Этот экспериментальный протокол демонстрирует модель крыс с канюлированием глубокошейного лимфатического канала, которая позволяет напрямую и количественно оценивать лимфатический дренаж из головной области. Модель позволяет проводить детальный анализ растворённых веществ, полученных из центральной нервной системы (ЦНС), популяций иммунных клеток, а также распределения и очищения терапевтических средств, направленных на ЦНС.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Модель крыс с канюлированием шейных лимфатических протоков для оценки лимфатического транспорта из головы и мозга
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Лимфа течёт из центральной нервной системы (ЦНС) через серию лимфатических сосудов (ЛЖ) и лимфатических узлов, сходящихся в шейных лимфатических протоках. Помимо поддержания жидкостного баланса, эти лимфатические протоки играют ключевую роль в транспортировке широкого спектра веществ, включая эндогенные метаболиты, сигнальные молекулы, иммунные клетки, а также малые и макромолекулярные препараты. Это критически важно для физиологического гомеостаза и иммунной функции как внутричерепной (например, мозг), так и экстракраниальных областей (например, носовой и ротовой полости). Нарушение лимфатического дренажа из мозга всё чаще связывают с рядом неврологических и нейродегенеративных заболеваний. Каннуляция шейных лимфатических протоков позволяет собирать лимфу, дренирующую голову и мозг, измеряя концентрацию и скорость транспортировки различных веществ через лимфатическую систему. Также можно определить изменения этих факторов в ответ на различные проблемы (например, лекарства, стресс, травмы) и заболевания (например, инсульт, инфекция, болезнь Альцгеймера). Здесь мы описываем модель крыс с глубокой канюлированностью шейных лимфатических протоков, которая позволяет собирать лимфу в течение нескольких часов после операции. Метод может сочетаться с визуализацией и мультиомическими технологиями для измерения широкого спектра интересующих параметров в лимфе. Это способствует фундаментальным физиологическим и патофизиологическим исследованиям области головы и шеи, а также фармакокинетическим/фармакодинамическим исследованиям лекарств, особенно для лечения заболеваний ЦНС.
Введение
Лимфатическая система, распределённая по всему организму, необходима для поддержания гомеостаза жидкости, регулирования иммунных ответов и облегчения транспортировки питательных веществ и сигнальныхмолекул 1. Периферические лимфатические органы начинаются в лимфатических капиллярах, которые собирают межстинциальную жидкость и растворённые вещества и стекают в более крупные собирающие лимфатические сосуды (ЛЖ), обладающие окружающим гладкомышечным слоем; Эти сосуды затем доставляют лимфу в местные лимфатические узлы для иммуннойобработки 2,3. Лимфатическая сеть, дренирующая область головы, важна для гомеостаза как внутричерепных (например, мозговых), так и экстракраниальных (например, носовые и ротовые полости) органов. Структура и организация экстракраниальной лимфатической сети, как считается, напоминают структуру периферических лимфатических систем по всему телу, тогда как внутричерепная лимфатическая система обладает уникальными анатомическими и функциональными особенностями (см. рисунок 1 для подробного схематического представления в моделях крыс)4,5. Хотя типичные ЛЖ отсутствуют в паренхиме мозга, функции, похожие на лимфо, опосредованы специализированной глиально-зависимой лимфатической транспортной системой (глимфатической), которая способствует обмену между спинномозговой жидкостью (СМС) и интерстициальной жидкостью (ISF)6. В то время как глимфатическая система позволяет смешивать ISF внутри паренхимы мозга с ликвором, менингеальные, периваскулярные и носоглоточные ЛЖ транспортируют растворённые вещества из спинномозговой жидкости из черепной полости. В частности, менингеальный лимфатический путь направляет СМВ из субарахноидального пространства в менингеальные ЛЗ, связывая динамику внутричерепной жидкости с периферическим лимфатическимклиренсом 7. Параллельно периневральные пути способствуют вытоку СМЖ и сопутствующих веществ вдоль оболочек черепных и спинномозговых нервов, наиболее заметно через обонятельные нервы в носоглоточный лимфатическийсплетение 5,8. Параллельная работа этих систем поддерживает гомеостаз жидкости в мозге 6,7,8. Недавние достижения в понимании лимфатической системы, дренирующей ЦНС, дали новые знания о физиологии и патофизиологии мозга. Эти результаты могут открыть новые пути терапевтического вмешательства при заболеваниях центральногонервного нерва 9.
Рисунок 1: Схематическое представление путей клиренса ЦНС. Эти пути включают: (A) глимфатический путь через периваскулярные пространства; (B) носоглоточный лимфатический путь и (C) менингеальные LV. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.
