Методическая статья

Сайт-специфическая лактилирование лизина через расширение генетического кода в клетках E. coli и млекопитающих

DOI:

10.3791/70209

⸱

24 февраля 2026 г.

 ,  ,  , 
1Synthetic Biology Center for Chinese Medicine, School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании был установлен метод, использующий расширение генетического кода для успешного включения лактиллизина (Klac) в определённые участки человеческой энолазы-1 (hENO1) и суперпапки GFP (sfGFP) в клетках Escherichia coli и млекопитающих.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Лактилирование — это недавно обнаруженная посттрансляционная модификация (ПТМ) с разнообразными биологическими функциями. С момента первоначального определения в 2019 году как регулятора поляризации макрофагов, гистонная лактилирование стало ключевым звеном, соединяющим клеточный метаболизм с функциональной регуляцией. С биохимической точки зрения она включает ковалентный перенос лактильной группы в остатки лизина, опосредованный либо лактилтрансферазами, использующими лактил-КоА в качестве донора ацила, либо аминоацил-тРНК-синтетазами (AARS) через промежуточный продукт лактил-АМФ. Благодаря этим механизмам уровень внутриклеточного лактата напрямую связан с модификацией и функцией белка. Лактилирование опосредует ряд критически важных клеточных процессов — от физиологических функций, таких как регуляция генов, восстановление ДНК, метаболическое перепрограммирование и иммунная модуляция, до патологических процессов, таких как прогрессирование опухолей и метастазы. Несмотря на выявление множества мест лактилирования с помощью протеомики, достижение локал-специфической лизиновой лактилировки через мутагенез остаётся сложным. Для решения этой проблемы мы применяем технологию расширения генетического кода, используя лактиллизин-специфическую аминоацил-тРНК-синтетазу (KlacRS) и её родственную тРНК для точного включения лактиллизина (Klac) в определённые остатки. Эта стратегия позволяет создавать однородно лактилированные белковые варианты для прямых функциональных исследований. Здесь мы описываем упрощённый протокол сайт-специфической лактилирования белков, валидированный как в клетках Escherichia coli (E. coli), так и у млекопитающих, с использованием человеческой энолазы-1 (hENO1) и суперпапки GFP (sfGFP) в качестве модельных систем.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Лизиновое лактилирование (Klac), изначально выявленное на гистонах, стало ключевым узлом, связывающим аномальный метаболизм опухолей и эпигенетическуюрегуляцию 1. Накопление лактата в результате усиленного аэробного гликолиза в опухолевых клетках обеспечивает метаболическую основу для лактилирования, позволяя лактату действовать не просто как метаболический побочный продукт, а как сигнальная молекула, напрямую модулирующая функцию белка. Всё больше данных свидетельствует о том, что лактилирование в широком смысле участвует в инициации и прогрессировании опухоли, координируя пролиферацию раковыхклеток 2,3,4,5, метастазы 6, метаболическоеперепрограммирование 7 и терапевтическуюустойчивость 8,9.

На фенотипическом уровне повышенная лактилирование тесно связана с усиленной агрессивностью опухоли. Например, при прозрачноклеточной почечноклеточной карциноме (ccRCC) лактилирование H3K18 способствует пролиферации и метастазированию путём усиления β рецепторов факторов роста, полученного из тромбоцитов (PDGFRβ), создавая положительную обратную связь между накоплением лактата и онкогенной сигнальнойпередачей 10. Аналогично, при колоректальном раке (CRC) повышенное лактилирование H3K18 стимулирует прогрессирование опухоли через усиленную транскрипцию энхансера аутофагии, подобного Рубикону (RUBCNL), тем самым способствуя созреванию аутофагосом и поддерживая выживаемость раковыхклеток 11.

Помимо прямого влияния на агрессивность опухоли, лактилирование также опосредует перепрограммирование метаболизма опухоли, регулируя экспрессию и активность генов, связанных сметаболизмом 7. При немелкоклеточном раке лёгких (НМРЛ) гистонная лактилирование снижает показатели ферментов, связанных с гликолизом, одновременно усиливая ферменты цикла трикарбоновой кислоты (ТЦА), усиливая поглощение глюкозы опухолями и усугубляя метаболическуюдисрегуляцию 12. Постоянно, глобальное профилирование лактилома показывает, что лактилирование преимущественно нацелено на ферменты, участвующие в центральных метаболических путях, включая метаболизм глюкозы, цикл ТКА, метаболизм аминокислот/жирных кислот, и эти модификации тесно коррелируют с агрессивными фенотипамиопухолей 7.

