Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Исследовательская статья
Это исследование выявляет снижение разнообразия микробиоты кишечника и изменённые метаболические пути при диабете 2 типа (СД2), выделивая увеличение протеобактерий и снижение полезных таксонов, что указывает на связь микробной дисбиоза с ЦД2 и может влиять на его патофизиологию.
Глобальный рост числа сахарного диабета 2 типа (СД2) подчёркивает необходимость лучшего понимания его биологических механизмов, особенно связанных с взаимодействием хозяина и микробиома. Целью данного исследования было охарактеризовать микробное разнообразие кишечника, таксономический состав и прогнозируемые метаболические пути у недавно диагностированных пациентов с ЦД2 по сравнению с группой без диабетического сопоставления (NM). Свежие образцы кала анализировались с помощью секвенирования 16S рДНК. Для оценки структуры микробного сообщества были рассчитаны альфа-разнообразие (индексы Чао, ACE, Шеннона и Симпсона) и бета-разнообразие. Таксономические различия оценивались с помощью тестов с суммой ранга Уилкоксона и размера эффекта линейного дискриминантного анализа (LEfSe). Прогнозирование функциональных путей проводилось с использованием филогенетического исследования сообществ путём реконструкции ненаблюдаемых состояний (PICRUSt2) на основе аннотаций KEGG и MetaCyc. Для оценки генетически предсказанных ассоциаций между микробными таксонами и ДДМ применялся менделевский рандомизационный анализ (MR), включающий взвешенное взвешивание по дисперсии, MR-Egger и взвешенные медианные методы. Результаты показали снижение микробного богатства, что отражено в более низких индексах Чао и АПФ, а также изменённую структуру разнообразия, что отражается при более низких индексах Шеннона и более высокие показатели Симпсона, у пациентов с ЦДК 2, сопровождаясь значительными изменениями состава. Наблюдалось увеличение относительной численности протеобактерий и уменьшение количества полезных таксонов, таких как Lachnospiraceae и Blautia. Функциональные прогнозы показали снижение количества путей, связанных с неокисляющим пентофосфатным путём, биосинтезом изобутанола и биосинтезом L-изолейцина. МР-анализ предоставил дополнительные доказательства в пользу ассоциаций между определёнными микробными таксонами и восприимчивостью к ДД2. В заключение, СД 2 связан с понижением микробного богатства, изменённой структурой разнообразия и выраженными таксономическими и функциональными изменениями. Эти результаты подчёркивают значимость кишечной микробиоты при ЦД2 и подтверждают потенциальную полезность биомаркеров и терапевтических стратегий на основе микробиома. Требуются дальнейшие исследования для подтверждения этих результатов и разъяснения основных механизмов.
Сахарный диабет 2 типа (СД2) стал одним из самых быстрорастущих хронических заболеваний в мире, вызванных быстрой урбанизацией, западным питанием и всё более малоподвижным образомжизни 1,2. Она является одним из основных факторов глобальной заболеваемости и смертности и создаёт значительную нагрузку на общественноездоровье 3. Хотя генетическая восприимчивость играет роль, быстрый рост заболеваемости ЦД2 подчёркивает важность факторов окружающей среды иметаболических факторов 4. Поэтому выявление модифицируемых биологических механизмов крайне важно для совершенствования стратегий раннего выявления и профилактики. Недавние достижения показали, что микробиота кишечника является ключевым регулятором метаболическогогомеостаза 5. Микробная экосистема кишечника влияет на метаболизм глюкозы, иммунную функцию, целостность кишечного барьера и хроническое низкостепенное воспаление, что является центральным фактором патогенезаСД2 СД 6. Дисбиоз связан с ожирением, инсулинорезистентностью, эндотоксемией и нарушением энергетического баланса, что указывает на механистическую связь между микробными изменениями и прогрессированиемболезни 7. Кроме того, микробные метаболиты, включая короткоцечечные жирные кислоты, желчные кислоты и аминокислоты ветвлённых цепей, участвуют в модулировании чувствительности к инсулину и метаболизмухозяина 8.
