Целью данного исследования было изучение влияния тимохинона на окислительный стресс, сигнальный путь Keap-1/Nrf-2 и поведение в плазме, коре головного мозга и гиппокампе крыс, подвергшихся воздействию бисфенола A.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Целью данного исследования было изучение влияния тимохинона на окислительный стресс, сигнальный путь Keap-1/Nrf-2 и поведение в плазме, коре головного мозга и гиппокампе крыс, подвергшихся воздействию бисфенола A.
Хроническое воздействие в низких дозах бисфенолу А (BPA), широко используемого эндокринного разрушителя окружающей среды, всё чаще ассоциируется с нейротоксичностью, вызванной окислительным стрессом. Тимохинон (TQ), биоактивный компонент Nigella sativa, обладает мощными антиоксидантными свойствами; однако его нейропротекторный потенциал против токсичности, вызванной BPA, остаётся неполностью изученным. Учитывая повсеместный характер воздействия BPA, выявление эффективных и доступных нейропротективных стратегий становится всё более важным. В этом исследовании изучали влияние TQ на окислительный стресс, сигнализацию Keap-1/Nrf-2, поведение и гистопатологические изменения у крыс, подвергшихся воздействию BPA. Всего 24 взрослых самца крыс Wistar Albinose были случайным образом распределены в четыре группы (n = 6/группа): контрольная, BPA, BPA + 10 мг/кг TQ (BPA+TQ I) и BPA + 20 мг/кг TQ (BPA+TQ II). BPA (50 мкг/кг) и ТК вводились внутрижелудочно в течение 30 дней. Воздействие BPA вызывало значительные поведенческие нарушения, окисляющий стресс, нарушение сигнализации Keap-1/Nrf-2 и выраженное гистопатологическое повреждение гиппокампа и коры головного мозга. Лечение TQ значительно улучшило локомоторную активность и поведение, похожее на депрессию, снизило перекисление липидов и уровень оксида азота, восстановило антиоксидантную способность, связанную с глутатионом, и нормализовало экспрессию Keap-1 и Nrf-2 (p < 0,001). Эти защитные эффекты были более выражены при более высокой дозе TQ. В совокупности эти результаты показывают, что тимохинон смягчает нейротоксичность, вызванную BPA, за счёт модуляции окислительного стресса и сигнального пути Keap-1/Nrf-2, что подчеркивает его потенциал как нейропротекторного агента против экологически значимого воздействия BPA.
Бисфенол А (BPA) — это синтетическое соединение, широко используемое в пластиках и эпоксидных смолах, которое часто обнаруживается в пищевых упаковочных материалах, водных системах, медицинских устройствах и бытовыхтоварах. 1. Постоянное воздействие окружающей среды вызывает опасения по поводу возможных нейротоксичных эффектов, особенно при хронических условиях низкой дозы, отражающих реальное воздействие человека.
Хотя регулирующие органы, такие как Управление по контролю за продуктами и лекарствами США и Агентство по охране окружающей среды США, определили 50 мкг/кг/день как уровень отсутствия наблюдаемого негативного эффекта, новые экспериментальные и эпидемиологические данные указывают на то, что поведенческие и когнитивные изменения могут происходить при более низких дозах. В результате допустимое ежедневное потребление в Европе было снижено до 4 мкг/кг/день, что подчёркивает необходимость изучения механистических эффектов экологически значимого воздействия BPA 1,2.
Окислительный стресс считается центральным механизмом, лежащим в основе нейротоксичности, вызванной BPA. BPA нарушает клеточный редокс-баланс, снижая антиоксидантную защиту, такую как глутатион (GSH), и увеличивая маркеры перекисления липид, включая малондальдегид (MDA)3,4. Однако верхние регуляторные механизмы, контролирующие антиоксидантные ответы при воздействии BPA, остаются недостаточно охарактеризованными.
Кельч-подобный ECH-ассоциированный путь белка 1 (Keap-1)/ядерного фактора, связанного с фактором эритроида 2 (Nrf-2), является основным эндогенным антиоксидантным защитным механизмом. В условиях окислительного стресса Nrf-2 диссоциирует от Keap-1, транслоцируется в ядро и активирует экспрессию генов с антиоксидантным ответом наэлементы. Несмотря на установленную роль в клеточной защите, регионально-специфическая модуляция сигнализации Keap-1/NRF-2 в мозге во время экологически значимого воздействия BPA не была всесторонне изучена вместе с поведенческими результатами.