Лимфатические сети, стекающие из головы и ЦНС, сходятся в шейные лимфатические протоки, расположенные в шее, где лимфа фильтруется через шейные лимфатические узлы перед попаданием в системный кровообращение. Шейные лимфатические узлы классифицируются на поверхностные (sCLN) и глубокие шейные лимфатические узлы (dCLN) в зависимости от их анатомического расположения в шее. Изменения в составе лимфатической жидкости в шейных лимфатических протоках считаются отражающими скрытые патофизиологические различия в мозге, при этом примерами являются болезнь Альцгеймера (AD), болезнь Паркинсона (PD), травматическое повреждение мозга (TBI) и когнитивные нарушения после инсульта (PSCI) 9,10,11,12,13 . Примечательно, что при AD нарушение дренажа амилоидного β (Aβ) и фосфорилированных белоков тау (P-tau) через эти лимфатические пути считается фактором, способствующим прогрессированиюзаболевания 9,10,14. Прямое соединение лимфатических протоков с соседними венами для перенаправления лимфатического дренажа исследуется лимфатический венозный анастомоз (ЛВА) как у животных, так и у людей как терапевтическая стратегия для усиления лимфатического оттока из ЦНС, что способствует очищению Aβ от мозга и, возможно, задерживает прогрессирование 6,15,16 н.э.. Важность этого пути дополнительно иллюстрируется наблюдениями у мышей, подвергшихся хирургическому удалению шейных лимфатических узлов (лимфаденэктомии), что привело к снижению клиренса шейного лимфатического отверстия. Нарушение клиренса приводит к токсическому накоплению Aβ и P-тау, что приводит к последующей активации патологических сигнальных путей киназ. Эти изменения связаны с постепенным ухудшением тауопатии, похожей на АД, и повышенным риском тревожного и депрессивного поведения14,16. Кроме того, исследования, основанные на ЦСФ, показывают, что опухоли ЦНС, такие как лимфомы мозга, могут физически блокировать лимфатический клиренс через глубокие шейные лимфатические протоки, одновременно повышая концентрацию онкопротеинов в ликворовойжидкости 9,17,18. Данные исследований, основанных на воспалении ЦНС, также указывают на то, что клетки, происходящие из менингеальных мозгов, могут мигрировать через менингеальные ЛЖ к шейным лимфатическимузлам 8,19. Эти клетки состоят преимущественно из лимфоцитов, с меньшими популяциями дендритных клеток, макрофагов и эндотелиальныхклеток 19,20. Во время воспаления или после повреждения ЦНС или операции трафик лимфатических иммунных клеток явно усиливается, сопровождаясь повышенным уровнем иммунных биомаркеров, таких как цитокина, хемокины и другие воспалительныемедиаторы 21.
Помимо своей патофизиологической роли, шейная лимфатическая сеть всё больше признаётся важным каналом для распределения препаратов. Предыдущие исследования на животных показали, что несколько препаратов, предназначенных для введения ЦНС, могут проходить очищение из мозга через шейные лимфатические протоки и лимфатические узлы (в разной степени), что проявляется в виде внутримозгового введения наночастиц (например, ламотригин, талазопариб) и биологических препаратов (например, моноклональные антитела, радиометированные трассерные белки)22,23,24,25. У людей исследования МРТ показали, что определённые молекулы, такие как гадобутрол, проходят активный транспорт из глимфатической системы в шейные лимфатическиепротоки 26.
Как уже упоминалось, шейные лимфатические узлы, как sCLN, так и dCLN, отводят лимфу из отдельных областей головы; однако конкретные черепные области, дренированные каждым узлом, остаютсянеясными 27,28. Перекрывающиеся дренажные участки, межиндивидуальная анатомическая вариабельность и возможные межвидовые структурные различия дополнительно усложняют описание схем дренажа шейного лимфатического отвода как у животных, так иу человека 29. Внутри сложной шейной лимфатической сети глубокие шейные лимфатические протоки были выявлены как основные пути оттока для СМЖ, расположенные ниже по течению от носоглоточных и менингеальныхLV 8. По сравнению с поверхностными шейными лимфатическими протоками, которые образуют тонкие и вариабельные сети в подкожной ткани и сильно различаются по размеру и ветвлениям между отдельными крысами, глубокий шейный лимфатический проток предлагает более доступный и практичный путь для сбора лимфы, полученной из ЦНС, в моделях мелкихживотных 20,30. Таким образом, текущий протокол направлен на создание надёжного метода сбора лимфы из глубокого шейного лимфатического протока.