Хотя накопление доказательств подтверждает роль микробиома кишечника при ЦД2, большинство существующих исследований опираются на наблюдательные конструкции, которые ограничивают причинно-следственные выводы. Альтернативные подходы, такие как метагеномика и таргетная метаболомика, могут предоставлять функциональные инсайты с более высоким разрешением, но часто ограничены стоимостью, вычислительной сложностью и ограниченной возможностью проведения исследовательских или пилотных исследований. В отличие от этого, секвенирование 16S рДНК является экономичным и широко принятым методом профилирования состава микробных сообществ, хотя таксономическое разрешение ограничено уровнем вида и не может напрямую количественно оценить функциональные метаболиты. Поэтому для этого исследования было выбрано секвенирование 16S рДНК как экономически эффективный, масштабируемый подход, подходящий для исследовательских клинических когорт, при этом обеспечивая интеграцию с дальнейшими функциональными прогнозами и дополняющими аналитическими рамками. Поэтому интеграция микробного профилирования на основе 16S с биоинформатикой, функциональным прогнозированием и дополняющими подходами, такими как менделевская рандомизация (MR), может предоставить сбалансированную основу для изучения как композиционных, так и потенциально причинно-следственных связей.
Примечательно, что сохраняется относительное нехватка данных, сосредоточенных именно на недавно диагностированных пациентах с ЦД2, не относящихся к лечению. В таких популяциях микробные изменения реже подвергаются запутанию фармакологическими вмешательствами, особенно метформином, который, какизвестно, значительно изменяет состав и функцию микробиоты кишечника. Это представляет собой важный пробел в современной литературе, поскольку многие существующие исследования включают гетерогенные популяции пациентов с разным воздействием лечения и ограниченной интеграцией профилирования микробиома с генетически обоснованными аналитическими подходами.
В этом контексте данное исследование было направлено на характеристику разнообразия микробиоты кишечника, таксономического состава и прогнозируемых функциональных путей у недавно диагностированных пациентов с ЦД2 по сравнению с группой НМ с использованием секвенирования 16S рДНК и биоинформатического анализа. Кроме того, была применена менделевская рандомизация с использованием общедоступных общегеномных ассоциативных данных для изучения потенциальных генетически предсказуемых ассоциаций между определёнными микробными таксонами и риском ДД2. Эта объединённая аналитическая стратегия позволяет получать дополняющие инсайты на основе профилирования микробных сообществ и генетических данных на уровне популяции. В частности, секвенирование 16S рДНК обеспечивает прямую характеристику состава микроорганизмов в исследуемой популяции, тогда как менделевская рандомизация использует генетические инструменты независимых когорт для оценки соответствия наблюдаемых ассоциаций генетически предсказанным взаимосвязям. Эта интеграция направлена на устранение ключевого ограничения наблюдательных исследований микробиома, предоставляя дополнительные доказательства, подтверждающие устойчивость ассоциаций микробиоты с Т2ДМ. Поэтому интеграция этих подходов направлена на кросс-валидацию, а не на избыточность, тем самым усиливая интерпретируемость ассоциаций микробиоты и Т2ДМ.
Настоящее исследование сосредоточено на трёх аспектах. Во-первых, он оценивает изменения микробиоты кишечника у недавно диагностированных пациентов с ЦД2, не относящихся к лечению, чтобы уменьшить запутанность от фармакологических вмешательств. Во-вторых, он интегрирует таксономическое профилирование с предсказанными функциональными путями для получения системного обзора метаболических изменений, связанных с микробиотой. В-третьих, он включает менделевский рандомизационный анализ для оценки совместимости наблюдаемых ассоциаций с генетически предсказанными отношениями, тем самым обеспечивая методологическую триангуляцию. В совокупности эти аспекты обеспечивают дополнительную и воспроизводимую основу для анализа микробиома, а не чисто описательное исследование, отличая эту работу от предыдущих исследований, которые обычно опираются на однометодные наблюдательные схемы и не интегрируют микробное профилирование, функциональное предсказание и генетически обоснованный вывод в единую аналитическую структуру.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Все процедуры с участием людей были рассмотрены и утверждены Этическим комитетом больницы Чунцин Чэньцзяцяо (одобрение No 20240131). Письменное информированное согласие было получено от всех участников до сбора образца. Все образцы кала и информация об участниках обрабатывались с использованием неидентифицированных кодов исследований, указанных в Таблице материалов.