Важно отметить, что биологические последствия лактилирования сильно зависят от участка, и эта модификация стала ключевым фактором терапевтической устойчивости к опухоли. При КРК лактилирование мейотической рекомбинации 11 (MRE11) K673 усиливает восстановление гомологичной рекомбинации (HR), тем самым придавая устойчивость к химиотерапии и ингибиторам поли(ADP-рибоза)полимеразы (PARP) 13. При глиобластоме (GBM) взаимодействие между членом семейства альдегиддегидрогеназы 1 A3 (ALDH1A3) и пируваткиназой M2 (PKM2) повышает выработку лактата, что впоследствии вызывает лактилирование K247 кросс-комплементающего белка 1 (XRCC1) с рентгеновской репарацией для усиления восстановления повреждений ДНК, тем самым повышая радиорезистентность и химорезистентность темозоломида (TMZ) 14. Эти исследования в совокупности подчёркивают, что точный контроль лактилирования при определённых остатках лизина необходим для механистической диссекции и терапевтического таргетинга.

Достижения в высокоразрешающей масс-спектрометрии выявили широкое распространение лактилирования в метаболических ферментах, транскрипционных факторах и сигнальных преобразователях, что подчеркивает её широкую роль в контроле метаболизма, передачи сигналов и клеточнойфизиологии 15,16,17,18. На сегодняшний день было сообщено о нескольких ферментах-авторах, катализирующих лактилирование — например, AARS1 опосредует лактилирование p53 для стимулированияопухологенеза 19, а AARS1/2 регулирует лактилирование cGAS для подавления врожденного иммунитета — однако эти ферменты являются субстрат-селективными и в настоящее время не могут достичь полностью сайт-специфического лактилирования на произвольныхбелках 20. Таким образом, область по-прежнему сталкивается с тем, как манипулировать Klac целенаправленно для исследований или терапевтических целей.

Функциональные исследования по-прежнему преимущественно опираются на мутагенез, направленный на сайт — обычно с заменой лизина (K) на глутамин (Q) для имитации незаряженного состояния модификаций ацил-лизина, таких как ацетилирование илилактилирование 21,22,23,24. Однако этот подход имеет значительные ограничения в точном воспроизведении нативного лактилирования: химическая структура и геометрия боковых цепей глутамина отличаются от латилированного лизина, и, что важно, замена K на Q не может отличить ацетилированные и лактилированные состояния, когда обе модификации могут происходить в одном и том же месте.

Расширение генетического кода (GCE) предоставляет мощное решение этих ограничений, позволяя непосредственно включать неканонические аминокислоты в белки на определённых участках. С помощью положительного скрининга мутантной библиотеки метаносарцины mazei pyrrolysyl-tRNA synthetase (MmPylRS) мы ранее выявили вариант с ростом, зависящим от Klac. Этот мутант, обладающий мутациями L301M, Y306L, L309A и C348F, получил обозначение KlacRS125,26. KlacRS1 аминоацилирует свою родственную ортогональную тРНК с Klac, подавляет янтарный стоп-кодон и обеспечивает эффективное, специфическое для сайта включение Klac в целевые белки. В дополнение к KlacRS1, сообщалось о нескольких других вариантах aaRS, способных использовать Klac, включая LacKRS на базе MbPylRS (L270I/Y271L/L274A/C313F) и LacKRS3 (Y271M/C313S)19,27, а также LacKRS (C348T/Y384F)28, основанный на MmPylRS. Вместе эти инструменты создают универсальный генетический набор для получения местно-специфических лактилированных белковых вариантов для понимания биологических последствий отдельных лактилирования.

