Транскриптомический анализ выявил митохондриально управляемые подгруппы в поражениях атопического дерматита

Yingyao Yu; Yuanyuan Shang; Xinhong Ge; Lingdi Dong; Kexin Li

doi:10.3791/70240

Research Article

Транскриптомический анализ выявил митохондриально управляемые подгруппы в поражениях атопического дерматита

DOI:

10.3791/70240

⸱

May 26th, 2026

Yingyao Yu¹ , Yuanyuan Shang¹ , Xinhong Ge¹ , Lingdi Dong¹ , Kexin Li¹

¹Department of Dermatology, General Hospital of Ningxia Medical University

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Атопический дерматит (AD) — хроническое воспалительное кожное заболевание с значительной молекулярной гетерогенностью. В этом исследовании выделяются две транскриптомически различимые подгруппы АД, обусловленные дифференциальной экспрессией митохондриальных генов и иммунной инфильтрацией, а также выявлены четыре гена-хаба как потенциальные биомаркеры для стратификации пациентов.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Атопический дерматит (AD) — это распространённое и хроническое воспалительное кожное заболевание с глобальной распространённостью. Её клиническая гетерогенность и сложные молекулярные механизмы создают значительные трудности для разработки эффективных методов терапии. Исследовать молекулярную гетерогенность АД с использованием транскриптомных данных кожи поражений, охарактеризовать их биологические и иммунные профили, а также выявить ключевые гены, лежащие в основе дифференцировки. Дифференциально экспрессированные гены были идентифицированы с помощью DESeq2, затем проводились анализы путей и коэкспрессии с помощью GSEA и WGCNA соответственно. Гены, связанные с митохондриями, были извлечены с помощью пересекающихся модулей DEG и WGCNA с базой данных MitoCarta3.0, а их функциональная значимость оценивалась с помощью обогащения GO и KEGG. Хабовые гены были выявлены с помощью анализа сетей взаимодействия белков и белков, которые впоследствии использовались для построения классификационной модели. Транскрипционные регуляторы предсказывались с помощью hTFtarget, а инфильтрация иммунных клеток — с помощью CIBERSORT. Были выявлены две молекулярные подгруппы. Кластер 1 был обогащён клеточными сигнальными и адгезионными путями, тогда как кластер 2 демонстрировал повышенную регуляцию окислительного фосфорилирования и процессов, связанных с протеасомами. Всего 85 генов, связанных с митохондриями, главным образом участвующих в энергетическом метаболизме, были дифференцированно экспрессированы между кластерами. Анализ сети PPI выявил четыре хаб-гена (BAD, BOLA1, CHCHD5 и ISOC2), которые были значительно повышены в Кластере 1. Классификатор на основе генов хаба продемонстрировал сильную дискриминационную мощность (площадь под кривой > 0,7). Прогнозируемые ключевые транскрипционные регуляторы включали ATF3, BRD2, BRD4 и CEBPA. Иммунное профилирование выявило более высокую регуляторную инфильтрацию Т-клеток в кластере 1 и увеличение фолликулярных хелперных Т-клеток в кластере 2. В данном исследовании выявлены два молекулярно и иммунологически различных подтипа АД, характеризующихся дифференциальной функцией митохондрий и иммунной микросреды.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Атопический дерматит (АД) — это распространённое и хроническое воспалительное кожное заболевание, поражающее до 20% детей и 10%^{взрослых 1}. Он характеризуется сильным зудом и рецидивирующими экзематозными^{поражениями 2}. Клинически АД возникает из-за динамического взаимодействия полигенной восприимчивости (например, мутации потери функции FLG), иммунной дисрегуляции и воздействия окружающей среды, таких как низкая влажность и микробный^{дисбиоз 3}. Хотя АД разделяет некоторые патофизиологические особенности с псориазом, их клинические проявления взаимоисключают, с разными генетическими эффектами в общих путях и характерными иммунными^{изменениями 4}.

АД — это гетерогенное заболевание, характеризующееся разнообразием транскриптомных профилей у разных групп пациентов и симптомами^{болезни 5}. Интегрированные анализы тканей кожи и периферических мононуклеарных клеток показали, что клинические признаки, такие как эритема и папуляция, связаны с различными иммунологическими сигнатурами, отражающими взаимодействие локальных кожных и системных иммунных^{ответов 6}. Крупномасштабные транскриптомические исследования дополнительно подчеркивают роль путей IL-13 в патогенезе АД, тогда как АД проявляет большую молекулярную гетерогенность, чем псориаз, с вариациями паттернов экспрессии генов, связанными с тяжестью заболевания, возрастом начала и генетическим^фоном ^5,7. Эти различия подчёркивают сложность патогенеза АД и необходимость персонализированных подходов в исследованиях и терапии.