Отбор и регистрация участников
Недавно диагностированные пациенты с ДД2, посещавшие больницу Чунцин Чэньцзяцяо с июня 2023 по декабрь 2023 года, прошли скрининг на соответствие требованиям. Участники были зачислены в группу ДМ, если им было от 20 до 65 лет, им поставили новый диагноз ЦД2, они согласились предоставить свежий образец кала, а также прошли обязательную медицинскую оценку и клинические обследования. Здоровые волонтёры, набранные в тот же период, были включены в группу без диабетического сопоставления (NM) и максимально близко сопоставлены с группой DM по возрасту, полу и общим демографическим характеристикам. Участники исключались, если у них были гематологические расстройства, заболевания центральной нервной системы, активное ревматическое заболевание, аутоиммунные заболевания, острая или хроническая инфекция желудочно-кишечного тракта, хроническая диарея, запоры, активная или заживающая язва желудочно-кишечника, воспалительное заболевание кишечника, синдром раздражённого кишечника, кишечный туберкулёз, опухоли желудочно-кишечного тракта, другие злокачественные опухоли, тяжелая сердечная недостаточность, тяжелая печёночная недостаточность, тяжелая почечная недостаточность, другие тяжёлые метаболические заболевания болезни, недоедание, иммунодефицит, врождённые метаболические нарушения, психиатрические заболевания, седативно-гипнотическое использование или злоупотребление наркотиками. Участники также исключались, если они получили антибиотики, кислотоподавляющие средства, препараты для моторики желудочно-кишечного тракта, пробиотики, глюкокортикоиды или иммуносупрессанты в течение месяца до начала сбора кала. Кроме того, лица, перенесшие диарею, перенесённые операции на желудочно-кишечном тракте или эндоскопию, либо сообщали о резких изменениях в условиях жизни или пищевых привычек в течение месяца до сбора кала. Каждому подходящему участнику перед сбором выборки был присвоен уникальный код исследования. Из допустимой когорты были отобраны 12 недавно диагностированных участников с ЦД2 и 12 участников НМ для последовательного секвенирования рДНК 16S и анализа микробиома на основе доступности образцов и требований к качеству секвенирования.
Сбор и хранение образцов кала
Каждому участнику предоставлялся стерильный контейнер для сбора кала, маркированный только назначенным кодом исследования для обеспечения деидентификации. Участникам было рекомендовано опорожнять мочевой пузырь перед дефекацией, чтобы минимизировать загрязнение мочой, а также собирать свежий кал прямо в стерильный контейнер без контакта с туалетной водой, мочой, дезинфицирующими средствами или другими потенциальными загрязнителями. Сразу после сбора примерно 1–2 г кала перемещали в стерильную криогенную трубку с помощью стерильной одноразовой ложки. Трубка плотно запечатывалась и сразу же помещалась на сухой лёд или в предварительно охлаждённый контейнер для переноса. Все образцы были доставлены в лабораторию в течение 2 часов после сбора сбора. По прибытии в лабораторию код исследования был проверен, и каждая трубка была проверена на наличие утечек или видимого загрязнения. Время сбора и хранения для всех сэмплов фиксировалось. Образцы кала впоследствии хранились при −80 °C до экстракции геномной ДНК. Образцы считались приемлемыми для дальнейшего анализа только в том случае, если они оставались полностью замороженными во время хранения и транспортировки и не имели признаков протечки трубки или внешнего загрязнения.
Геномная экстракция ДНК
Образцы кала извлекались из хранилища при температуре −80 °C и помещались на лёд перед обработкой. Каждый образец размораживался только до тех пор, пока не стала возможной гомогенизация, чтобы минимизировать деградацию, связанную с повторяющимися циклами заморозки–оттаивания. Около 200 мг кала было перемещено в стерильную микроцентрифугную трубку, а буфер для лизис, предусмотренный в наборе для экстракции ДНК кала, был добавлен согласно инструкциям производителя, указанным в Таблице материалов. Образцы интенсивно вихрили в течение 30 секунд для достижения полной гомогенизации, а затем инкубировали при комнатной температуре в течение 5–10 минут для облегчения лизиса клеток. После лизиса образцы были центрифугированы при 12 000 × г в течение 10 минут при 4 °C. Супернатант аккуратно перемещался в новую стерильную микроцентрифугную трубку, не нарушая гранулу. Геномная ДНК затем элюировалась с помощью буфера элюирования, поставляемого с набором, или воды без нуклеазы согласно протоколу производителя. Экстракционная ДНК хранилась при −20 °C для краткосрочного использования или при −80 °C для длительного сохранения. Образцы ДНК, признанные подходящими для дальнейшего анализа, оказались прозрачными и свободными от видимых частиц.