В наших предыдущих исследованиях мы применяли эту систему на основе GCE для экспрессии белков ALDOA с сайт-специфической лактилированием в Lys147 как в клетках E. coli, так и у млекопитающих. Функциональные анализы показали, что лактилирование в Lys147 оказывает отрицательный обратный эффект на гликолиз, повышает термическую и химическую стабильность ALDOA и способствует его транслокации из цитоплазмы в ядро. Эти результаты не только выявили ранее неизвестный регуляторный механизм ALDOA, но и подтвердили устойчивость, универсальность и практическую полезность этой сайт-специфической платформы лактилирования25,26. Опираясь на эту основу, здесь мы используем человеческую энолазу-1 (hENO1) и суперпапочный GFP (sfGFP) в качестве репрезентативных примеров для описания упрощённой стратегии точного включения Klac с использованием нашей ортогональной системы KlacRS/tRNA.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Янтарная стоп-котагенез для генетического кодирования лактиллизина в целевой ген.

  1. Ввести янтарный стоп-кодон TAG в позиции 89 гена hENO1 и в позиции 149 генаs-fGFP посредством мутагенеза, направленной на сайт, следуя протоколу производителя, очистить продукт ПЦР и выполнить гомологичную рекомбинацию. Используйте следующие праймеры:
    ENO1-K89TAG-F CACAGAACAAGAGtagATTGACAAACTGATGATCGAG
    ENO1-K89TAG-R TctaCTCTTTTGTTCTGTGACGTTCAGTTTTTTGG
    sfGFP-N149TAG-F CAACAGCCATtagGTGTATATATCACCGCCCAAGC
    sfGFP-N149TAG-R CACctaATGGCTGTTGAAGTTATACTCCAGC
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для местно-специфичного включения лактилированного лизина целевая зона должна мутировать в янтарный стоп-кодон (TAG) или другие бессмысленные кодоновы, а TAA или TGA должны использоваться в качестве настоящего стоп-кодона.
  2. Разморозить клетки с DH5α на льду, смешать 5 мкл рекомбинационного продукта с 50 мкл клеток и инкубировать на льду в течение 30 минут. Подвергните смесь тепловому удару 45 секунд при 42 °C, затем поставьте на лёд на 2-3 минуты. Добавьте 350 мкл LB среднего вещества и инкубуйте при 37 °C с встряхиванием (220 об/мин) в течение 1 часа.
  3. Распределите клетки на предварительно нагретую LB-пластину с ампициллином и инкубировать при 37 °C в течение 12–16 часов. Выберите две отдельные колонии для секвенирования Сэнгера, чтобы подтвердить мутацию.

2. Экспрессия лактилированного белка в клетках E. coli

  1. Ко-трансформировать 50 мкл химически компетентных клеток E. coli DH10B с примерно 100 ng pBad-ENO1-K89TAG, кодирующего целевой ген, и pEvol-MmKlacRS1 (плазмида Addgene # 232157), кодирующего пару KlacRS и tRNA.
  2. Инкубировать смесь на льду в течение 25 минут, поддержать тепловой шок при 42 °C 45 секунд и вернуться во льд на 3 минуты. Добавьте 350 мкл среды комнатной температуры LB, энергично встряхните при 220 об/мин в течение 1 часа при 37 °C.
  3. Распределять клеточную культуру на LB/пластину, дополняя 100 мкг/мл ампициллина (ампер 100) и 50 мкг/мл хлорамфеникола (50 см). Инкубировать пластины при 37 °C в течение 12-16 часов.
  4. Выберите одну колонию для инокуляции стартовой культуры объёмом 4 мл и инкубировать за ночь. На следующий день расширите ночную культуру до 400 мл LB/Amp100см50 , а затем интенсивно встряхивайте при 220 об/мин, 37 °C, пока OD 600 не достигнет 0,6-0,8.
  5. Индуцировать с помощью 0,2% L-арабинозы и 1 мМ Klac; инкубировать при 30 °C, 220 об/мин в течение дополнительных 16 часов.