Митохондриальные белки играют важную роль в патогенезе АД через нарушение окислительного стресса и метаболические пути. Исследования показывают повышенную активность митохондриальных комплексов I и II в непораженных кератиноцитах AD, что приводит к чрезмерному окислению длинноцепочечных жирных кислот и повышенному выработке ROS, что увеличивает дисфункцию эпидермального^{барьера} ^8,9. Параллельно протеомные анализы выявляют уменьшенные белки NRF-антиоксидантных путей и митохондриальные компоненты в эпидермисе AD, снижая разрешение окислительного^{стресса 10}. Повреждение митохондриальной ДНК дополнительно способствует воспалительным реакциям, а такие меры, как использование митохондриально-ориентированных антиоксидантов, демонстрируют эффективность восстановления гомеостаза эпидермии за счёт смягчения ROS^11,12. Эти результаты подчёркивают наличие митохондриальных белков как как драйверов патологии АД и потенциальных терапевтических мишеней.

Недавние анализы транскриптома АД значительно продвинули понимание его генетической архитектуры и молекулярной гетерогенности. Первое секвенирование РНК-секвенирования АД выявило повышенную экспрессию в пути TREM-1 и цитокине^{IL-36 13}. Анализ узвешенной коэкспрессией генов на основе профиля экспрессии генов также выявил отдельные молекулярные модули и узовые гены, такие как HSPA4, LCE3E и LCE3D, которые координируют воспалительные реакции и кератинизацию, выявляя потенциальные терапевтические цели¹⁴. Эти исследования подчёркивают важность многотканевой транскриптомики и полигенного моделирования риска для уточнения прогнозирования заболеваний и выявления сложных основ АД. Однако существующие исследования преимущественно сосредоточены на общей транскриптомике AD, не рассматривая конкретно роль митохондриальных генов в определении молекулярных подгрупп. Настоящее исследование выходит за рамки предыдущих транскриптомических анализов, интегрируя несколько наборов данных GEO для выявления подгрупп AD на основе консенсусной кластеризации и систематически пересекающихся дифференциально экспрессируемых генов, модулей WGCNA и тщательно отображённого каталога митохондриальных генов для выявления генов узлов, которые определяют идентичность подгрупп и могут служить новыми биомаркерами.

С гипотезой о том, что кожа при поражении АД содержит молекулярно различимые транскриптомические подгруппы, характеризующиеся дифференциальной экспрессией митохондриальных генов, что может лежать в основе клинической гетерогенности АД. Для проверки этого в исследовании были интегрированы данные секвенирования РНК из опубликованных исследований и собраны данные экспрессии генов образцов кожи из поражений у 266 пациентов с болезнью AD. Молекулярные подгруппы были выявлены на основе консенсусного кластерирования экспрессии генов, а экспрессия генов сравнивалась между двумя молекулярными подгруппами. Гены, определяющие это различие, демонстрируют функциональное обогащение в клеточной сигнализации и окислительное фосфорилирование. Кроме того, были изучены митохондриальные гены, дифференцирующие две молекулярные группы, а ключевые гены хаба были выявлены в сети взаимодействия белков и белков. Эти результаты подчёркивают генетическую гетерогенность болезни АД и расширяют знания о роли митохондриальных белков в патологии АД.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании использовались общедоступные наборы данных экспрессии генов из базы данных Gene Expression Omnibus (GEO). Не было доступа к данным, идентифицируемым пациентам, и не собирались новые образцы пациентов. Поэтому для такого вторичного анализа общедоступных данных не требовалось одобрение институционального контрольного совета (IRB) или согласие пациентов. Программное обеспечение и используемые базы данных перечислены в Таблице материалов.

1 Данные и ресурсы

Данные транскриптома пациентов с атопическим дерматитом (AD) были получены из базы данных GEO, включая четыре исследования: GSE121212 (N = 55)⁵, GSE157194 (N = 57)¹⁵, GSE193309 (N = 111)¹⁶ и GSE277961 (N = 43)¹⁷. Все наборы данных содержали сырые или предварительно нормализованные данные по количеству из биопсий кожи поражений. Матрицы сырого счёта были скачаны и интегрированы между исследованиями. Эффекты перекрёстного исследования были скорректированы с помощью метода ComBat-seq (пакет sva R, версия 3.44.0) для гармонизации профилей экспрессии между четырьмя наборами данных GEO перед следующим анализом. Все четыре набора данных основаны на RNA-seq, проведённых на образцах биопсии человеческой кожи, и были выровнены с человеческим референсным геномом GRCh38 с помощью специфических для исследования конвейеров. Количественная оценка экспрессии на уровне гена проводилась с использованием аннотации гена Ensembl (v105).

