$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Это исследование было одобрено Этическим комитетом больницы Лиюань, Медицинского колледжа Тунцзи, Хуачжунского университета науки и технологий [Одобрение No 2026IEC(RYJ016)]. Все пациенты предоставили информированное согласие, а сбор и использование клинических образцов соответствовали соответствующим этическим нормам Хельсинкской декларации. Основные экспериментальные материалы и приборы, использованные в этом исследовании, перечислены в Таблице материалов.
Сбор клинических образцов тканей и обнаружение экспрессии CDCP1
В период с января 2019 по декабрь 2019 года в нашей больнице были собраны образцы хирургической ткани семи пациентов, диагностированных с нозоглоткой карцинома. Одновременно в качестве контрольных групп были собраны образцы носовой ткани шести пациентов с ринитом. Все образцы тканей немедленно замораживались в жидком азоте после сбора для последующего извлечения РНК.
Экстракция РНК и количественное обнаружение ПЦР в реальном времени
Общая РНК была извлечена из образцов тканей согласно инструкциям производителя. Для каждого образца обработывалось 50–100 мг ткани на льду в 1 мл экстракционного реагента с использованием тканевого гомогенизатора. Гомогенизация проводилась в течение 30 секунд и повторялась 3 раза для полного разрушения ткани. После разрушения тканей каждый лизат получал по 200 мкл хлороформа. Трубки энергично встряхивались вихрем в течение 15 секунд, держались при комнатной температуре 3 минуты, а затем вращались при 12 000 × г в течение 15 минут при 4 °C для разделения фаз. Прозрачный водный слой был удален без нарушения межфазы и перемещён в новую трубку.
РНК была извлечена из этой водной фракции путём добавления изопропанола в соотношении объёма 1:1. После 10-минутной инкубации при комнатной температуре образцы были центрифугированы при 12 000 × г в течение 10 минут при 4 °C для гранулирования РНК. Супернатант был отброшен, а гранулу промывали один раз 1 мл этанола 75%. После второго этапа центрифугирования при 7 500 × г в течение 5 минут при 4 °C этаноловая промывка была удалена. Затем РНК-гранулу сушили на воздухе 5–10 минут при комнатной температуре и вновь суспензировали в 20 мкл воды без РНаз. Количество и чистота РНК определялись спектрофотометрически.
Для подготовки кДНК для обратной транскрипции использовался 1 мкг общей РНК. Реакция проводилась при 37 °C в течение 15 минут, затем нагревалась до 85 °C в течение 5 секунд. Впоследствии количественное ПЦР в реальном времени (qPCR) проводилось с помощью TB Green Premix Ex Taq II на системе реального времени ПЦР. Каждая реакция на 20 мкл содержала 2 мкл кДНК-шаблона, прямые и обратные праймеры по 0,4 мкмоль/л каждый, 10 мкл премикса SYBR Green и воду без нуклеазы. Протокол усиления начинался с денатурации при 95 °C в течение 30 секунд. Затем следовало 40 циклов, каждый из которых состоял из 95 °C в течение 5 с и 60 °C в течение 30 секунд для отжига/продления. Последовательности праймеров приведены в таблице 1.
Иммуногистохимическое обнаружение экспрессии белка CDCP1
Образцы тканей сначала фиксировались в 4% параформальдегиде в течение 24 часов, затем следовала стандартная обезвоживание, вложение парафина и подготовка срезов толщиной 4 мкм. Затем парафиновые срезы обработали ксилолом для удаления парафина и последовательно регидратировали с помощью градированных растворов этанола. Для снятия антигенов препараты помещали в цитратный буфер (pH 6,0) и нагревали в скороварке в течение 3 минут после того, как раствор закипал. Эндогенной активности пероксидазы заглушались путем воздействия 3% перекиси водорода на срезы в течение 10 минут.
После блокировки активности эндогенного фермента срезы инкубировали ночью при 4 °C с разбавлением первичного антитела против CDCP1 при 1:200. На следующий день слайды обработали вторичным антителом, конъюгированным пероксидазой хрена, в течение 30 минут при комнатной температуре. Визуализация сигнала проводилась с помощью комплекта для подкладки DAB, после чего срезы были заменены гематоксилином. В итоге стекла были обезвожены, установлены и осмотрены под оптическим микроскопом.
Культивирование и группировка клеток
Клетки носоглотки человека CNE2 и HK1 поддерживались в DMEM с высоким содержанием глюкозы с добавлением 10% плодовой бычьей сыворотки и 1% пенициллин-стрептомицина. Клетки культивировались при 37 °C в инкубаторе с содержанием 5% CO₂. Когда слияние клеток достигало 70%–80%, их трансфекционировали по следующим группам: контрольная группа (контрольная): трансфектовалась с пустым вектором или отрицательным контрольным siRNA; Группа сверхэкспрессии CDCP1 (CDCP1-OE): трансфектирована плазмидой CDCP1 с гиперэкспрессией; CDCP1 заглушающая группа (si-CDCP1): трансфектирована с помощью сиРНК CDCP1; Группа спасательных экспериментов (CDCP1-OE + U0126): лечена специфическим ингибитором URK1/2 U0126 (10 мкмоль/л) в течение 48 часов на основании гиперэкспрессии CDCP1.