Лишь ограниченное количество исследований, проведённых за последнее десятилетие, описывало сбор шейных лимфатических жидкостей для изучения заболеваний ЦНС или анализа распределения лекарств. В предыдущем исследовании описывалось измерение концентрации препаратов в шейной лимфе путём промыва или выжимания жидкости из изолированных срезов ткани (например, прилегающих к одному dCLN)31. Однако экспериментальные протоколы непрерывного сбора лимфы из шейных лимфатических протоков у мелких лабораторных животных, особенно крыс, остаются недоработанными. Этот протокол устанавливает легко доступный и воспроизводимый метод канюляции шейного лимфатического протока (крысы) для обеспечения непрерывного сбора лимфы и изучения лимфатического транспорта ЦНС, иммунных ответов и фармакокинетики. Её ключевое преимущество заключается в способности количественно оценивать поток и состав лимфов за определённые временные интервалы, что позволяет количественно измерять лекарства, липиды, жирные кислоты и клеточные компоненты. В частности, эта модель отражает процессы лимфатического транспорта, которые недостаточно представлены методами отбора проб или визуализации ЦНС, предлагая новые данные о распределении препаратов в ЦНС, транспорте липидов и питательных веществ, а также иммуннойсигнализации 20.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Процедуры, описанные в этом протоколе, были одобрены университетским комитетом по этике животных и выполнены в соответствии с экспериментальными этическими рекомендациями Китайского фармацевтического университета. Перед началом любых процедур, связанных с животными, получите необходимые разрешения от соответствующего институционального или организационного комитета по этике. В качестве экспериментальных животных используются самцы крыс Sprague-Dawley (SD) весом от 220 до 250 г. Животные закупаются у авторизованных поставщиков экспериментальных животных (см. таблицу материалов) и содержатся в специализированных клетках с бесплатным доступом к корму и воде до начала эксперимента. В этом протоколе каннулирование левого глубокого шейного лимфатического протока описывается как репрезентативный пример. В настоящее время существует ограниченное количество данных, описывающих анатомические различия между глубокими шейными лимфатическими протоками левой и правой сторон. На основании наблюдений из ранее проведённых экспериментов существенных различий между двумя сторонами, включая скорость лимфического потока, не выявлено.
1. Меры предосторожности и процедуры
- Выполнять все процедуры в соответствии с институциональными рекомендациями по биобезопасности, и весь персонал должен пройти соответствующее обучение микрохирургическим техникам, экспериментальному обращению с животными и химической безопасности перед проведением этого протокола.
- На протяжении всей процедуры носите соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), включая лабораторный халат, хирургические перчатки и защитные очки. Поскольку используется летучий анестетик (изофлуран), который может вызвать депрессию центральной нервной системы и сердечно-сосудистую токсичность у людей при длительном воздействии, проводите процедуру в хорошо проветриваемой среде. В лабораторию нельзя приносить пищу и напитки, а также обеспечить доступность текущей воды в любое время.
- Обращайтесь со всеми острыми предметами, включая иглы для шприца, лезвия и микроножницы, и сразу после использования утилизируйте их в специальные контейнеры для острого предмета; ни при каких обстоятельствах одноразовые острые предметы не должны использоваться повторно.
- Относитесь ко всем биологическим образцам (например, собранным лимфам) и животным телесным жидкостям (например, крови) как к потенциально опасным, а также аккуратно обращайтесь со всем оборудованием для сбора предметов, не попадая в хирургическую зону. В случае случайного укола иглой или контакта кожи с опасными веществами немедленно промой поражённую область с мылом и водой и сообщи о происшествии в соответствии с институциональными протоколами безопасности.
2. Подготовка за день до операции
- Постите или кормите крыс в соответствии с требованиями конкретного эксперимента. Этот протокол не требует конкретного штата голодания или федерального режима.
- Приготовьте антикоагулянтный раствор, разбавляя гепарин или этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) до конечной концентрации 10 МЕ/мл. Предварительно загрузите эту смесь (примерно 0,7 мл) в стерильный инсулиновый шприц объёмом 1 мл с иглой 30 G, чтобы предварительно покрыть внутреннюю поверхность полиэтиленовой (PE) канюли (используемой для каннулирования лимфатических протоков). Храните эту готовую смесь в стерильных условиях до использования.
- Подготовьте канюли для сбора образцов лимфа, собрав канюлю из ПЭ в конфигурации «голова в хвост», используя трубку с внешним диаметром 0,5 мм (OD), внутренним диаметром 0,3 мм (ID) для обеих конечных секций и 0,6 мм OD, 0,5 мм ID для средней секции.
- Разрежьте сегменты канюли до длины 2 см для проксимальной части, соединяющей с иглой шприца, 40 см для средней части и 8 см для дистальной части, предназначенной для канюляции.
- Отрежьте и скошените дистальный конец канюли под углом примерно 45°, чтобы обеспечить плавное вставление в шейный лимфатический проток. См. рисунок 2 для подробной иллюстрации сборки канюлы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта фаска обеспечивает плавное вставление в лимфатический проток и снижает риск закупорки за счёт увеличения эффективной площади поперечного сечения. После успешной каннуляции проксимальная (2 см) секция отсоединяется, и лимфа собирается непосредственно с открытого проксимального конца средней секции (как подробно описано в шагах 4.9 и 4.10).
Рисунок 2: Схематическая схема сборки канюли (не в масштабе). Диаграмма иллюстрирует размеры каждого компонента собранной трубки PE, используемой для строительства канюлы. Слева направо собранная канюля далее будет называться соответственно проксимальным, средним и дистальным концом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.