3. Генетическое кодирование лактиллизина в клетках HEK 293T

  1. Семенные клетки в пластинах с 12 лунками плотностью 1 x 105 ячеек на колодцу с 1 мл среды DMEM. Через 24 часа инкубации, когда слияние клеток достигает 70%-80%, выполняет трансфекцию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для трансфекции рекомендуется конфлекция 70%-80%, тогда как для формирования колоний требуется более низкая плотность посева, что следует определить эмпирически.
  2. Для приготовления разбавленного раствора ДНК добавьте 0,75 мкг pcDNA-sfGFP-N149TAG и pNeu-KlacRS (плазмида Addgene # 232155) в соотношении 1:1 в 38 мкл безсывороточного DMEM с высоким содержанием глюкозы. Аккуратно поднимайте и опускайте пипетку или ненадолго вихрь для смешивания.
  3. Для приготовления разбавленного трансфекционного реагента добавьте 2,25 мкл трансфекционного реагента в 38 мкл безсывороточного DMEM с высоким содержанием глюкозы. Аккуратно поднимайте и опускайте 3-4 раза, чтобы смешать.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Возможность использования Opti-MEM зависит от инструкций производителя, так как его содержание сыворотки может снижать эффективность трансфекции.
  4. Разбавленный трансфекционный реагент сразу же добавьте в разбавленный раствор ДНК сразу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не смешивайте растворы в обратном порядке.
  5. Сразу же поднимаю и опускаю 3-4 раза или ненадолго вихрь для смешивания. Инкубировать 10-15 минут при комнатной температуре, чтобы сформировать трансфекционные/ДНК-комплексы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трансфекционный/ДНК-комплекс следует использовать в течение 20 минут после подготовки.
  6. Добавляйте 50 мкл трансфекцию/ДНК-смесь капельно в среду в каждую скважину и униформируйте смесь, аккуратно помещая пластину.
  7. Через 6 часов после трансфекции замените среду на свежую DMEM с 1 мМ Клак. Культура на 24-48 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Согласно нашим предыдущим данным, Klac при концентрациях 1-5 мМ не проявил цитотоксического эффекта наклетки 26. Рабочая концентрация Klac должна быть оптимизирована с учетом уровня экспрессии белка. Если целевой белок склонен к потере модификации лактилирования, рекомендуется введение ингибиторов HDAC (например, трихостатин A) или ингибитора сиртуина NAM (никотинамида).

4. Очистка лактилированного белка с помощью His-метки в клетках E. coli

  1. Собирайте клетки центрифугированием при 6 900 г в течение 10 минут при 4 °C. Ресуспензия в 50 мл лизисного буфера (20 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 200 мМ NaCl). Лизировать ультразвуковым эффектом на льду на 3 с импульса, 8 с интервалом при 200 Вт в течение 30 минут. Центрифугуйте при 13 800 x g, 4 °C в течение 30 минут, затем собирайте супернатант.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если целевой белок подвержен механическому сдвигу, этап ультразвуковой обработки можно заменить мягким лизом клеток с использованием разработанного реагента для экстракции белка, подходящего для E. coli.
  2. Фильтруйте супернатант через мембрану диаметром 0,45 мкм для сбора растворимых фракций. Загрузите очищенные лизаты на гравитационную колонку Ni-NTA объемом 1 мл. Промывайте примерно 5 мл буфера A (20 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 200 мМ NaCl,
    5 мМ имидазол), пока в элуате не обнаруживается обнаруживаемый белок. Элюируйте белок с помощью 1 мл буфера B (20 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 200 мМ NaCl, 200 мМ имидазола) в течение 5 раз. Сохраняйте все дроби. Проверьте наличие элюированного белка с помощью быстрого анализа Bradford.
  3. Объединить очищенные фракции белка и провести буферный обмен в буфер хранения (20 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 150 мМ NaCl). Аликвот концентрированные белки в 50 мкл в каждой трубке, быстро заморозьте и храните при -80 °C для следующего анализа.