2 Консенсусная кластеризация

Неконтролируемое консенсусное кластерирование было проведено с использованием пакета ConsensusClusterPlus R (v1.64.0)¹⁸ для стратификации 266 образцов кожи поражений у пациентов с АД на основе транскриптомических профилей. До кластеризации исходные данные подсчёта из всех исследований объединялись, а эффекты перекрёстных пакетов корректировались с помощью функции removeBatchEffect из лимма-пакета. Данные экспрессии генов затем трансформировались (VST) с помощью DESeq2 и фильтровались для сохранения 5 000 наиболее вариабельных генов. Кластеризация проводилась с использованием иерархической кластеризации с корреляцией Пирсона и средней связью за 1000 итераций, с подвыборкой 80% выборок за итерацию. Лучшее количество кластеров (k варьируется от 2 до 10) определялось с помощью оценки консенсусной кумулятивной функции распределения (CDF), графиков дельта-районов и оценок консенсуса кластера. Полученные кластеры были валидированы с помощью консенсусных тепловых карт и PCA и использовались в биологических и клинических анализах на следующих этапах.

3 Анализ дифференциальной экспрессии генов

Уровни экспрессии генов сравнивались между молекулярными подгруппами с помощью пакета DESeq2 R (v1.46.0)¹⁹. Исходные данные подсчёта были введены для оценки генной дисперсии и соответствовали негативной биномиальной модели. Дифференциально экспрессированные гены (DEG) были идентифицированы с помощью теста Вальда, а результаты фильтровались с использованием порога значимости скорректированного p-значения < 0,01 и абсолютного логарифмического изменения > 1.

4 Анализ обогащения множеств генов

Анализ обогащения множества генов (GSEA) проводился с использованием пакета clusterProfiler R (v4.12.6)²⁰. Все гены ранжировались по логдвукратному изменению по дифференциальному анализу экспрессии, а функция GSEA применялась с параметрами eps = 0, minGSSize = 10 и maxGSSize = 500, при этом другие параметры остались по умолчанию. Обогащение проводилось на основе наборов генов MSigDB Hallmark. Для каждого молекулярного кластера (Кластер 1 и Кластер 2) были выбраны три верхних обогатённых пути на основе номинального p-значения и нормированного балла обогащения (NES). Результаты визуализировались с помощью пакета GseaVis R (v0.1.0)²¹.

5 Взвешенный анализ коэкспрессии генов

WGCNA проводился на профиле экспрессии генов пациентов с АД с целью выявления модулей коэкспрессии генов, связанных с идентичностью транскриптомического подтипа, с использованием R-пакета WGCNA (v1.73)²². Гены были отфильтрованы так, чтобы сохранить верхние 75% с наибольшей вариацией по всем выборкам. Была построена знаковая коэкспрессионная сеть с использованием степени мягкого порогового значения, выбранного от 1 до 30 для приближения безмасштабной топологии. Генные модули идентифицировались с помощью иерархической кластеризации и динамического обрезания деревьев. Ассоциации между признаками модуля изучались путём корреляции коэкспрессированных собственных генгенов модулей с метками молекулярных подтипов, а для дальнейшего анализа были выбраны модули, показывающие значимую корреляцию (p < 0,05) с молекулярным подтипом.

6 Митохондриальные белки в молекулярных подгруппах AD

Для идентификации генов, ассоциированных с митохондриями, внутри модулей DEGs и WGCNA, эти наборы перекрывались с отображённым списком митохондриальных белков из MitoCarta3.0²³. Пересекающиеся гены считались предполагаемыми митохондриальными белками, релевантными для контекста болезни AD.

7 Генная онтология и анализ обогащения KEGG

Определить основные функции клетки и биологические процессы, дифференцирующие молекулярные подгруппы. Анализы обогащения GO и KEGG были проведены для генов, связанных с митохондриями, с помощью clusterProfiler. Обогащение ГО проводилось отдельно для категорий биологических процессов (BP), клеточного компонента (CC) и молекулярной функции (MF) с использованием функции enrichGO с OrgDb = "org. Hs.eg.db", ont = "ВСЕ" и параметры по умолчанию. Обогащение пути KEGG проводилось с использованием функции enrichKEGG с установкой организма в «has». Обогащённые термины с скорректированным p-значением < 0,05 считались значимыми.