- Подготовьте систему вдыхания анестезией, предварительно загрузив жидкий изофлуран в герметичный контейнер, оснащённый вапорайзером. Перед использованием проведите тестовый запуск (грунтование) вапорайзера, чтобы подтвердить герметичность и обеспечить стабильный и стабильный поток газа.
- При необходимости подготовьте кандидата на тест-препарат в подходящем автомобиле. Провести исследования устойчивости для подтверждения целостности формулы во время хранения и на протяжении всего периода введения. Включать дополнительные агенты (например, биологические красители, такие как Evans Blue), где это применимо.
- Подготовьте контейнеры к сбору лимфы, предварительно взвешивая стерильные микроцентрифугные трубки и записывая их первоначальный вес. Маркировать каждую трубку последовательно в соответствии с запланированными точками сбора (например, часовыми интервалами). Добавьте концентрированный гепарин (или EDTA) в каждую трубку и удаляйте растворитель с помощью испарения азота, оставляя от 2 до 5 МЕ высушенного гепарина (или EDTA) на трубку, чтобы предотвратить неравномерное разбавление собранной лимфы.
3. Подготовка непосредственно перед операцией
- Проверьте проездность каждой канюлы, промывая их приготовленным антикоагулянтным раствором. Подключите шприц к проксимальному концу собранной канюли и аккуратно выпустите небольшой объём раствора. Убедитесь, что раствор плавно выходит с дистального конца без признаков утечки. Если обнаружена протечка, как обычно указывается на выделение жидкости в точке соединения, полностью выбросить канюлю и восстановить новую согласно шагу 2.3.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап одновременно предварительно покрывает внутреннюю поверхность канюли антикоагулянтом (этот этап может проводиться и за день до операции, поэтому канюля предварительно покрыта на ночь). - Начните вводить ингаляционный изофлуран через носовую маску примерно за 5 минут до начала операции. Поддерживайте анестезию на протяжении всей процедуры со скоростью подачи от 0,4 до 0,6 л/мин при давлении 101,3 кПа при 20 °C. Убедите глубину анестезии, оценив реакцию на сжатие пальцев.
- Постоянно контролируйте глубину анестезии. Немедленно усыпить крысу, если появляются признаки дискомфорта или физиологической нестабильности.
- Расположите крысу на спине на подогреваемую хирургическую подложку с температурой 37 °C. Наклоните голову и вытяните шею, при необходимости используя небольшую подставку (подушку), чтобы максимально обнажить шейный отдел. Закрепите голову в анестезиологической маске для обеспечения непрерывной подачи изофлурана и аккуратно фиксируйте передние конечности резинками или хирургическими лентами для минимизации движений во время процедуры.
- Промывайте шерсть шейной области стерильным физиологическим раствором для облегчения бритья. Тщательно сбрийте всё хирургическое место (с двусторонним лезвием защитной бритвы), обычно шею и область ключицы, чтобы полностью удалить шерсть перед разрезом (см. рисунок 3A для примера выбритой области шеи).
- Очистите всю выбритую область дезинфицирующими средствами, например, содержащим йод.
- Отметьте место операции, проведя пунктирную линию шириной 2,5 см, чтобы подтвердить длину начального разреза. Разместите леску чуть правее средней линии тела крысы. Разместите верхний конец разреза примерно на 1–1,5 см ниже нижней губы (см. рисунок 3B для примера места разреза с помощью линейки).
Рисунок 3: Подготовка хирургического участка. (A) Область шеи бреется в подготовке к разрезу; (B) приблизительная длина и расположение разреза, обозначенные пунктирной линией длиной 2,5 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.
4. Канюляция шейного лимфатического протока
- Поставьте крысу так, чтобы её голова была направлена к оператору. Для этого этапа используйте микроскоп из-за относительно малого диаметра шейного лимфатического протока.
- С помощью стерильного скальпеля аккуратно разрезайте поверхностный слой шейной мышцы вдоль упомянутой отметки длиной 2,5 см, ориентированной почти параллельно средней линии (см. рисунок 4A для открытого поверхностного слоя кожи).
- Аккуратно отдельте оставшиеся мышечные слои, главным образом поверхностную шейную фасцию, чтобы обнажить шейную артерию, которая обычно отличается по красной окраске.
- Оттяните грудинномастовидную мышцу и подчелюстную железу и аккуратно наклоните их от хирургического поля для облегчения идентификации шейного лимфатического протока. Используйте тканевой экспандер для поддержания операционного окна и используйте ватную палочку, чтобы временно удерживать мышечную ткань, находя лимфатический узел и связанные с ним лимфатические протоки. Убедитесь, что тканевой экспандер на месте на протяжении всего процесса каннуляции (см. рисунок 4B для открытого хирургического окна с тканевым расширителем на месте).