5. Биохимическая характеристика лактилированного белка

  1. SDS-PAGE и вестерн блоттинг
    1. Разделите белок по SDS-PAGE (90 В на 20 минут, затем 150 В на 50 минут). Окрашивайте гель Coomassie Blue, нагревайте 15 секунд в микроволновке и очищайте окрашивающим раствором (40% абсолютного этанола, 10% ледниковой уксусной кислоты и 50% деионизированной воды) на шейкере (50 об/мин, 15 мин). Повторяйте этап очистки, пока белковые полоски не станут чётко видны.
    2. Активируйте мембрану PVDF в метаноле на 1 минуту. Соберите стопку переноса в порядке: губка, фильтрующая бумага, гель, мембрана, фильтрующая бумага, губка. Проводите передачу на 250 мА в течение 1 часа в предварительно охлаждённом буфере. Заблокируйте мембрану 5% обезжиренным молоком на 1,5 часа, затем три раза промывайте TBST (по 10 минут каждая).
    3. Инкубировать первичными антителами (Анти-Его 1:10 000; Анти-L-лактиллизин 1:1 000) при 4 °C ночью. Мойте 3 раза с TBST.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальные коэффициенты разбавления следует определить эмпирически для антител, полученных из различных коммерческих источников.
    4. Инкубировать с вторичным антителом к кролику (1:10 000) в течение 1,5 часа при комнатной температуре. Мойте 3 раза с TBST. Снимок с использованием хемилюминесценции и сохранения данных в Image Lab.
  2. Масс-спектрометрический анализ
    1. Для анализа целостной массы разведите белки до конечной концентрации 0,1 мкг/мкл водой с 0,1% муравьиной кислотой (FA), а затем подвергите их работе с ультравысокоэффективной жидкостной хроматографией (UPLC). Подвижная фаза состояла из растворителя A (0,1% FA в воде) и растворителя B (ацетонитрил, ACN) с расходом 0,3 мл/мин.
    2. Измерьте молекулярные массы hENO1-89Klac с помощью высокоразрешающего масс-спектрометра с квадрупольным временем полёта (Q-TOF) с диапазоном m/z, установленным на 300-2000. Собирайте и обрабатывайте все данные с помощью программного обеспечения MassLynx.
    3. Для протеомного анализа анализируйте переваренные клеточные лизаты, как было описано ранее, используя систему жидкостной хроматографии нанопотока, в сочетании с высококачественным трибридным масс-спектрометром, оснащённым анализатором. Подвижная фаза состояла из растворителя A (0,1% FA в воде) и растворителя B (ACN/вода, 8:2, v/v) при расходе 300 nL/мин.
    4. Отдельные пептиды на капиллярной колонке C18 с обратной фазой (75 мкм x 250 мм) с градиентом 90 мин: 3%-8% B (0-5 мин), 8%-28% B (5-60 мин), 28%-38% B (60-75 мин), 38%-100% B (75-80 мин) и 100% B (80-90 мин). Получить спектры MS1 по m/z 350-1800 с разрешением 120 000 и целевой AGC 4e5. Генерировать спектры MS2 с помощью фрагментации с более высокой энергией коллизионной диссоциации (HCD) (энергия столкновения = 32%), первая масса m/z 110, разрешение 30 000 и целевой AGC 5e4.
  3. Анализ потоковой цитометрии
    1. Промывайте ячейки дважды с предварительно охлаждённым буфером PBS, затем центрифугайте при 1 380 г в течение 3 минут после каждой мойки. Суспензировать клеточную гранулу, полученную после центрифугирования в 500 мкл буфера PBS, и аккуратно пипетить для смешивания. Фильтруйте суспензию клетки через стерильную марлю на 300 сеток, соберите фильтрат в проточную цитометрическую трубку, чтобы минимизировать помехи от агрегатов клеток во время обнаружения. Проанализировать подготовленный образец с помощью потокового цитометра с двойными лазерами, с возбуждением на 405 нм и обнаружением на 488 нм соответствующих флуоресцентных сигналов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сначала мы оценили специфичность включения Klac в белки E. coli. Ген человеческой энолазы 1 (hENO1) был спроектирован так, чтобы содержать янтарный стоп-кодон в остатке K89 (hENO1-89TAG), и эта конструкция была коэкспрессирована с ортогональной KlacRS и её родственной парой тРНК в E. coli. При отсутствии добавления 1 mM Klac полноразмерный hENO1 не был обнаружен; для сравнения, при добавлении 1 мМ Klac в среду роста, был получен полноразмерный hENO1 с Klac в позиции 89 (hENO1-89Klac) с выходом ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем стратегию сайт-специфичного включения Klac в белки как прокариотических, так и эукариотических клеток. Вводя янтарный стоп-кодон в желаемую позицию ген-мишени и соэкспрессируя его с ортогональной парой KlacRS/тРНК в клетках хозяина, подлинный лактиллизин может быть точно интегрирован в белки живых клеток, предоставляя мощный инструмент для исследования биологии, специфичной для лактилирования.

