чистоты LD с помощью Western blot

1. Концентрация белков в LD-фракциях измерялась с помощью белкового теста BCA.
2. Для анализа вестерн-блот смешайте 20 мкг белка из каждого образца с буфером для загрузки 5x SDS и нагрейте при 99 °C в течение 10 минут для полной денатурации.
3. Затем разделите белки по SDS–PAGE на гелях полиакриламида с 10% градиентом по их молекулярным весам.
4. После электрофореза перенесите белки на предварительно активированные мембраны PVDF, затем блокируйте 5% BSA при комнатной температуре в течение 1,5 часа. Впоследствии я инкубировал мембраны за ночь при 4 °C с первичными антителами, включая кроличий антиперилипин 2 (1:500) и анти-β-актин (1:5000).
5. Промыйте мембраны три раза с помощью 1x TBST по 10 минут каждая, затем инкубировать с козьим антителом против кроликов, сопряжённым с HRP (1:5000) в течение 1,5 часа при комнатной температуре.
6. После трёх дополнительных промываний с TBST обнаружите белковые полоссы с помощью комплекта для улучшенной хемилюминесценции (ECL) и визуализируйте с помощью гелевой визуализации.

6. Точки паузы и рекомендации по хранению

1. Держите ПНС на льду до 1–2 часов перед ультрацентрифугированием.
2. Держать собранные LD на льду до 1–2 часов перед мытьём. Для краткосрочного хранения храните LD при 4 °C до 24 часов. Для длительного хранения храните LD при −80 °C и ограничивайте циклы замораживания/оттаивания не более одного для сохранения целостности LD.
3. Во время всех экспериментальных пауз держите образцы на льду с закрытыми крышками пробирок, чтобы минимизировать загрязнение.

7. Устранение неполадок

1. Тонкий плавающий слой: регулируйте объём буфера или силу центрифуга.
2. Плохая плавающая активность: увеличьте скорость центрифугации или продлеваете время.
3. Загрязнение: обеспечьте стерильное обращение и фильтрованные буферы.
4. Разрыв LD: держите образцы на льду, уменьшайте центрифугировальную силу или аккуратно суспенгируйте.

Результаты

Рабочий процесс и методологическая структура
Была создана схема дерева принятия решений (рисунок 1) для руководства выбором условий центрифугирования в соответствии с экспериментальными целями. В частности, центробежные силы ≤10 000 x g применялись для обогащения крупных LD (≥2 мкм), тогда как силы >10 000 x g — для обогащения малых LD (<1 мкм). Эта структура предоставляет практическую основу для достижения разделения LD...

Обсуждение

LD — это уникальные органеллы, характеризующиеся нейтральным липидным ядром, окружённым фосфолипидным монослоем. Они выделяются из эндоплазматического ретикулума и динамически меняют свой размер и число, что способствует внутриклеточному транспорту и широкой коммуникации с другими субклеточными структурами для координации клеточного липидного^{гомеостаза 17,18,19}. Это динамическое поведение дополн...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,25% трипсин-ЭДТА	Gibco	25200072	Реагент
10% гелевые наборы для быстрой подготовки PAGE	Пекинский BIOMAN	PG112	Реагент
100 & MU; Сито M-ячейки	Beyotime	FSTR100	Реагент
100-мм контейнер для культивирования клеток	Корнинг	490167	Реагент
Amersham Imager 600	GE Healthcare Life Sciences	600	Оборудование
Автоклав	Panasonic	MLS-3751L	Оборудование
Белковый тест BCA	Пекин Динго.	BCA01	Реагент
BODIPY 493/503	Инвитроген	D3922	Реагент
Центрифуга	Эппендорф		Оборудование
DMEM	HyClone	SH30022.01	Реагент
DMSO	Solarbio	D8370	Реагент
Сыворотка плода крупного рогатого скота	Gibco	2492319	Реагент
HEPES	MedChemExpress	HY-D0857	Реагент
HRP-конъюгированный AffiniPure козий антикроличий вторичный антител	Proteintech	SA00001-2	Реагент
KCl	HUSHI	20030666	Реагент
KH2PO4	HUSHI	10017608	Реагент
MgCl2	HUSHI	20059028	Реагент
Na2HPO4· 12Ч<суб>2O	HUSHI	S112623	Реагент
NaCl	HUSHI	10019328	Реагент
Универсальный буфер для мгновенной загрузки белка	Shanghai Epizyme Biomedical Technology	LT101S	Реагент
Набор для обнаружения хемилюминесценции Omni-ECL Ultra-Sensitive Chemiluminescence Kit	Shanghai Epizyme Biomedical Technology	SQ201	Реагент
PBS	HyClone	SH30256.01	Реагент
Пенициллин и Стрептомицин 100 раз;	NCM Biotech	CLOOC5	Реагент
pH-метр	МЕТТЛЕР ТОЛЕДО	S220K	Оборудование
Пипетт	Эппендорф		Оборудование
PMSF	Coolaber	CP8651	Реагент
Набор для переноса мембран PVDF	GenScript	eBlot L1	Реагент
Кролик анти-перилипин 2	Abcam	15294-1-AP	Реагент
Кроликовый анти-&бета-актин	Proteintech	20536-1-AP	Реагент
Инвертированный флуоресцентный микроскоп исследовательского класса	Олимп	IX73	Оборудование
Сахароза	Solarbio	S8271	Реагент
Ротор SW 40 Ti	БЕКМАН КОУЛТЕР	331301	Оборудование
Trans-10, сопряжённая линолеиновая кислота cis-12	КАЙМАН	90145	Реагент
Трицин	Coolaber	CT11331	Реагент
Ультрацентрифуга	БЕКМАН КОУЛТЕР	Optima XE-100	Оборудование
Ультразвуковая дробилка для ячейки	SCIENTZ	JY92-11N	Оборудование