8 Сети взаимодействия белок-белок

85 генов DEG и перекрывающихся с AD модулями митохондриальных генов были запрошены в базе данных STRING (https://string-db.org)²⁴ для получения известных и предсказанных ИПП. Анализ топологии сети проводился с использованием семи показателей (степень, близость, промежуточность, собственный вектор, pageRank, хаб и авторитеты) для ранжирования важности узлов каждого белка. Были выбраны 30 лучших генов каждого показателя, а пересечения всех семи подходов визуализированы с помощью графика UpSet. Четыре пересекающихся гена из измерений использовались для построения модели классификации на основе уровней экспрессии их генов. Точность моделей, чувствительность, специфичность и площадь под кривой ROC (AUC) были рассчитаны для оценки эффективности классификации.

9 Анализ транскрипционной регуляции

База данных hTFtarget (http://bioinfo.life.hust.edu.cn/hTFtarget)²⁵ была запрошена для получения экспериментально подтверждённых взаимодействий TF-мишени для четырёх пересекающихся хабовых генов. Получившаяся регуляторная сеть TF-гена была построена и визуализирована с помощью пакетов^{igraph 26} и^{ggraph 27} R.

10 Общий анализ инфильтрации иммунных клеток с РНК-секвенсом

Алгоритм^{CIBERSORT 28} (https://cibersort.stanford.edu/) использовался для оценки относительных долей 22 типов иммунных клеток в данных транскриптома кожи поражения. Нормализованные данные экспрессии генов вводились в CIBERSORT (v0.1.0) вместе с матрицей сигнатуры LM22. Анализ проводился с 1000 перестановками и отключенной нормализацией квантиль. Для дальнейшего анализа рассматривались образцы с p-значениями выхода CIBERSORT < 0,05. Оценочные доли иммунных клеток сравнивались между молекулярными подгруппами с помощью теста Wilcoxon rank-sum с коррекцией FDR для множественных сравнений между 22 типами иммунных клеток (p.adjust.method = «FDR»), а результаты визуализированы с помощью boxplot с использованием пакета ggplot2²⁹ R.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Транскрипционные подгруппы при атопическом дерматите

Данные RNA-seq из 266 образцов пациентов AD были проанализированы для изучения транскрипционной гетерогенности внутри заболевания. После контроля качества и коррекции на эффекты пакетов в нескольких исследованиях неконтролируемое консенсусное кластерирование выявило две различные молекулярные подгруппы (рисунок 1A). Стабильность кластера и оптимальное количество кластеров оценивались с помощью графика кумулятивной функции распределения (CDF) (рисунок 1B), графика площади дельты (рисунок 1C) и консенсусной матричной тепловой карты (рисунок 1D). Вместе эти результаты подтверждают существование двух устойчивых транскрипционных подтипов при АД, отражающих основную генетическую гетерогенность.

Дифференцированно экспрессированные гены между подгруппами АД

График t-SNE, основанный на нормализованной матрице экспрессии генов, дополнительно подтвердил транскрипционные подгруппы, выявленные консенсусным кластерированием. График t-SNE выявил два хорошо разделённых кластера, каждый из которых соответствует одной из ранее очерченных подгрупп (рисунок 2A), что подтверждает наличие различных молекулярных профилей у пациентов с АЦ. Дифференциальная экспрессия между двумя подгруппами затем анализировалась с помощью DESeq2 с пороговым параметром p< 0,01 и изменением сворачивания |log₂| > 1. Полученный вулканический график (рисунок 2B) показал дифференциально экспрессированные гены (DEG), что указывает на сильное транскрипционное расхождение. В топ-10 генов с повышенной регуляцией входят ABHD2, ADAR, ADCY3, ADCY9, ADD1, ADIPOR2, AFF1, AGFG1, AGRN и AHNAK в кластере 1, а также C2orf68, CTTN, GPR108, HERPUD1, LRPAP1, MAP1LC3B2, NKIRAS2, NR1H2, PDE5D и PMPCA в кластере 2 (рисунок 2C).

Набор генов, ассоциированных с подгруппой AD

Анализ обогащения наборов генов (GSEA) выявил различные функциональные профили обогащения между двумя транскриптомными кластерами (рисунок 3A). Кластер 1 продемонстрировал значительное обогащение путей, участвующих в клеточной сигнализации и адгезии, включая фокальную адгезию (рисунок 3B) и сигнальный путь MAPK (рисунок 3C), что указывает на активное состояние, характеризующееся усиленным взаимодействием клетка-клетка-клетка и внеклеточного матрикса и пролиферацией. В отличие от этого, Кластер 2 показал сильное обогащение по окислительному фосфорилированию (рисунок 3D) и функции протеасомы (рисунок 3E), что указывает на активный окислительный и протеолитический метаболический фенотип.