Мы продемонстрировали осуществимость этого рабоч...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликтов интересов, которые нужно раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (22377058), междисциплинарным финансированием синтетической биологии в традиционной китайской медицине Нанкинским университетом китайской медицины и Национальной программой поддержки высокоуровневых талантов (программа 10 000 талантов) — молодые таланты.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
6*his, его метка Рекомбинантный моноклональный антителProteintech84814-1-RRКласс специфических иммуноглобулинов, нацеленных на 6 и раз; Его метка (короткий пептид, состоящий из шести последовательных остатков гистидина, HHHHHH) в рекомбинантных белках.
Система ACQUITY UPLCВодыУльтрапроизводительная жидкостная хроматография
Анти-L-лактиллизин кролик mAbPTM BiolabsPTM-1401RMКласс специфических иммуноглобулинов, нацеленных на L-лактиллизин (Klac), посттрансляционную модификацию (PTM) белков.
Комплект клонирования ClonExpress II для одного шагаVazyme C112Основываясь на простой, быстрой и эффективной технологии бесшовного клонирования ДНК, вставные фрагменты могут быть направлено клонированы в любой участок любого вектора.
Потоковый цитометр CytoFlexБекман КоултерПотоковый цитометр с высокочувствительным обнаружением и возможностью многоцветного анализа
DH10BБиокроликEC005H-SТип компетентных клеток для трансформации плазмид, клонирования генов и сине-белого скрининга.
DH5 и альфа;Vazyme C502Тип компетентных клеток для трансформации плазмид, клонирования генов и сине-белого скрининга.
Система EASY-nano LC 1200Термо Фишер Сайентификнаножидкостная хроматография для разделения высокочувствительных, высокоразрешающих сложных образцов
Мас-спектрометр Orbitrap Eclipse Eclipse TribridТермо Фишер Сайентификфлагманская система высококлассной трибридной жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (LC-MS)
Phanta Max сверхточная ДНК-полимеразаVazyme P505Высокоточный один фермент, сочетающий быстрое усиление и точность
PolyJetSignaGenSL100688Реагент PolyJet DNA In Vitro разработан как мощный трансфекционный реагент, обеспечивающий эффективную и воспроизводимую трансфекцию с меньшей цитотоксичностью.