Трансфекция проводилась согласно инструкциям производителя. Клетки были покрыты за 24 часа до трансфекции в пластинах с 6 лунками при 2 × 105 клеток/скважину, при этом в каждой лунке содержалось 2 мл среды, свободной от антибиотиков. Трансфекция началась, когда культуры достигли примерно 70% слияния. Затем культурный материал был снят и заменён свежим средством без сыворотки. Для каждой ямы отдельно из 5 мкл трансфекционного реагента подготовлялось либо 2 мкг плазмидной ДНК, либо 100 пмоль siRNA, при этом каждый компонент разбавлен в 250 мкл восстановленной сывороточной среды. Обе смеси хранили при комнатной температуре в течение 5 минут. Разбавленный нуклеиновый кислота и трансфекционный реагент затем комбинировались и оставались 20 минут при комнатной температуре для создания трансфекционных комплексов. Эти комплексы добавлялись в клетки по каплям, аккуратно распределялись по колодцу и инкубировали вместе с клетками в течение 6 часов. После завершения инкубационного периода трансфекционная смесь удалялась, и клетки получали полный материал с содержанием 10% FBS.
Анализ клеточной пролиферации
Через 48 часов после трансфекции клетки CNE2 и HK1 из каждой группы были собраны и засеяны в пластины на 96 лунок с плотностью 3 ×10 3 клеток на скважину с 100 мкл среды на скважину, с пятью реплицированными колодцами на группу. После культивирования клеток в течение 24, 48 или 72 часов в каждую скважину добавляли 10 мкл раствора MTT при 5 мг/мл. Затем пластины снова инкубировали при 37 °C с 5% CO₂ ещё 4 часа. После этой инкубации культурный супернатант аккуратно удалялся, и в каждую яме добавляли 100 мкл диметилсульфоксида (DMSO) для растворения кристаллов формазана. Пластины перемешивали в течение 10 минут, чтобы обеспечить полное растворение. Поглощение затем фиксировалось с помощью считывателя микропластин с частотой 570 нм, используя 630 нм в качестве опорной длины волны.
Анализ активности апоптоза
Через 48 часов после трансфекции были собраны клетки CNE2 из каждой группы, а активность Caspase-3 была обнаружена с помощью набора для анализа активности Caspase-3 согласно инструкции производителя. В общей сложности 100 мкл буфера лизиса было добавлено в 1 × 106 ячеек, лизировано на льду в течение 15 минут, а затем центрифугировано при 12 000 × г в течение 10 минут при 4 °C. Полученный супернатант был передан для последующего анализа. Для анализа Caspase-3 каждая скважина получила 50 мкл реакционного буфера и 5 мкл субстрата Каспазы-3 (DEVD-pNA). Затем пластину поддерживали при 37 °C в течение 2 часов, а поглощение измерялось на 405 нм с помощью считывателя микропластин.
Вестерн-блот анализ
Через 48 часов после трансфекции клетки CNE2 и HK1 из каждой экспериментальной группы были собраны для извлечения белка. Клетки нарушались в буфере RIPA, содержащем ингибиторы протеаз, и содержались на льду в течение 30 минут. Полученные лизаты центрифугировали при 12 000 × г в течение 15 минут при 4 °C, после чего собирали супернатированные частицы. Концентрация белка измерялась с помощью набора для анализа белков BCA.
Для анализа вестерн-блот 30 мкг общего белка из каждого образца смешивалось с 5-кратным буфером и нагревалось при 100 °C в течение 10 минут для денатурации белков. Образцы были разделены на 10% SDS-PAGE гелях при 120 В в течение 90 минут, после чего переносились на мембраны PVDF при постоянном токе 300 мА в течение 90 минут. После переноса мембраны блокировались 5% обезжиренным молоком на 1 час при комнатной температуре.
Мембраны инкубировали ночью при 4 °C с первичными антителами против CDCP1 (1:1 000), E-кадгерина (1:1 000), виментина (1:1 000), p-ERK1/2 (1:2 000), ERK1/2 (1:1 000) и GAPDH (1:5 000).
На следующий день мембраны были промыты в TBST 3 раза, при этом каждое мытье длилось 10 минут. Затем их подвергали воздействию вторичных антител, конъюгированных пероксидазой хрена, в течение 1 часа при комнатной температуре. После трёх дополнительных промываний TBST белковые сигналы визуализировались с помощью субстрата ECL с хемилюминесценцией. Интенсивность полосы измерялась с помощью программного обеспечения ImageJ, а GAPDH использовался в качестве регулятора нормализации.
Статистический анализ
Все эксперименты проводились отдельно 3 раза. Результаты представлены в виде среднего ± стандартного отклонения (SD). Различия между несколькими группами оценивались с помощью одностороннего анализа дисперсии (ANOVA), а метод Тьюки использовался для парных пост-хок сравнений. P-значение < 0,05 считалось статистически значимым.