Оценка качества ДНК
Качество ДНК оценивалось с помощью электрофореза агарозного геля и квантифицирования на основе флуоресценции. В буфере электрофореза был приготовлен гель агарозы с 1% содержанием, а извлеченные образцы ДНК, смешанные с буфером для загрузки, были загружены в гелевые ямы. Электрофорез проводился до тех пор, пока полоски ДНК не были должным образом разделены, после чего гель исследовали под ультрафиолетовым или синим светом. Целостность ДНК считалась приемлемой, если наблюдалась целостная геномная полоса ДНК без заметной деградации или чрезмерного размазывания. Концентрация ДНК впоследствии была количественно измерена с помощью системы квантооценки ДНК на основе флуоресценции. Образцы затем разбавлялись до концентрации, необходимой для дальнейшей амплификации ПЦР. Высококачественные образцы ДНК обычно имели выраженную полосу на агарозном геле электрофорез и были достаточно концентрированы для последующих процедур амплификации.
ПЦР-амплификация области 16S рДНК V3–V4
Гипервариабельный регион бактериальной рДНК 16S V3–V4 был амплифициран с помощью штрих-кодированных праймеров. Последовательности праймеров были следующими: прямой праймер 5′-ACTCCTACGGGAGGCAG-3′ и обратный праймер 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′. ПЦР-реакции были подготовлены на льду в конечном объёме 20 мкл, содержащем 4 мкл буфера ПЦР, 2 мкл нуклеотидной смеси (2,5 ммоль/л), по 0,8 мкл прямых и обратно праймеров (5 мкмоль/л), 0,4 мкл высокоточной ДНК-полимеразы, 10 нг шаблонной ДНК и воду без нуклеазы к объёму. Реакционные смеси аккуратно смешивались с помощью пипетки и кратковременно центрифугировали для сбора жидкости на дне трубки. Усиление ПЦР проводилось с использованием следующих циклических условий: начальная денатурация при 95 °C в течение 5 минут, затем 25 циклов денатурации при 95 °C в течение 30 с, отжиг при 55 °C в течение 30 секунд и расширение при 72 °C в течение 30 секунд, с последним этапом расширения при 72 °C в течение 10 минут. Чтобы минимизировать смещение амплификации, каждый образец амплифицировался в тройных реакциях, а полученные продукты ПЦР из того же образца затем объединялись в одну трубку. Успешное усиление было подтверждено наличием прозрачной ампликонной полосы ожидаемого размера при электрофорезе агарозного геля.
Проверка и очистка ПЦР-продукции
ПЦР-продукты были проверены с использованием электрофореза 2% агарозного геля. Комбинированные продукты ПЦР из каждого образца загружались на гель и обработаны электрофоресами, пока целевые ампликонные полосы не были чётко разделены. Ленты, соответствующие ожидаемому размеру ампликона, были вырезаны чистым стерильным лезвием и очищены с помощью набора для экстракции геля согласно инструкциям производителя, указанным в Таблице материалов. Очищенные продукты ПЦР впоследствии элюировались в буфере элюции или воде без нуклеазы. Концентрация каждого очищенного продукта ПЦР количественно измерялась с помощью системы квантооценки ДНК на основе флуоресценции, а значения концентрации записывались для дальнейшей подготовки библиотеки. Успешное усиление и очистка были подтверждены одной прозрачной полосой ожидаемого размера ампликона на электрофорезе агарозного геля.