Соэкспрессированные гены в молекулярных группах AD

Для выявления модулей коэкспрессии, связанных с транскриптомическими подтипами, WGCNA проводился после предварительной обработки данных. Выбросы сначала были выявлены и удалены на основе иерархической кластеризации расстояний выборок для обеспечения устойчивости строительства нижней сети (рисунок 4A). Затем был выбран степень мягкого порога по критерию топологии без масштаба, при этом степень 6 выбиралась для достижения безмасштабного R² > 0,85 (рисунок 4B). Генные модули идентифицировались с помощью иерархической кластеризации и динамического вырезания деревьев, затем собственной кластеризации для слияния близкородственных модулей (рисунок 4C и рисунок 4D). Полученная генная сеть была визуализирована с помощью тепловой карты топологического перекрытия, подтверждающей наличие различных паттернов коэкспрессии генов (рисунок 4E). Анализ отношений между модулями и признаками выявил сильную и значимую корреляцию между MEyellow модулем (_ген N = 743) и молекулярной подгруппой (рисунок 4F).

Функциональное обогащение митохондриальных генов, ассоциированных с подгруппой АД

Затем был проведён анализ обогащения GO и KEGG на пересекающихся генах (N = 85) между DEGs, генах в модуле MEyellow и списке митохондриальных белков из MitoCarta3.0 (рисунок 5A) для изучения функциональной роли генов, связанных с митохондриями, определяющих транскрипционные различия между кластерами. Анализ путей KEGG выявил обогащение в окислительном фосфорилировании и метаболических путях (рисунок 5B). Анализ обогащения ГО выявил значительное перепредставление терминов, связанных с функцией митохондрий, включая синтез митохондриального АТФ, управляемый протонной силой, комплекс дыхательных цепей и активность дегидрогеназы NADH (см. рисунок 5C), что говорит о том, что эти гены в основном связаны с метаболизмом митохондриальной энергии и регуляцией энергии.

Митохондриальные гены хаба в молекулярной дифференцировке AD

Для идентификации ключевых генов в 85 генах, связанных с митохондриальными транскриптом-подгруппами, была построена сеть PPI (рисунок 6A). На основе ранжирования по каждому из семи топологических показателей (см. методы) были выбраны топ-30 генов, их пересечения проанализированы и визуализированы на графике UpSet (рисунок 6B). В результате анализа четыре гена-хаба были последовательно идентифицированы как центральные узлы по всем критериям ранжирования (BAD, BOLA1, CHCHD5, ISOC2). Их профили экспрессии были изучены в двух транскриптомических кластерах и обнаружили, что все четыре хаб-гена были значительно повышены в кластере 1 по сравнению с кластером 2 (рисунок 6C). Попарный анализ корреляции экспрессии генов показал положительную корреляцию между всеми четырьмя генами, что указывает на координированную регуляцию, при этом наиболее сильную корреляцию показали CHCHD5 и ISOC2 (рисунок 6D). Кроме того, модель классификации, построенная нами с использованием экспрессии этих четырёх генов, показала устойчивую дискриминационную силу между двумя кластерами, при этом кривая ROC показывает площадь под кривой (AUC) > 0,7 (рисунок 6E). Кроме того, был проведён анализ регуляторной сети транскрипционных факторов (TF) для изучения регуляторных механизмов, регулирующих экспрессию четырёх идентифицированных генов хаба. Все известные и предсказаемые транскрипционные факторы, которые потенциально регулируют эти хаб-гены, были запрошены из hTFtarget, а результаты интегрированы и визуализированы в транскрипционную регуляторную сеть (рисунок 7). В регуляторной сети генов TF-hub BAD имел наибольшее количество TF, а ATF3, BRD2, BRD4 и CEBPA взаимодействовали со всеми четырьмя центральными генами, что указывает на общий регуляторный механизм.

Сравнение инфильтрации иммунных клеток между подгруппами AD

Для изучения иммунологического ландшафта, связанного с транскриптомными подгруппами, был проведён анализ инфильтрации иммунных клеток с использованием CIBERSORT, который оценивает относительные доли 22 типов иммунных клеток на основе объёмных данных транскриптома (см. рисунок 8). Среди иммунных подгрупп регуляторные Т-клетки (Треги) были значительно более распространёны в Кластере 1, что указывает на иммуносупрессивную микросреду, возможно связанную с активностью митохондрий и усилением сигнальных путей в этой группе. В отличие от этого, фолликулярные хелперные Т-клетки были значительно обогащены во втором кластере, что указывает на потенциально более активный адаптивный иммунный ответ в этой подгруппе.