Тимохинон (TQ), основной биоактивный компонент масла семян Nigella sativa, представляет собой липофильный бензохинон, способный преодолевать гематоэнцефалический барьер. TQ обладает антиоксидантными, противовоспалительными и противоапоптотическими свойствами, отчасти за счёт активации сигнализации Nrf-2 и усиления эндогеннойантиоксидантной способности 5,6. Хотя предыдущие исследования демонстрировали защитные эффекты TQ в различных моделях нейротоксичности, интегрированного методологического подхода к оценке маркеров окислительного стресса, сигнализации Keap-1/Nrf-2 и поведенческих параметров в рамках той же парадигмы воздействия BPAотсутствует 5,6,7.
Здесь мы описываем воспроизводимый экспериментальный протокол для оценки биомаркеров окислительного стресса, экспрессии путей Keap-1/Nrf-2 и поведенческих изменений в модели воздействия BPA на крыс, а также для оценки нейропротективного эффекта тимохинона на несколько областей мозга.
Мы выдвинули гипотезу, что воздействие низких доз BPA вызывает поведенческие нарушения из-за окислительного стресса дисрегуляции сигнального пути Keap-1/Nrf-2, а тимохинон смягчает эти эффекты, восстанавливая окислительный баланс и активируя антиоксидантные ответы, зависящие от Nrf-2.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Все экспериментальные процедуры были одобрены Местным этическим комитетом по институциональному экспериментированию на животных (Одобрение No 68429034/07).
Животные и экспериментальный дизайн
Двадцать четыре взрослых самца крыс Wistar Albinose (200–250 г) были взяты в Экспериментальной лаборатории исследований животных и содержались индивидуально в контролируемых условиях (12 часов цикл свет/темнота, 24 ± 2 °C ) с импровизированным доступом к стандартной еде и водопроводной воде. Животные были акклиматизированы к лабораторным условиям перед экспериментом, который длился 32 дня.
Крысы были случайным образом распределены по экспериментальным группам с использованием компьютерного простого метода рандомизации для минимизации смещения отбора, при этом в каждой группе распределено равное количество животных (n = 6/группа): контрольная, BPA, BPA + 10 мг/кг тимохинон (BPA + TQ I) и BPA + 20 мг/кг тимохинон (BPA + TQ II). Размер выборки был определен априорным анализом мощности с использованием программного обеспечения G*Power (версия 3.1). На основе размеров эффектов, описанных в предыдущих исследованиях 5,6,7, оценивающих нейротоксичность, вызванную BPA, и антиоксидантные вмешательства, особенно для биохимических и поведенческих показателей, для одностороннего ANOVA предполагалась статистическая мощность 0,80. В таких условиях для выявления статистически значимых различий между экспериментальными группами требовалось минимум шесть животных в группе.
BPA (50 мкг/кг) и TQ (10 или 20 мг/кг) вводились внутрижелудочно с помощью гаважа 1 раз в день в течение 30 дней. Все методы обработки были свежеприготовлены и введены в общем объёме 1 мл/кг. Доза BPA, используемая в настоящем исследовании (50 мкг/кг/день), была выбрана на основе её определения как уровня и эталонной дозы Агентством по охране окружающей среды США и Управлением по контролю за продуктами за продуктами и лекарствами США. Эта доза широко применялась в экспериментальных исследованиях для моделирования экологически значимого воздействия BPA и изучения возможных нейроповеденческих и биохимических изменений, происходящих на ранее считавшихся безопасных уровнях воздействия. Важно, что накопление экспериментальных данных указывает на то, что неблагоприятные неврологические и поведенческие эффекты могут возникать при или ниже этой дозы, что подтверждает её значимость для оценки токсичности низкодозового BPA 1,2. Выбор доз TQ (10 и 20 мг/кг) основывался на предыдущих экспериментальных исследованиях, демонстрировавших его нейропротективную и антиоксидантную эффективность без индукциитоксичности 5,6,7. Эти дозы широко используются в моделях нейротоксичности, окислительного стресса и нейровоспаления у грызунов, и значительно ниже зарегистрированных порогов токсичности при повторном введении. Пилотное исследование по определению дозы не проводилось; Выбор дозы основывался на литературных прецедентах и установленных профилях безопасности для обеспечения как эффективности, так и трансляционной значимости.