- Определите шейный лимфатический проток (желательно под микроскопом): Проток выглядит как непрозрачный, бесцветный сосуд диаметром примерно 0,2–0,5 мм и проходит непосредственно параллельно сонной артерии. Один или несколько соседних, телесных dCLN часто можно наблюдать вдоль шейного лимфатического протока (см. рисунок 4C для микроскопического изображения открытого глубокого шейного лимфатического протока и прилегающего dCLN).
ПРИМЕЧАНИЕ: Шейные лимфатические протоки обычно имеют цвет, очень похожий на цвет окружающих тканей, и их идентификация часто требует тщательного осмотра, особенно у крыс с большим количеством жировой ткани. Для хирургических целей (но не для исследований лимфатического транспорта лекарств или эндогенных веществ) Эванс Блю может быть введён подкожно под шею в начале операции, чтобы шейный лимфатический проток был лучше визуализирован при выделении красителя через лимфатические каналы. - Используя пару тупых щипцов, аккуратно проведите через отделённые соединительные ткани и удержите щипцы в положении, чтобы шейный лимфатический проток оставался чётко видимым в хирургическом поле.
- Тщательно изолируйте шейный лимфатический проток от окружающих соединительных и жировых тканей с помощью тупой диссекции, особенно стараясь избежать повреждений, так как сосуд крайне хрупкий.
- Используйте пару микроножниц, чтобы сделать небольшой разрез в верхней половине открытого протока. Не отсоединяйте канал полностью; две половины должны остаться целыми.
- Проверьте и убедитесь, что подготовленная канюля, предварительно покрытая антикоагулянтным раствором (как описано в шаге 2.3), свободна от пузырьков воздуха, сделав мягкую промывку. Непосредственно перед введением аккуратно захватите дистальный конец канюли щипцем, направляя его так, чтобы скошенное лицо было направлено вверх. Затем аккуратно продвигайте канюлю примерно на 2 мм в проток через разрез, направляя её к голове (см. рисунок 4D для иллюстрации успешной каннуляции). Фактическая глубина ввода может варьироваться в зависимости от конкретной крысы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку установка канюли в этой процедуре относительно неглубокая, дополнительная точка фиксации в окружающей области может быть полезна. Это достигается с помощью ножниц, создав небольшой вторичный кожный прокол (отверстие) примерно в 1,5 см от хирургического окна. Это отверстие будет дополнительно стабилизироваться на следующих этапах (например, с помощью шва или клея). Рисунок 4E демонстрирует этот этап в контексте использования тканевого клея. Канюлю следует пропустить через отверстие, чтобы помочь закрепить её положение. - Отдельте инсулиновый шприц вместе с коротким (2 см) проксимальным сегментом канюли от остальной части канюлы. Лимфу затем можно собирать непосредственно с открытого проксимального конца среднего сегмента большего диаметра. Следите за дистальной верхушкой этого сбора сегмента в течение 1–2 минут. Подтвердите успешное канюляцию с помощью видимого, медленного и равномерного оттока лимфатической жидкости из канюлированного протока.
- После подтверждения успешности канюли закрепите канюлю, нанеся небольшую каплю клея для цианоакрилатной ткани с пипеткой как в месте разреза лимфатического протока, так и в вторичном фиксирующем отверстии (см. рисунок 4E для демонстрации фиксации канюлы). Будьте особенно осторожны, чтобы не закупорить сосуд или не ухудшить лимфопоток.
- Наблюдайте за лимфотоком в течение нескольких минут, чтобы подтвердить равномерный отток (видимая капля обычно образуется в конце канюли в течение минуты). После проверки аккуратно уберите расширитель тканей из хирургического окна и переместите поднижнюсть в исходное положение.
- Прикрепите заранее маркированную микроцентрифугальную трубку с антикоагулянтом (см. шаг 2.6) к дистальному концу канюли для сбора свободно текущей лимфы.
Рисунок 4: Каннулирование шейного лимфатического протока. (A) Место разреза в области шеи; (B) хирургическое окно, открытое с разширителем тканей на месте, а поднижняя нижняя железа втянута вправо; (C) шейный лимфатический проток и один dCLN, визуализируемый под микроскопом. (D) Успешная канюляция, обозначенная зелёной пунктирной линией (микроскопический вид). (E) На место разреза наносился тканевой клей, а вторичная кожная прокол с помощью пипетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.
5. Послеоперационный период и введение лекарств
- После завершения канюляции шейных лимфатических протоков переместите все мышечные слои на исходные места. Затем закройте кожный разрез швами и/или клеем для тканей; обычно разрез длиной 2,5 см можно правильно закрыть 8 швами (см. рисунок 5A для хирургического окна, закрываемого швом). После завершения этого этапа снимите ограничивающую резинку или хирургические ленты с передних конечностей.