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, D., et al. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation. Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).
  2. Yu, J., et al. Histone lactylation drives oncogenesis by facilitating m6A reader protein YTHDF2 expression in ocular melanoma. Genome Biol. 22 (1), 85(2021).
  3. Pan, L., et al. Demethylzeylasteral targets lactate by inhibiting histone lactylation to suppress the tumorigenicity of liver cancer stem cells. Pharmacol Res. 181, 106270(2022).
  4. Xu, H., et al. Royal jelly acid suppresses hepatocellular carcinoma tumorigenicity by inhibiting H3 histone lactylation at H3K9la and H3K14la sites. Phytomedicine. 118, 154940(2023).
  5. Chai, P., Zhao, F., Jia, R., Zhou, X., Fan, X. Lactate/lactylation in ocular development and diseases. Trends Mol Med. 31 (12), 1073-1076 (2025).
  6. Wang, G., et al. The relationship and clinical significance of lactylation modification in digestive system tumors. Cancer Cell Int. 24 (1), 246(2024).
  7. Yang, Z., et al. Lactylome analysis suggests lactylation-dependent mechanisms of metabolic adaptation in hepatocellular carcinoma. Nat Metab. 5 (1), 61-79 (2023).
  8. Chen, L., et al. Lactate-lactylation hands between metabolic reprogramming and immunosuppression. Int J Mol Sci. 23 (19), 11943(2022).
  9. Sun, X., et al. The diapause-like colorectal cancer cells induced by smc4 attenuation are characterized by low proliferation and chemotherapy insensitivity. Cell Metab. 35 (9), 1563-1579 (2023).
  10. Yang, J., et al. A positive feedback loop between inactive VHL-triggered histone lactylation and PDGFRβ signaling drives clear cell renal cell carcinoma progression. Int J Biol Sci. 18 (8), 3470-3483 (2022).
  11. Li, W., et al. Tumor-derived lactate promotes resistance to bevacizumab treatment by facilitating autophagy enhancer protein Rubcnl expression through histone H3 lysine 18 lactylation (H3K18la) in colorectal cancer. Autophagy. 20 (1), 114-130 (2024).
  12. Jiang, J., et al. Lactate modulates cellular metabolism through histone lactylation-mediated gene expression in non-small cell lung cancer. Front Oncol. 11, 647559(2021).
  13. Chen, Y., et al. Metabolic regulation of homologous recombination repair by MRE11 lactylation. Cell. 187 (2), 294-311 (2024).
  14. Li, G., et al. Glycometabolic reprogramming-induced XRCC1 lactylation confers therapeutic resistance in ALDH1A3-overexpressing glioblastoma. Cell Metab. 36 (8), 1696-1710.e10 (2024).
  15. Liberti, M. V., Locasale, J. W. The warburg effect: How does it benefit cancer cells. Trends Biochem Sci. 41 (3), 211-218 (2016).
  16. Varner, E. L., et al. Quantification of lactoyl-CoA (lactyl-CoA) by liquid chromatography mass spectrometry in mammalian cells and tissues. Open Biol. 10 (9), 200187(2020).
  17. Chen, Y., et al. Metabolic regulation of homologous recombination repair by MRE11 lactylation. Cell. 187 (2), 294-311.e21 (2024).
  18. Chen, H., et al. NBS1 lactylation is required for efficient DNA repair and chemotherapy resistance. Nature. 631 (8021), 663-669 (2024).
  19. Zong, Z., et al. Alanyl-trna synthetase, AARS1, is a lactate sensor and lactyltransferase that lactylates p53 and contributes to tumorigenesis. Cell. 187 (10), 2375-2392.e33 (2024).
  20. Ju, J., et al. The alanyl-tRNA synthetase AARS1 moonlights as a lactyltransferase to promote YAP signaling in gastric cancer. J Clin Invest. 134 (10), e174587(2024).
  21. Sun, L., et al. Lactylation of METTl16 promotes cuproptosis via m6A-modification on FDX1 mRNA in gastric cancer. Nat Commun. 14 (1), 6523(2023).
  22. Mao, Y., et al. Hypoxia induces mitochondrial protein lactylation to limit oxidative phosphorylation. Cell Res. 34 (1), 13-30 (2024).
  23. Lv, L., et al. Mitogenic and oncogenic stimulation of K433 acetylation promotes PKM2 protein kinase activity and nuclear localization. Mol Cell. 52 (3), 340-352 (2013).
  24. Okada, A. K., et al. Lysine acetylation regulates the interaction between proteins and membranes. Nat Commun. 12 (1), 6466(2021).
  25. Wan, N., et al. Cyclic immonium ion of lactyllysine reveals widespread lactylation in the human proteome. Nat Methods. 19 (7), 854-864 (2022).
  26. Shao, C., et al. Genetic code expansion reveals site-specific lactylation in living cells reshapes protein functions. Nat Commun. 16 (1), 227(2025).
  27. Sun, Y., et al. Genetic encoding of ε-N-L-lactyllysine for detecting delactylase activity in living cells. Chem Commun (Camb). 58 (61), 8544-8547 (2022).
  28. Ren, C., et al. Expanding the scope of genetically encoded lysine post-translational modifications with lactylation, β-hydroxybutyrylation and lipoylation. Chembiochem. 23 (18), e202200302(2022).
  29. Hu, Y., et al. Engineering unnatural cells with a 21st amino acid as a living epigenetic sensor. Nat Commun. 16 (1), 9388(2025).
  30. Elsasser, S. J., Ernst, R. J., Walker, O. S., Chin, J. W. Genetic code expansion in stable cell lines enables encoded chromatin modification. Nat Methods. 13 (2), 158-164 (2016).
  31. Zhu, W., Fan, C., Hou, Y., Zhang, Y. Lactylation in tumor microenvironment and immunotherapy resistance: New mechanisms and challenges. Cancer Lett. 627, 217835(2025).
  32. Mills, E. M., Barlow, V. L., Jones, A. T., Tsai, Y. H. Development of mammalian cell logic gates controlled by unnatural amino acids. Cell Rep Methods. 1 (6), 100073(2021).
  33. Italia, J. S., et al. Genetically encoded protein sulfation in mammalian cells. Nat Chem Biol. 16 (4), 379-382 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Escherichia coli

Похожие статьи