BPA вводилась в течение 30 дней подряд. Поведенческие оценки проводились на 31-й и 32-й день после финального контакта. Животных приносили в жертву на 32-й день после завершения всех поведенческих тестов. Этот график был разработан для обеспечения достаточного времени для поведенческой оценки, минимизируя потенциально запутанные эффекты острого обращения или процедурного стресса на последующие биохимические, молекулярные и гистопатологические анализы. Тимохинон вводили 1 раза в день сразу после BPA тем же внутрижелудочным путём. Поведенческие тесты проводились после окончательного введения BPA и TQ. Хронология экспериментов изложена на рисунке 1.
Измерение массы тела
Вес тела измерялся с помощью калиброванного цифрового точного веса (чувствительность ±0,1 г). Каждую крысу взвешивали индивидуально утром перед введением лечения, а измерения записывались на 1, 10, 20 и 32 дни в стандартизированных условиях для минимизации вариабельности (см. рисунок 2).
Поведенческие оценки
Все поведенческие параметры оценивались одним наблюдателем, ослеплённым к распределению групп, чтобы минимизировать смещение наблюдателей и изменчивость между наблюдателями. Животных привыкли к тестовой комнате не менее 30 минут до проведения поведенческого тестирования, чтобы снизить стресс, вызванный новизной.
Совместное использование теста на открытом поле (OFT) и теста принудительного плавания (FST) позволяет всесторонне оценить токсичность нейроповеденческой токсичности, вызванной BPA, поскольку BPA (BPA) влияет как на эмоциональную реактивность, так и на локомоторную активность угрызунов 2,3. При интерпретации неподвижности FST рассматривались исходы локомоторных результатов, чтобы минимизировать возможные сбивает с толку, связанные с изменённой моторной активностью.
FST: Поведение, похожее на депрессию, оценивалось с помощью теста на принудительное плавание на 32-й день, предшествовавшего 15-минутной предварительной сессии, проведённой за 24 часа до этого. Крыс помещали в цилиндрические резервуары (диаметром 35 см, высотой 50 см), наполненные водой (глубина 30 см, температура 25 ± 1 °C), и давались плавать в течение 5 минут. Неподвижность, плавание и поведение при лазании фиксировались с помощью видеокамеры и анализировались офлайн для оценки поведенческогоотчаяния 7.
OFT: Поведение, похожее на тревогу, и спонтанная локомоторная активность были оценены с помощью теста на открытом поле на 31-й день. Каждую крысу помещали отдельно в белую арену из плексигласа (90 см x 35 см), разделённую на 24 равных квадрата, и позволяли свободно исследовать её в течение 5 минут. Движения фиксировались с помощью видеокамеры. Время, проведённое в центральной и периферической зонах, а также количество скрещиваний всеми четырьмя лапами количественно оценивались как показатели поведения, связанного с тревогой, илокомоции 8.
Сбор образцов
На 32-й день крыс были глубоко обезболены внутримышечным кетамином (45 мг/кг) и ксилазином (5 мг/кг). Адекватная глубина анестезии подтверждалась отсутствием рефлекса отъёма педалей. Кровь собиралась с помощью сердечной пункции с помощью стерильного шприца, и от каждого животного получалось примерно 3–5 мл крови. Эвтаназия завершалась эксагвинацией под глубокой анестезией. Образцы крови были перенесены в пробирки с антикоагулянтами и центрифугированы при 3000 x г в течение 10–15 минут при 4 °C. Отделённая плазма была алицитирована и сохранена при −80 °C до биохимического анализа.
Гиппокамп и левое полушарие мозга были быстро вскрыты, взвещены, заморожены в жидком азоте и хранятся при −80 °C для последующих биохимических анализов, в то время как правое полушарие мозга фиксировалось в 10% нейтральном буферном формалине для гистопатологических и иммуногистохимических оценок. Для обеспечения методологической согласованности и минимизации изменчивости между образцами левое полушарие систематически выделялось для биохимических измерений, а правое полушарие — для морфологических анализов у всех животных. Важно, что фиксация формалина строго ограничивалась тканями, предназначенными для гистологических и иммуногистохимических процедур, и фиксированная ткань не использовалась для биохимических анализов на основе белков, что предотвращало деградацию белков, связанную с фиксацией. Для биохимических оценок определённые количества замороженной мозговой ткани (обычно 50-100 мг на анализ) были гомогенизированы с помощью специфических буферов гомогенизации и стандартизированных соотношений тканей к буферам в соответствии с требованиями каждого биохимического параметра. Все анализы проводились с использованием одинаковых количества тканей в каждом анализе в экспериментальных группах.
Общая концентрация белка в гомогенатах тканей была определена с помощью флуорометрического белкового анализа согласно инструкциям производителя. Все биохимические параметры измерялись с использованием стандартизированных и равных концентраций белка в каждом анализе для обеспечения сопоставимости между образцами и экспериментальными группами.
Оценка параметров окислительного напряжения
Перекисление липидов оценивалось путём измерения уровней MDA с использованием метода реактивных веществ тиобарбитуровой кислоты (TBARS) в образцах плазмыи тканей 7. Сниженные уровни тиола (RSH) и GSH были определены спектрофотометрически с помощью анализов на основе 5,5′-дитиобиса (2-нитробензойной кислоты) (DTNB) 7. Общий уровень оксида азота (NO) в гомогенатах плазмы и тканей измерялся с помощью реакции Грисса после восстановлениянитратов 7. Все биохимические параметры экспрессируются в виде белка нмоль/г или ткани, как показано на рисунках 3 и 4. Все биохимические анализы проводились в дубликате, а для статистического анализа использовались средние значения.
Помимо анализа тканей мозга, были проведены биохимические оценки в образцах крови для оценки системного окислительного состояния, вызванного воздействием BPA. Уровни перекисления липидов в плазме были определены методом TBARS, а результаты были представлены в эквиваленте MDA. Сниженные уровни сульфгидрила (RSH) измерялись с помощью DTNB, а общий уровень NO — с помощью реакции Грисса после восстановления нитратов, как описаноранее 7. Значения поглощения были зафиксированы спектрофотометрически на расстоянии 532 нм (TBARS), 412 нм (RSH) и 540 нм (NO). Все анализы проводились в дублировании при стандартизированных условиях.
BPA — это повсеместный токсикант в окружающей среде, который проникает в системный кровообращение и оказывает многоорганное воздействие; Таким образом, циркулирующие маркеры окислительного стресса предоставляют дополнительную информацию, отражающую общий редокс-дисбаланс 1,2. Оценка биохимических параметров на основе крови позволяет оценить связь между центральными и периферическими окислительными изменениями и повышает трансляционную значимость полученных данных, поскольку такие маркеры часто используются в экологических и клинических исследованиях для мониторинга токсичности, связанной с воздействием.
Вестерн-блот анализ
Для определения уровней белков Keap-1 и Nrf-2 в ткани гиппокампа был проведён вестерн-блот-анализ. Примерно 50 мг ткани было гомогенизировано в 500 мкл буфера RIPA, содержащем коктейль ингибитора протеазы. Гомогенаты были центрифугированы при 14 000 x г в течение 10 минут при 4 °C, после чего супернатанты собирались. Концентрации белков определялись с помощью флуорометрического количественного анализа белков согласно инструкциям производителя, а концентрации — по стандартной калибровочной кривой. Равные количества белка (30 мкг) смешивались с буфером Laemmli с β-меркаптоэтанолом, нагревались при 95 °C в течение 5 минут, разделялись на 10% гелях SDS-PAGE и передавались на мембраны PVDF при 110 В в течение 60-90 минут. Мембраны блокировались 3% BSA и инкубировали ночью при 4 °C с первичными антителами против Keap-1 и Nrf-2 (1:3000) и β-актина (1:1000), после чего следовала инкубация вторичными антителами, конъюгированными с HRP. Белковые полосы визуализировались с помощью хемилюминесценции, а интенсивность зон количественно определялась денситометрическим анализом и нормализовывалась до β-актина.
Гистопатологический анализ
Образцы ткани мозга из правого полушария фиксировались в 10% нейтральном буферном формалине в течение 72 часа, дегидрированы с помощью градуированных серий этаноло, очищены в ксилоле и вмещены в парафин согласно стандартным гистологическимпроцедурам 9. Свежие ткани были зарезервированы для биохимических анализов. Корональные срезы (5 мкм) были получены на уровнях гиппокампальной и энторинальной коры на основе атласа мозгакрысы 10. Четыре последовательных сечения на животное устанавливались на стеклянные стекли для гистологических и иммуногистохимических оценок, обеспечивая единообразную толщину сечения и анатомическую локализацию. Срезы были депарафинированы, регидратированы и окрашены гематоксилином и эозином (H&E) согласно рутинным протоколамокрашивания 11. Гистопатологическое исследование проводилось под световой микроскопией одним обученным наблюдателем, ослеплённым к экспериментальным группам, чтобы минимизировать смещённость и устранить изменчивость между наблюдателями.
Иммуногистохимический анализ
Интересующиеся области, включая гиппокамп и энторинальную кору, были отобраны на основе их уязвимости к нейротоксичности, вызванной BPA, и роли в когнитивной и эмоциональнойрегуляции 1,2. Иммуногистохимическое окрашивание для Nrf-2 и Keap-1 проводилось на парафиновых срезах мозга. Срезы депарафинизировались в ксилоле, регидратировались через градуированные серии этанолов и подвергались тепловому извлечению антигена в цитратном буфере (pH 6,0). Активность эндогенной пероксидазы была закалена перед инкубацией.
Секции инкубировали ночью при 4 °C с первичными антителами против Nrf-2 (1:100) и Keap-1 (1:200). Обнаружение проводилось с помощью коммерчески доступной, готовой к использованию полимерной системы обнаружения HRP, содержащей видоспецифические вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена, согласно инструкции производителя. Иммунореактивность визуализовалась с использованием 3,3′-диаминобензидина (DAB) в качестве хромогена, после чего следовало контрокрашивание гематоксилином. Участки были обезвожены, очищены и укрытием.
Отрицательные контрольные срезы обрабатывались параллельно без инкубации первичных антител. Для количественного анализа оценивались три несмежных сечения на животное. Изображения были сделаны при одинаковых настройках экспозиции для всех групп. Шестнадцать неперекрывающихся полей на секцию анализировались с помощью программного обеспечения ImageJ. Интересующие области были выделены вручную, фоновое окрашивание вычиталось, а иммунореактивность выражалась в среднем сером значении. Среднее значение на животное было рассчитано и использовано для статистического анализа.
Гистопатологическая оценка
Гистопатологические изменения оценивались полуколичественно на срезах, окрашиваемых H&E. Десять случайно выбранных, не пересекающихся полей в каждом разделе были изучены, а патологические параметры оценивались независимо. Степень повреждения гиппокампа и коры энторина оценивалась по четырёхбалльной шкале на основе доли поражённых клеток: балл 0 (<5%), балл 1 (≤ одна треть), балл 2 (от одной трети до двух третей) и балл 3 (> две трети). Средние баллы на животное использовались для статистического анализа.
Статистический анализ
Данные анализировались с помощью программного обеспечения SPSS (версия 29.0) и представлены как среднее ± стандартное отклонение (SD). Размер выборки был определен на основе предыдущих исследований и анализа мощности, что показало, что шесть животных в каждой группе обеспечивают >80% мощности для выявления биологически значимых различий. Нормальность распределения данных оценивалась с помощью теста Шапиро-Вилка. Однородность дисперсий оценивалась с помощью теста Левена. Сравнения групп проводились с использованием одностороннего анализа дисперсии (ANOVA), после чего последовал пост-хок тест Тьюки. Статистическая значимость была установлена на уровне p < 0,05.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Масса тела
Статистически значимые различия в массе тела между группами на 1 и 32 дни исследования не наблюдались (F(3,20)=2,750, p > 0,05; Рисунок 2).