- Вводите препараты в спинномозговую жидкость соответствующим путём, например, внутрицистерной магной (ICM), внутрицереброжелудочочной (ICV) или поясничной интратекальной (LIT) инъекцией. Используя введение ICM в качестве примера, определите место инъекции в cisterna magna, расположенное у основания черепа и видное как единственное мягкое углубление на дорсальной поверхности. Сбрийте окружающую шерсть по мере необходимости, чтобы облегчить визуализацию (см. рисунок 5B для отмеченного подходящего участка для инъекции ICM).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для поддержания внутричерепного давления (ICP) во время инъекции ICM обычно удаляется эквивалентный объём ликвора перед введением препарата. Рекомендуется использовать новый, заранее заполнённый шприц для инъекций. Сгибание иглы шприца может облегчить введение (см. рисунок 5C для демонстрации инъекции ICM с помощью изогнутой иглы шприца). - Держите крысу на спине на нагреваемой хирургической подложке (поддерживаемую при 37 °C), чтобы сохранить температуру тела после инъекции и на протяжении всего периода сбора образца.
Рисунок 5: Послеоперационное лечение. (A) Закрытое место разреза с помощью шелкового шва. (B) Приблизительное расположение cisterna magna с выбритым мехом вокруг нас. (C) Введение кандидата на препарат с помощью ICM с помощью инсулинового шприца с изогнутой иглой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.
6. Сбор образцов лимфаты и анализ
- Непрерывно собирайте лимфу в микроцентрифугальные трубки с антикоагулянтным покрытием, заменяя трубки с заранее определёнными интервалами (обычно раз в час). Храните собранные образцы вместе со льдом в холодильнике. См. рисунок 6 для собранного образца шейной лимфы в микроцентрифужной трубке.
- После завершения процесса сбора лимфы усыпьте крысу гуманным образом согласно соответствующим протоколам.
- Определите скорость лимфического потока, измеряя объем лимфы, собранный за каждый запланированный интервал (в час).
- Измеряйте концентрацию лекарств (или веществ, представляющих интерес) в лимфе с помощью соответствующих аналитических методов, включая ВЭЖХ, ВЭЖХ-МС или коммерчески доступные наборы для анализа, чтобы охарактеризовать их кинетику очистки от ЦНС через лимфатическую систему.
- Рассчитывайте массовый перенос лимфатического препарата, умножая измеренные концентрации препарата на соответствующие объемы лимфы.
Рисунок 6: Сбор образцов лимфы. Фотография одного собранного образца (примерно 100 мкл) в микроцентрифугной трубке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.
7. Обработка после процедуры и утилизация отходов
- Временно храните эвтаназии крыс в специально отведённых контейнерах для медицинских отходов в специально оборудованном холодильном помещении (например, в холодильнике), пока они не будут собраны и утилизованы профессиональной командой по переработке медицинских отходов.
- Соберите все выброшенные острые предметы в специальный контейнер, отдельный от всех остальных отходов.
- Утилизировать все другие неострые предметы, использованные в эксперименте (например, ватные палочки, резинки, канюли с ПЭ) в медицинские отходы, и не выбрасывать их вместе с бытовыми или общими отходами. Убедитесь, что в эту сумку нет острых предметов.
- Очистить и дезинфицировать все оставшиеся многоразовые инструменты в соответствии с лабораторными протоколами.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Репрезентативный набор данных часовых лимфических потоков (мл/ч) был получен с использованием модели шейной лимфы (см. рисунок 7 для соответствующей таблицы). В этом эксперименте с участием трёх (n = 3) изучаемых крыс лимфа непрерывно собиралась в микроцентрифугальные трубки, которые заменялись ежечасно в течение 6 часов.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот протокол устанавливает воспроизводимый метод канюляции шейного лимфатического протока у крыс, что позволяет непрерывно собирать лимфу в течение длительного времени. При достаточном микрохирургическом обучении процедуру можно проводить эффективно, и при стабильных физиологических условиях при поддержании непрерывной анестезии процедура может быть выполнена стабильно, что делает её пригодной для рутинного экспериментального использования. После освоения хирургическая процедура обычно ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет известных конкурирующих финансовых интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, описанную в этой статье.