ДОСТУПНОСТЬ ДАННЫХ:

Транскриптомические данные, проанализированные в этом исследовании, доступны в общедоступном репозитории Gene Expression Omnibus (GEO) под номерами GSE121212, GSE157194, GSE193309 и GSE277961 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).

figure-results-1
Рисунок 1: Консенсусная кластеризация образцов поражения атопического дерматита на основе транскриптомических профилей. (A) Тепловая карта и иерархическая кластеризация консенсусной матрицы по образцам атопического дерматита (АД). (B) График консенсусной кумулятивной функции распределения (CDF), используемый для определения оптимального числа кластеров (k = 2–10). (C) График площади дельты, показывающий относительное изменение площади под кривой CDF для каждого k. (D) Присвоение консенсусного кластера для k = 2. Каждый столбец представляет отдельную выборку, а цвета указывают на составление кластера (Кластер 1, красный; Кластер 2, бирюзовый). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2: Дифференциальная экспрессия генов молекулярных подтипов атопического дерматита. (A) t-распределённый стохастический соседский вкладывающий график (t-SNE) образцов AD. Каждая точка представляет образец, проецируемый в два измерения и окрашенный в соответствии с распределением кластеров. (B) Вулканический график дифференциально экспрессированных генов (DEG) между Кластерами 1 и Кластером 2. Каждая точка представляет ген, отображаемый по изменению в log2 (по оси x) и скорректированном p-значении −log10 (оси y). Красные и синие точки указывают на значительно повышенные гены в кластере 1 и кластер 2 соответственно, а серые точки — на незначимые гены. (C) Тепловая карта десяти высокоэкспрессированных генов в кластере 1 и 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3: Анализ обогащения генных наборов молекулярных подтипов атопического дерматита. (A) Двухсторонний график с индикаторами GSEA между Кластерами 1 и Кластером 2, при этом верхние значительно обогащённые пути. Пути, обогатённые в кластере 1, показаны справа, а обогатённые в кластере 2 — слева. (B–E) Репрезентативные графики обогащения для фокальной адгезии, сигнального пути MAPK, окислительного фосфорилирования и протеасомных путей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 4: Взвешенный анализ сетей коэкспрессии генов образцов атопического дерматита. (A) Образец кластеризации дендрограммы на основе профилей экспрессии генов. (B) Индекс соответствия топологии без масштаба и средняя связность между степенями мягкого порога (1–30). (C) Кластеризация и тепловая карта собственных модулей с цветами, указывающими на парные корреляции. (D) Иерархическая кластеризация дендрограммы, показывающая гены, сгруппированные в коэкспрессированные модули. (E) Тепловая карта топологической матрицы перекрытия (TOM), отражающая сходство коэкспрессии между парами генов. (F) Тепловая карта взаимоотношений между модулем и признаком, показывающая корреляции между собственными признаками модуля и клиническими признаками. Коэффициенты корреляции отображаются внутри каждой ячейки, а интенсивность цвета указывает силу и направление корреляции (красный, положительный; синий, отрицательный). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-5
Рисунок 5: Генная онтология и обогащение митохондриальных генов, ассоциированных с подтипами, по путям KEGG.(A) Диаграмма Венна, показывающая перекрытие между DEG, модулями, ассоциированными с подтипами, и митохондриальными генами. (B) Пузырьковый график 20 обогащённых путей пересекающихся генов KEGG. (C) Топ-10 обогащённых терминов генной онтологии (GO) для биологических процессов (BP), клеточного компонента (CC) и молекулярной функции (MF). Все анализы обогащения проводились с использованием скорректированного p-значения < 0,05 (коэффициент ложного обнаружения) в качестве порога значимости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-6
Рисунок 6: Анализ взаимодействия белков и идентификация генов хаба. (A) Сеть взаимодействия белков и белков (PPI) из 85 пересекающихся генов. Узлы представляют собой белки, а рёбра — предсказанные или экспериментально проверенные взаимодействия из базы данных STRING. (B) График UpSet, показывающий пересечения между 30 топ-ранжированными генами на основе семи показателей центральности сети. (C) Графики бокса, показывающие уровни экспрессии четырёх генов-хабов в кластере 1 и кластер 2. (D) Парный корреляционный анализ между четырьмя генами хаба. (E) Кривая рабочей характеристики приёмника (ROC), показывающая классификационную характеристику, с графиком чувствительности относительно специфичности. Площадь под кривой (AUC) указывает общую точность. Статистическая значимость в панели (C) оценивалась с помощью теста ранга Уилкоксона (*p < 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-7
Рисунок 7: Регуляторная сеть генов хаба. Красные круги обозначают гены хаба, а синие — ассоциированные транскрипционные факторы (TF). Рёбра указывают на регуляторные взаимодействия. Размер каждого узла гена хаба отражает количество взаимодействующих ТФ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-8
Рисунок 8: Сравнение инфильтрации иммунных клеток между подгруппами атопического дерматита. Коробочные графики, показывающие оценочные доли 22 типов иммунных клеток в каждом кластере (Кластер 1, красный; Кластер 2, бирюзовый). Звёздочки (*) указывают статистически значимые различия между кластерами, оцениваемые с помощью теста Уилкоксона с ошибкой коэффициента обнаружения для множественных сравнений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Атопический дерматит — распространённое и генетически гетерогенное воспалительное кожное заболевание, создающее значительные трудности для индивидуальных стратегий лечения. Это исследование даёт представление о молекулярной гетерогенности АД путем выявления двух различных транскрипционных подгрупп в 266 образцах кожи с поражением у пациентов с АД. Эти подгруппы демонстрируют разные биологические функции обогащения и инфильтрацию иммунных клеток: Кластер 1 характеризуется активными клетчатыми сигнальными и адгезионными путями, а также обогащением регуляторных Т-клеток (Tregs), тогда как Кластер 2 определяется усилением окислительного фосфорилирования и функции протеасом, а также увеличением количества фолликулярных вспомогательных Т-клеток. Важно, что были выявлены четыре гена, ассоциированных с митохондриями (BAD, BOLA1, CHCHD5 и ISOC2), которые в кластере 1 апрегуляции. Они являются центральными генами в сети PPI из 85 генов, которые определяют два транскриптомических подтипа и могут одновременно регулироваться транскрипционными факторами, включая ATF3, BRD2, BRD4 и CEBPA.