Подготовка и объединение библиотеки
Секвенирующие библиотеки готовились с использованием комплекта для подготовки библиотеки ДНК согласно инструкциям производителя, указанным в Таблице материалов. Последовательности адаптеров секвенирования были связаны с очищенными ампликонами в соответствии со стандартным процессом подготовки библиотеки. Продукты, связанные с адаптером, затем очищались с помощью гелевой экстракции или метода очистки на основе шариков, в зависимости от выбранного протокола подготовки библиотеки. Очищенные библиотечные продукты оценивались с использованием электрофореза 2% агарозного геля для подтверждения правильного распределения фрагментов. Концентрации в библиотеке количественно измерялись с помощью системы квантооценки ДНК на основе флуоресценции. В зависимости от концентрации ДНК и размера фрагмента каждая библиотека нормализовалась до одинаковой молярной концентрации для обеспечения сбалансированной глубины секвенирования по образцам. Равные молярные количества отдельных библиотек затем объединялись в соотношении 1:1 для получения итогового пула секвенирующих библиотек. До секвенирования пулированная библиотека денатурировалась согласно протоколу платформы секвенирования перед загрузкой сэмпла. Библиотеки, считающиеся подходящими для секвенирования, демонстрировали чёткое распределение фрагментов в пределах ожидаемого размерного диапазона и достаточную концентрацию для анализа последующей секвенировки.
Секвенирование парных концов
Окончательная объединённая библиотека загружалась на платформу секвенирования с парными концами согласно стандартным процедурам производителя. Парное секвенирование проводилось с использованием конфигурации запуска 2 × 250 bp или 2 × 300 bp для обеспечения достаточной глубины секвенирования для комплексной характеристики микробного разнообразия в каждом образце. Качество секвенирования отслеживалось на протяжении всего запуска с использованием метрик, созданных платформой. После завершения секвенирования для каждого образца экспортировались необработанные парные FASTQ-файлы для дальнейшего биоинформатического анализа. Наборы данных секвенирования считались приемлемыми, если они демонстрировали достаточную глубину чтения на выборку, соответствующие показатели качества за Q30 и успешное присвоение штрихкодов.
Обработка необработанной последовательности
Сырые парные файлы FASTQ импортировались в конвейер биоинформатики микробиома для дальнейшей обработки. Последовательности демультиплексировались на основе штрихкодов, присвоенных каждому образцу. Впоследствии проводилась фильтрация качества для удаления чтений с низкими оценками, неоднозначными основами или артефактами секвенирования. Низкокачественные базы, расположенные на концах считываний, были обрезаны в зависимости от распределения баллов качества для повышения общей надёжности последовательностей. После контроля качества считывания с парными концами объединялись между перекрывающимися областями для восстановления полноразмерных последовательностей. Для последующих анализов микробиома сохранялись только высококачественные объединённые последовательности.
Генерация вариантов ампликонной последовательности (ASV) и таксономическая аннотация
Снятие шума последовательностей проводилось с использованием проверенного алгоритма снятия шума, включая DADA2 или Deblur, для исправления ошибок секвенирования и повышения точности последовательностей. Химерные последовательности были выявлены и удалены в процессе снятия шума. Для каждого выборки впоследствии были созданы репрезентативные последовательности ASV и соответствующие таблицы численности ASV. Таксономическое присвоение ASV-последовательностей проводилось с помощью наивного классификатора Байеса, а таксономическая аннотация — на основе базы данных SILVA 138. Таксономические таблицы численности экспортировались на уровнях типов, семейств и родов для дальнейшего анализа. Окончательный набор данных ASV включал репрезентативные последовательности, информацию о численности и соответствующие таксономические аннотации для каждого выборка.
Анализ альфа- и бета-разнообразия
Были рассчитаны индексы альфа-разнообразия, включая индексы Chao, ACE, Shannon, Simpson и Coverage, для оценки микробного разнообразия и богатства внутри выборки. Индексы альфа-разнообразия выражались в среднем ± стандартном отклонении. Нормальность данных оценивалась с помощью теста Шапиро–Вилка. Обычно распределенные переменные сравнивались между группами DM и NM с помощью t-тестов Студента, тогда как ненормально распределенные переменные анализировались с помощью тестов на сумму ранга Уилкоксона. Дальности бета-разнообразия были впоследствии рассчитаны с использованием подходящей матрицы расстояний для оценки различий в составе микробных сообществ между образцами. Был проведен анализ основных координат (PCoA) для визуализации различий в структуре микробного сообщества между группами. Кроме того, был проведён анализ сходств (ANOSIM) для определения, превышают ли межгрупповые различия внутригрупповые вариации, и были зафиксированы соответствующие значения ANOSIM R и p. Анализ альфа-разнообразия отражал микробное разнообразие внутри выборки, тогда как бета-анализ оценивал различия в составе микробных сообществ между группами.
Дифференциальный таксономический анализ
Состав микробных сообществ был обобщён на уровне типа, семейства и рода. Были созданы столбочные диаграммы для визуализации относительной численности доминирующих таксонов в отдельных выборках и группах исследований. Кривые Pan/Core и диаграммы Венна были дополнительно построены для сравнения общих и групповых ASV между группами DM и NM. Различия в численности таксонов между группами оценивались с помощью тестов Уилкоксона с суммой ранга. Впоследствии был проведён анализ LEfSe для выявления микробных таксонов, наиболее сильных в межгрупповой дискриминации. Дифференциальный таксономический анализ позволил идентифицировать микробные таксоны, обогащённые либо в группе DM, либо в NM группе.
Функциональное предсказание
PICRUSt2 или аналогичный валидированный функциональный конвейер прогнозирования использовался для вывода микробных функциональных путей из профилей секвенирования 16S рДНК. Данные о численности ASV нормализовались в соответствии с требованиями выбранного аналитического конвейера, а прогнозируемые функции отображались в аннотации путей KEGG или MetaCyc. Прогнозируемое количество путей было впоследствии сравнивано между группами ДМ и НМ. С помощью тепловых карт или других соответствующих графических подходов визуализировались значительно отличающиеся пути. Прогнозируемые функции интерпретировались как предполагаемый микробный метаболический потенциал, а не как напрямую измеряемая концентрация метаболитов. Функциональный прогнозный анализ позволил выявить кандидаты в микробные пути, различающиеся между группами, включая пути, связанные с метаболизмом углеводов и аминокислот.
Менделевский рандомизационный анализ
Сводная статистика по микробиоте кишечника по геному (GWAS) была получена из общедоступных наборов данных10. Значимые данные ассоциаций микробных таксонов по всему геному были получены из каталога NHGRI-EBI GWAS (https://www.ebi.ac.uk/gwas/) с использованием номеров присоединения от GCST90032172 до GCST90032644. Дополнительные метагеномные данные были получены из когорты FINRISK 2002 через Европейский архив геном-феномов (Research ID: EGAS00001005020). Сводная статистика GWAS по сахарному диабету 2 типа также была получена из каталога NHGRI-EBI GWAS (номер доступа: ebi-a-GCST006867). Генетические варианты, связанные с микробными таксонами, были отобраны в качестве инструментальных переменных согласно заранее определённым статистическим порогам, а варианты дисбаланса связи были исключены. Наборы данных по экспозиции и результатам были гармонизированы для обеспечения согласованной ориентации аллелей. Впоследствии был проведен менделевский рандомизационный анализ с использованием метода обратной дисперсии (IVW) в качестве основного аналитического подхода. Анализ чувствительности проводился с использованием методов MR-Egger и взвешенных медиан. Прочность прибора оценивалась с помощью F-статистики, тогда как гетерогенность между инструментальными переменными оценивалась с помощью Q-теста Кокрана. Горизонтальная плейотропия была исследуема с помощью перехватного теста MR-Egger. Коррекция Бонферрони была применена для учёта множественных сравнений. Результаты менделевской рандомизации интерпретировались как генетически предсказанные ассоциации, а не как окончательные доказательства причинности.
Вывод данных и конечная точка
Итоговые аналитические результаты включали таблицы численности ASV, графики таксономического состава, метрики альфа-разнообразия, анализ бета-разнообразия, дифференциальные таксономические результаты, прогнозируемые профили функциональных путей и оценки менделевской рандомизации. Все идентификаторы выборок в наборах данных секвенирования были проверены для обеспечения согласованности с соответствующими деидентифицированными кодами исследования. Необработанные файлы секвенирования, обработанные таблицы ASV, статистические выходы и исходные файлы рисунков архивировались для дальнейшего анализа и управления данными. Протокол считался завершённым после того, как были успешно получены и подтверждены высококачественные данные секвенирования, таксономические профили, метрики разнообразия, прогнозируемый анализ функциональных путей и результаты менделевской рандомизации.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Исходные демографические и клинические характеристики первоначально обследовавшейся клинической когорты представлены в Таблице 1. Репрезентативная подгруппа, состоящая из 12 недавно диагностированных ЦД2 и 12 участников НМ была впоследствии отобрана для секвенирования 16S рДНК и анализа микробиома.
Оценка глубины секвенирования
Был рассчитан индекс Шеннона, а кривая редкости была нанесена на график ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
В последние годы микробиом человека, особенно микробиота кишечника, стал сложным и влиятельным фактором в метаболизме хозяина, иммунной регуляции и развитии заболеваний. У здорового хозяина микробиота кишечника способствует иммунному гомеостазу и целостности кишечногобарьера 11. Дисбиоз связан с рядом патологических состояний, включая метаболические нарушения, аутоиммунные заболевания и злокачественныеопухоли 12,13,14,15,16.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.
ВКЛАД АВТОРОВ:
Линжуй Се и Кэмиао Чен провели анализ данных и составили рукопись. Сицань Пан участвовал в сборе образцов и экспериментальных процедурах. Сюэмэй Чжун и Сяоюй Ли задумали и спроектировали исследование, курировали проект и критически пересмотрели рукопись. Все авторы провели рецензию и утверждение окончательной рукописи.
Авторы благодарят всех участников и сотрудников, участвовавших в сборе и обработке образцов, за их вклад в это исследование.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 16S rRNA Primers (V3–V4) | Sangon Biotech | Custom | Универсальные праймеры для бактериальной 16S области |
| 80 °C Freezer | Haier Biomedical | DW-86L626 | Долгосрочное хранение образцов |
| Agarose Gel System (Sub-Cell GT) | Bio-Rad | 170-4401 | Валидация продукта ПЦР |
| AMPure XP Magnetic Beads | Beckman Coulter | A63880 | Пурификация ДНК и селекция по размеру |
| Bead-beating Tubes (Lysing Matrix E) | MP Biomedicals | 116913050 | Механический лизис микробных клеток |
| Bioinformatics Workstation | Dell | Precision 7920 | Анализ данных с использованием QIIME2 и R |
| DADA2 pipeline | Bioconductor | Version 1.28 | Деноизирование последовательностей и создание ASV; https://benjjneb.github.io/dada2 |
| Deblur | QIIME2 | Version 2023.5 | Деноизирование последовательностей и коррекция ошибок; https://docs.qiime2.org |
| European Genome-Phenome Archive | EMBL-EBI | EGAS00001005020 | Публичный репозиторий метагеномных данных; https://ega-archive.org |
| GWAS Catalog | NHGRI-EBI | Accessions GCST90032172–GCST90032644 | Публичная база данных сводной статистики ассоциативных исследований генома; https://www.ebi.ac.uk/gwas |
| Illumina MiSeq Sequencing System | Illumina | SY-410-1003 | Платформа секвенирования с высокой пропускной способностью |
| KEGG database | Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes | Release 107 | База данных аннотации функциональных путей; https://www.genome.jp/kegg |
| MetaCyc database | SRI International | Version 27.1 | База данных метаболических путей; https://metacyc.org |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424R | Центрифуга для охлаждения для подготовки образцов |
| Nextera XT Library Prep Kit | Illumina | 20018705 | Комплект подготовки библиотеки для секвенирования |
| PCR Master Mix (2x PrimeSTAR Max Premix) | Takara Bio | RR350A | Для высокоточной ПЦР |
| PCR Thermocycler | Bio-Rad | T100 | Инструмент для ПЦР амплификации |
| PICRUSt2 | PICRUSt2 Development Team | Version 2.5.2 | Предсказание функциональных путей по данным секвенирования 16S рДНК; https://github.com/picrust/picrust2 |
| QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit | QIAGEN | 51504 | Экстракция ДНК из образцов кала |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | Пурификация ДНК из агарозного геля |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | Квантификация ДНК |
| R software | R Foundation for Statistical Computing | Version 4.3.1 | Статистический анализ и анализ менделевской рандомизации; https://www.r-project.org |
| SILVA 138 database | SILVA ribosomal RNA database project | Release 138 | Справочная база данных для таксономической аннотации; https://www.arb-silva.de |
| Stool Collection Tube | Sarstedt | 76.9923.001 | Стерильная трубка для сбора образцов кала |
| Stool DNA Kit | Omega | D4015-02 | Комплект для экстракции ДНК |
| TwoSampleMR package | MR-Base | Version 0.5.7 | Анализ менделевской рандомизации в R; https://mrcieu.github.io/TwoSampleMR |