Благодарности
Авторы искренне благодарят господина Чжэнлинь Хао и госпожу Цзе Чжао из Центра экспериментальных исследований животных Китайского фармацевтического университета за их поддержку в проведении экспериментов на животных.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Игла 30 калибра | Yushou Health | Используется для соединения проксимального конца канюли (0503) с гепариновым шприцом | |
| Дозатор анестезии с вапорайзером | YYUN Instrument Company | ||
| Тупые щипцы | RWD Life Science | F22002-10 | |
| Ватные палочки | Биотехнология Циндао Шульц | MQ-02 | Используется для временного удержания мышечной ткани |
| Подогреваемая хирургическая прокладка | Shanghai Yiheng Instruments | Размерность 15 и раз; 20 см | |
| Гепарин натрий | Шанхайская биохимическая технология Аладдина | H123383 | Перед использованием требуется разбавление |
| Инсулиновый шприц (1 мл) | Yushou Health | U100-1ML | Используется только для предварительного покрытия гепарином |
| Раствор изофлурана для ингаляции | RWD Life Science | R510-22-10 | Используется для анестезии через вапорайзер |
| Маркерные ручки | Любой бренд | Н/Д | |
| Микроцентрифугная трубка (1,5 мл) | Экспериментальное оборудование Nantong Hairui | HR10003 | Используется для сбора лимфы |
| Микроножницы | RWD Life Science | GD234BA0007925 | |
| Нейлоновый хирургический шов | Shanghai Yiheng Instruments | 4-0 35CM | |
| Пипетта (регулируемая громкость, диапазон от 5 до 50 и м²; L) | Dragon Laboratory Instruments Limited | 7030301006 | Используется только для измерения клея тканей |
| Кончики пипетки | Biosharp Life Sciences | BS-10-T | Используется только для переноса клея тканей, без определённого объёма |
| Полиэйгиленовая (ПЭ) канюля 0,5 мм OD, 0,3 мм ID (0503) | Научные приборы AniLab (Нинбо) | PE-0503 | |
| Полиэйгилен (PE) канюля 0,6 мм OD, 0,5 мм ID (0605) | Научные приборы AniLab (Нинбо) | PE-0605 | |
| Лезвия для бритвы | Gillette Shanghai | Q31/0115000301C004 | Используется только для бритья меха |
| Резиновая лента | Любой бренд | Н/Д | Используется для удержания передних конечностей крыс |
| Правитель | Любой бренд | Н/Д | |
| Лезвия Scapel (#23) | RWD Life Science | S31010-01 | |
| Раствор хлорида натрия (0,9%) для инфузии | Шицзячжуан No4 Фармацевтика | H20066533 (номер одобрения) | Используется только для промывания шерсти |
| Спраг-Доули Рэтс | Пекинская лаборатория по работе с животными на реке Виталь | 101 | Вес от 220 до 250 грамм, без возрастных ограничений |
| Хирургический свет | Beijing Heo Bio-Tech | XHA011-1 | |
| Хирургический микроскоп | Оптоэлектронная технология Shanghai Cewei | SMZ755T | Расчленённый микроскоп без механической ступени может быть оснащён выдвижной подставкой |
| Тканевой клей | 3M Vetbond | 1469SB | Основной ингредиент: цианоакрилат |
| Тканевой экспандер (Colibri) | RWD Life Science | R22029-04 | Диапазон расширения 20 мм/4 см |
Ссылки
- Hu, D., et al. Lymphatic system identification, pathophysiology and therapy in the cardiovascular diseases. J Mol Cell Cardiol. 133 (1), 99-111 (2019).
- Breslin, J. W., et al. Lymphatic vessel network structure and physiology. Compr Physiol. 9 (1), 207-299 (2018).
- Moore, J. E. Jr, Bertram, C. D. Lymphatic system flows. Annu Rev Fluid Mech. 50, 459-482 (2018).
- Dupont, G., et al. Our current understanding of the lymphatics of the brain and spinal cord. Clin Anat. 32 (1), 117-121 (2019).
- Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. J Exp Med. 212 (7), 991-999 (2015).
- Xu, J., et al. The lymphatic system: a therapeutic target for central nervous system disorders. Neural Regen Res. 18 (6), 1249-1256 (2023).
- Raper, D., Louveau, A., Kipnis, J. How do meningeal lymphatic vessels drain the CNS. Trends Neurosci. 39 (9), 581-586 (2016).
- Louveau, A., et al. Understanding the functions and relationships of the glymphatic system and meningeal lymphatics. J Clin Invest. 127 (9), 3210-3219 (2017).
- Salvador, A. F. M., Abduljawad, N., Kipnis, J. Meningeal lymphatics in central nervous system diseases. Annu Rev Neurosci. 47 (1), 323-344 (2024).
- Guo, X., et al. Emerging roles of meningeal lymphatic vessels in Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 94 (S1), S355-S366 (2023).
- Mestre, H., et al. Cerebrospinal fluid influx drives acute ischemic tissue swelling. Science. 367 (6483), eaax7171(2020).
- Da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
- Zou, W., et al. Blocking meningeal lymphatic drainage aggravates Parkinson's disease-like pathology in mice overexpressing mutated α-synuclein. Transl Neurodegener. 8 (1), 7(2019).
- Wu, C., et al. Tauopathy after long-term cervical lymphadenectomy. Alzheimers Dement. 21 (4), e70136(2025).
- Fang, Y., et al. A new perspective on cerebrospinal fluid dynamics after subarachnoid hemorrhage: from normal physiology to pathophysiological changes. J Cereb Blood Flow Metab. 42 (4), 543-558 (2022).
- Yen, Y. H., Chen, M. W., Lim, J. X., Chew, K. Y. Exploring lymphovenous anastomosis for Alzheimer's disease: addressing brain lymphatic dysfunction, feasibility, and outcome metrics. Plast Reconstr Surg. , (2025).