Два отдельных кластера были идентифицированы на основе паттерна экспрессии генов, что свидетельствует о значительной гетерогенности экспрессии генов. Предыдущие исследования показали, что эта гетерогенность может быть вызвана генетическими, эпигенетическими и иммунно-опосредованными механизмами, определяющими различные молекулярные^{эндотипы} ^5,30,31. Между двумя кластерами также наблюдалась разная инфильтрация иммунных клеток: кластер 1 характеризуется регуляторными Т-клетками, а кластер 2 обогащён клетками фолликулярного помощника T (Tfh), что указывает на иммунологическую гетерогенность и потенциально различные механизмы заболевания в когорте AD. Кластер, доминируемый Трегом, указывает на наличие иммунной среды, где проявляются регуляторные механизмы, возможно, отражая попытки контролировать воспаление или компенсирующий ответ на хроническую иммунную^{активацию} ^32,33. Однако при AD функция Treg может быть нарушена, несмотря на увеличение показателей, что может не эффективно подавлять воспаление. В отличие от этого, кластер, обогащённый Tfh, указывает на усиленную поддержку B-клеток, повышенную активность зародышевых центров и, вероятно, повышенную выработку IgE, что является признаком аллергических реакций и более тяжёлых или внешних форм AD^34,35. Известно, что клетки Tfh поддерживают дифференцировку B-клеток и смене класса антител, а их расширение коррелирует с активностью болезни и аллергической^{сенсибилизацией 36}. Наличие этих отдельных кластеров может отражать различные клинические фенотипы, тяжесть заболевания или реакции на терапию, а также подчеркивает важность персонализированных подходов в исследованиях и лечении АД.

Известно, что дисфункция митохондрий играет значительную роль в патогенезе АД через такие механизмы, как поддержание эпидермального^{барьера 37}, производство реактивных форм^{кислорода 38} и регулирование ответа иммунных^{клеток 39}. Четыре митохондриальных белка были идентифицированы как центральные узлы генов, связанных с транскриптомической дифференциацией, которые могут предсказывать молекулярный подтип с высокой точностью (AUC>0.7). Хотя ни одно предыдущее исследование не показывало прямой связи этих генов с АД, эти результаты свидетельствуют о потенциальных биомаркерах для стратификации пациентов с АД и оценки дисфункции митохондрий у пациентов с АД. BAD (BCL2-ассоциированный агонист гибели клеток) — проапоптотический представитель семейства BCL-2, участвующий в митохондриальной апоптотической сигнализации; его апрегуляция в Кластере 1 может отражать усиленное митохондриальное апоптотическое праймирование в этом подтипе. BOLA1 — это митохондриальный белок, участвующий в биогенезе железо-серных кластеров и регуляции окислительного стресса. CHCHD5 (домен спираль спираль с спиралью с спиралью с 5 дюймов, содержащий 5) — это белок внутренней мембраны митохондриальной мембраны, связанный с организацией кристалов и эффективностью цепочки переноса электронов. ISOC2 (домен изохоризматазы, содержащий 2) связан с метаболическими процессами и функцией митохондрий. Координированная апрегуляция этих четырёх генов в Кластере 1 указывает на состояние повышенной митохондриальной метаболической активности и апоптотической сигнализации в этой подгруппе AD.