Результаты поведенческих тестов
Анализ открытых полевых испытаний показал, что воздействие BPA значительно снижало локомоторную активность, что подтверждается уменьшением числа пересечений по сравнению с контрольной группой (p < 0...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
В настоящем исследовании оценивались эффекты BPA — структурного компонента поликарбонатного пластика, считающегося безопасным USEPA при дозе 50 мкг/кг 1,2, на окислительный стресс, сигнализацию Keap-1/Nrf-2, поведение и гистопатологические изменения в мозге крысы. Кроме того, были исследованы потенциальные нейропротекторные эффекты TQ — природного соединения с хорошо задокументированными антиоксидантными свойствами — в двух разны...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
У авторов нет конфликта интересов, которые можно было бы заявлять.
Этот проект был поддержан Офисом координации научно-исследовательских проектов университета (номер проекта TIP. A4.24.003).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 5,5'-Дитиобис(2-нитробензойная кислота) | Thermo Scientific | 69-78-3 | |
| Настольная центрифуга NF048 | Nüve | 43560 | |
| Beta_Actin | ThermoFisher Scientific, United States | 7D2C10 | |
| Бисфенол A | Merck | 239658 | |
| Разбавленный раствор БСА | Proteintech, United States) | 66201-1-Ig | |
| Бутиллированный гидрокситолуол | Sigma Aldrich | 128-37-0 | |
| Джитальный гомогенизаторör | Daihan Scientific | https://www.artlaboratuvarcih azlari.com/urun/daihan-hg- 15d-dijital-homojenizator-set -a?srsltid=AfmBOorx_az06ulc HpSzKZsuP8-47Za4BkvLOM2 2Xhp00tgwWhJ-86Vc | |
| Гематоксилин–эозин | Bio Optica | W01030708 | |
| Соляная кислота | Merck | 7647-01-0 | |
| Программа Image J | NIH; Washington, U.S.A. | https://imagej.net/ij/ | |
| Набор для иммуногистохимического окрашивания | Lab VisionTM UltraVisionTM Large Volume Detection System: anti-polyvalent | HRP, TA-125-HL | |
| Leica Autocut 14051956472 | Germany | https://www.leicabiosystems. com/histology-equipment/mic rotomes/histocore-autocut/ | |
| Легкий микроскоп | Nikon, Eclipse | Ni-U, 940728 | |
| N-(1-Нафтил)этилендиамин | Thermo Scientific | 1465-25-4 | |
| Nano Microplate Reader | BMG LABTECH | SPECTROstar Nano | |
| Фосфатно-буферный раствор соли | Merck | P4417 | |
| Первичные антитела Keap-1 | Proteintech | Cat No. 10503-2-AP, 1:200 | |
| Первичные антитела Nrf-2 | Proteintech | Cat No. 16396-1-AP, 1/100 | |
| Набор Qubit Protein BR Assay | ThermoFisher Scientific-INVITROGEN | Q33211 | |
| Цитрат натрия | Merck | 03-04-6132 | |
| Додециловый сульфат натрия | Thermo Scientific | 151-21-3 | |
| Гидроксид натрия | Merck | 1310-73-2 | |
| Нитрат натрия | Merck | 7631-99-4 | |
| Стрептавидин-пероксидаза | Thermo Scientific | SHRP248-B | |
| сульфаниламид | Thermo Scientific | 63-74-1 | |
| Тиобарбитуровая кислота | Merck | 504-17-6 | |
| TQ | CAYMAN | 490-91-5 | |
| Трикарбалловая кислота, 99% | Thermo Scientific Chemicals | 139360500 | |
| Трихлоруксусная кислота | Thermo Scientific Chemicals | 76-03-9 | |
| Трис-HCl | Thermo Scientific | 1185-53-1 | |
| Хлорид ванадия(III) | Sigma Aldrich | 7718-98-1 | |
| West Pico PLUS хемилюминесцентный субстрат и iBright 750 | Thermo Fisher Scientific system | https://www.clinxsci.com/product/mini _chemiluminescence_imaging_system ?gad_source=1&gad_campaignid= 16224184202&gbraid=0AAAAAoN6 UOOtoB8UD0deumBAMD8Xi-1l-&g clid=CjwKCAjwgeLHBhBuEiwA L5gNEXtK2CNSLS1GqllMuNgkrFYD aW7yK585njQjFja485Fkwj9lRUEKD BoCgLoQAvD_BwE | |
| Раствор сульфата цинка | Merck | 7733-02-0 |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.