- Rubenstein, J., Ferreri, A. J., Pittaluga, S. Primary lymphoma of the central nervous system: epidemiology, pathology and current approaches to diagnosis, prognosis and treatment. Leuk Lymphoma. 49 (1), 43-51 (2008).
- Camilleri-Broët, S., et al. A uniform activated B-cell-like immunophenotype might explain the poor prognosis of primary central nervous system lymphomas: analysis of 83 cases. Blood. 107 (1), 190-196 (2006).
- Papadopoulos, Z., Herz, J., Kipnis, J. Meningeal lymphatics: from anatomy to central nervous system immune surveillance. J Immunol. 204 (2), 286-293 (2020).
- Hoang, T. A., et al. Development and application of a novel cervical lymph collection method to assess lymphatic transport in rats. Front Pharmacol. 14 (1), 1111617(2023).
- Licastro, E., et al. Glymphatic and lymphatic communication with systemic responses during physiological and pathological conditions in the central nervous system. Commun Biol. 7 (1), 229(2024).
- Sarker, A., et al. Intrathecal [(64)Cu]Cu-albumin PET reveals age-related decline of lymphatic drainage of cerebrospinal fluid. Sci Rep. 13 (1), (2023).
- Khang, M., et al. Intrathecal delivery of nanoparticle PARP inhibitor to the cerebrospinal fluid for the treatment of metastatic medulloblastoma. Sci Transl Med. 15 (720), eadi1617(2023).
- Pizzo, M. E., et al. Intrathecal antibody distribution in the rat brain: surface diffusion, perivascular transport and osmotic enhancement of delivery. J Physiol. 596 (3), 445-475 (2018).
- Yan, J., et al. Lymphatic clearance is the main drainage route of lamotrigine-loaded micelles following delivery to the brain. J Pharm Pharmacol. 71 (10), 1488-1496 (2019).
- Ringstad, G., Eide, P. K. Glymphatic-lymphatic coupling: assessment of the evidence from magnetic resonance imaging of humans. Cell Mol Life Sci. 81 (1), 131(2024).
- Pan, W. R., Suami, H., Taylor, G. I. Lymphatic drainage of the superficial tissues of the head and neck: anatomical study and clinical implications. Plast Reconstr Surg. 121 (5), 1614-1624 (2008).
- Bou-Assaly, W. The forgotten lymph nodes: review of the superficial head and neck lymphatic system. Radiol Imaging. 1 (1), 9-13 (2016).
- Yağmurlu, K., et al. Anatomical features of the deep cervical lymphatic system and intrajugular lymphatic vessels in humans. Brain Sci. 10 (12), 953(2020).
- Suami, H., Scaglioni, M. F. Lymphatic territories (lymphosomes) in the rat: an anatomical study for future lymphatic research. Plast Reconstr Surg. 140 (5), 945-951 (2017).
- Zawieja, D. C., et al. Lymphatic cannulation for lymph sampling and molecular delivery. J Immunol. 203 (8), 2339-2350 (2019).
- Hoang, T. A., et al. Quantifying the lymphatic transport of model therapeutics from the brain in rats. Mol Pharm. 21 (5), 2473-2483 (2024).
- Hoang, T. A., et al. Acute neuroinflammation alters the transport of a model therapeutic protein from the brain into lymph and blood. Mol Pharm. 21 (10), 5138-5149 (2024).
- Maloveska, M., et al. Dynamics of Evans blue clearance from cerebrospinal fluid into meningeal lymphatic vessels and deep cervical lymph nodes. Neurol Res. 40 (5), 372-380 (2018).
- Trevaskis, N. L., et al. The mesenteric lymph duct cannulated rat model: application to the assessment of intestinal lymphatic drug transport. J Vis Exp. (97), e52389(2015).
- Gakuba, C., et al. General anesthesia inhibits the activity of the glymphatic system. Theranostics. 8 (3), 710-722 (2018).
- Miao, A., et al. Brain clearance is reduced during sleep and anesthesia. Nat Neurosci. 27 (6), 1046-1050 (2024).
- Bachmann, S. B., et al. Differential effects of anaesthesia on the contractility of lymphatic vessels in vivo. J Physiol. 597 (11), 2841-2852 (2019).
- Ruscic, K. J., Padera, T. P. Silence of the lymphs: some anaesthetic regimens inhibit lymphatic pumping. J Physiol. 597 (11), 2827-2828 (2019).
- Dahan, A., et al. The effect of general anesthesia on the intestinal lymphatic transport of lipophilic drugs: comparison between anesthetized and freely moving conscious rat models. Eur J Pharm Sci. 32 (4), 367-374 (2007).
- de Jong, W. H., et al. Long-term cannulation of the vena cava of rats for blood sampling: local and systemic effects observed by histopathology after six weeks of cannulation. Lab Anim. 35 (3), 243-248 (2001).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