У этого исследования есть несколько ограничений. Хотя в этом исследовании были выявлены две молекулярные подгруппы с разной экспрессией генов в митохондриальных генах и разделённой инфильтрацией иммунных клеток, нам не хватает подробных клинических фенотипов, которые позволили бы сопоставить стратификацию с тяжестью заболевания и продольной реакцией на лечение. Чтобы полностью понять, что означает высокая экспрессия этих четырёх центральных генов в кластере 1, будущие исследования должны интегрировать комплексные клинические метаданные и, в идеале, выполнять функциональную валидацию в кератиноцитных или мышиных моделях. Кроме того, данное исследование опирается на общедоступные данные по объёму РНК-секвенс; Хотя он мощен в масштабном анализе, у него недостает разрешение в отдельных типах клеток. Это ограничение затрудняет определение, происходит ли наблюдаемая дифференциальная экспрессия митохондриальных генов от кератиноцитов, инфильтрирующих иммунных клеток или других популяций клеток, проживающих в коже. С широким использованием одноклеточных и пространственных транскриптомических подходов будущие исследования значительно выиграют от возможности деконволюции экспрессионных сигналов и предоставления более точного обзора транскриптомического профиля на клеточном уровне. Кроме того, все данные были получены из биопсийных образцов пуншированной обработки, которые берут образцы кожи всей толщины. Будущие исследования с использованием ленточной РНК-секвенции могут предложить комплементарный неинвазивный подход к профилированию поверхностного эпидермального транскриптома и подтвердить выявленные подгруппы в минимально инвазивных условиях. Будущая интеграция одноклеточных РНК-секвенсоров и пространственных транскриптомических данных ещё больше продвисит разрешение специфических к типу клеток митохондриальных сигнатур в коже АД.

В заключение в этом исследовании была изучена транскриптомическая гетерогенность АД в 266 образцах, выявлены ключевые митохондриальные гены и уникальная инфильтрация иммунных клеток, дифференцировав подгруппы. Эти результаты улучшают понимание молекулярной гетерогенности АД и подчёркивают потенциал разработки методов прецизионного лечения на основе специфических молекулярных профилей.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ни одного.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
CIBERSORT	Стэнфордский университет	v0.1.0; деконволюцию иммунных клеток; https://cibersortx.stanford.edu
clusterProfiler	Биопроводник	v4.12.6; анализ обогащения GSEA и GO/KEGG; https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler
ConsensusClusterPlus	Биопроводник	v1.64.0; неконтролируемое консенсусное кластерирование; https://bioconductor.org/packages/ConsensusClusterPlus
DESeq2	Биопроводник	v1.46.0; дифференциальный анализ экспрессии генов; https://bioconductor.org/packages/DESeq2
Омнибус экспрессии генов (GEO)	NCBI	Публичный репозиторий транскриптомических данных; наборы данных GSE121212, GSE157194, GSE193309, GSE277961; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo
ggplot2	CRAN	визуализацию данных; https://ggplot2.tidyverse.org
GGRAPH	CRAN	Визуализация графов и сетей; https://ggraph.data-imaginist.com
GseaVis	GitHub (junjunlab)	v0.1.0; визуализация GSEA; https://github.com/junjunlab/GseaVis
hTFtarget	Хуачжунский университет науки и технологий	Базу данных целевых факторов транскрипции; http://bioinfo.life.hust.edu.cn/hTFtarget
iGraph	CRAN	Построение и визуализация сети; https://igraph.org
Лимма	Биопроводник	удалить функцию BatchEffect; https://bioconductor.org/packages/limma
MitoCarta3.0	Институт Броуд	Кураторская база белков митохондриальных белков; https://www.broadinstitute.org/mitocarta
MSigDB (наборы генов Hallmark)	Институт Броуд	База данных наборов генов для GSEA; https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb
org. Hs.eg.db	Биопроводник	базу данных аннотаций человеческого генома; https://bioconductor.org/packages/org.Hs.eg.db
R	Команда R Core	Среду статистических вычислений; https://www.r-project.org
СТРУНА	EMBL	v12.0; базу данных взаимодействия белка и белка; https://string-db.org
sva (ComBat-seq)	Биопроводник	v3.44.0; пакетная корекция; https://bioconductor.org/packages/sva
WGCNA	CRAN	v1.73; взвешенный анализ коэкспрессии генов; https://cran.r-project.org/package=WGCNA

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Транскриптомический анализ выявил митохондриально управляемые подгруппы в поражениях атопического дерматита

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles