Влияние на качество РНК PBMC при различных временах криоконсервации и методах обработки у пациентов с прогрессирующим немелкоклеточным раком лёгких

Краткое содержание

В данном исследовании сравниваются реагенты с тройной изоляцией (TRIzol) и классический раствор (FBS + DMSO) для криопрезервированных НМРЛ пациентов с НМРЛ. TRIzol поддерживает удовлетворительную целостность РНК до 6 месяцев, что делает его рекомендованным для высококачественного сохранения РНК.

Аннотация

Криоконсервированные периферические мононуклеарные клетки крови (PBMC) широко используются в секвенировании РНК (RNA-seq), и качество их РНК напрямую влияет на результаты тестов. Однако криоконсервация может легко привести к деградации РНК в PBMC, и вопрос о том, как улучшить качество РНК при долгосрочной криоконсервации, остаётся нерешённым. В качестве контроля использовались PBMCs из свежих образцов крови, собранных у пациентов с прогрессирующим немелкоклеточным раком лёгких (НМРЛ). Эффективность сохранения РНК образцов PBMC сравнивалась между классическим раствором криоконсервации клеток (90% сыворотки плода крупного рогатого скота [FBS] + 10% диметилсульфоксид [DMSO]) и общим реагентом для экстракции РНК (TRIzol) при -80 °C в течение 1, 3 и 6 месяцев. Концентрация, чистота и целостность РНК (измеряемые числом целостности РНК [RIN]) оценивались с помощью многообразцового микрообъёмного УФ-ВИС-спектрофотометра и автоматизированного микрофлюидного электрофоретического биоанализатора для создания теоретической основы для сохранения высококачественных образцов РНК. Это исследование показало, что концентрация, чистота и целостность РНК в ПБМК снижаются при увеличении продолжительности криоконсервации. Хотя оба метода обработки не влияли на концентрацию РНК, они влияли на чистоту и целостность РНК. Целостность РНК PBMC, криоконсервированных с TRIzol в течение 6 месяцев, оставалась удовлетворительной. Наши результаты показывают, что TRIzol способствует эффективному криосохранению и поддерживает высокое качество РНК.

Введение

РНК-секвенция PBMC у пациентов с НМРЛ играет ключевую роль в оценке эффективности иммунотерапии. Немелкоклеточный рак лёгких (НМРЛ) — распространённая злокачественная опухоль во всём мире, и около 70% пациентов диагностируют на поздней стадии с неблагоприятным^{прогнозом 1,2}. Иммунотерапия произвела революцию в парадигме лечения НМРЛ, предлагая инновационные терапевтические^{стратегии 3,4}. При лечении ингибиторов иммунных контрольных точек (ICI) секвенирование РНК (РНК-секвенирование) периферических мононуклеарных клеток (PBMC), полученных у пациентов с НМРЛ, позволяет отслеживать динамические изменения клинических преимуществ иммунотерапии⁵. Источники образцов для РНК-секвенции включают опухолевые ткани и^{PBMCs 6,7}, при этом PBMC служат жизненно важным биологическим образцом как в клинических испытаниях, так и в фундаментальных^{научных исследованиях 8}. Криоконсервация является основным методом длительного хранения образцов, поддерживая клетки и ткани в состоянии покоя при сохранении их биологического потенциала и характеристик. В результате криоконсервация ПБМС стала возможным и широко распространённым подходом. Криоконсервированный PBMC облегчает партийный анализ образцов, минимизирует внутрилабораторную и межлабораторную вариабельность, а также оптимизирует использование^{ресурсов 8,9}. Например, исследования показали, что использование замороженной среды RPMI-1640 с добавлением 40% сыворотки плода телята (FCS) и 20% диметилсульфоксида (DMSO) для криоконсервации PBMC демонстрирует, что доли T и B-клеток, экспрессирующих комбинацию CD39 и CD73, оставались относительно стабильными в течение шести месяцев после хранения¹⁰. В одном исследовании сравнивали три коммерческих криоконсервационных комплекта и два криопротекторных агента (90% RPMI-10% DMSO, 90% плазма-10% DMSO), выявив схожие показатели жизнеспособности клеток (81,0%) и показатели восстановления (73,7%) по разным методам. Однако все криоконсервированные PBMC демонстрировали значительно сниженную жизнеспособность по сравнению с свежими^{образцами 5}. Дальнейшие исследования показали, что ресуспендированный PBMC осаждается в реагенте TRIzol и немедленно замораживает их при -80 °C. Через 1–2 дня они обнаружили, что RIN у PBMC выше, чем у цельных образцов^{крови 11}.

Другое исследование сравнивало образцы лейкоцитов, обработанные TRIzol, RNAlater и другими реагентами, показав, что все методы достигали значения целостности РНК (RIN) >7. Целостность РНК оценивалась с помощью автоматизированного микрофлюидного электрофоретического биоанализатора, а RIN рассчитывался как количественная мера качества РНК. Образцы с RIN ≥7 были признаны подходящими для анализа RNA-seq¹². Примечательно, что группа лейкоцитов + РНКlater демонстрировала значительно меньший выход РНК по сравнению с лейкоцитарной + ТРИзольной^{группой 12}. Однако современные исследования криоконсервации PBMC преимущественно сосредоточены на жизнеспособности клеток и анализе фенотипов иммунных клеток после оттаивания; Мало внимания уделялось систематической долгосрочной оценке качества РНК при различных условиях сохранения. Кроме того, стандартизированные протоколы для криорезервирования образцов PBMC с целью сохранения целостности РНК остаются^{недоработанными} 13,14,15. Этот разрыв особенно важен для иммунотерапии НМРЛ, где высококачественная РНК из продолго собранных ПБМК необходима для надёжного обнаружения биомаркеров и мониторинга ответа на лечение.

В этом исследовании мы выдвигаем гипотезу, что выбор метода криоконсервации существенно влияет на долгосрочную целостность и качество РНК, полученных из PBMC, и оптимизированный протокол может поддерживать пригодность РНК для чувствительных анализов, таких как RNA-seq. Для решения этой проблемы в качестве контроля использовались свежеизолированные ПБМК из образцов крови, собранных у пациентов с прогрессирующим НМРЛ. Эффективность сохранения РНК образцов PBMC сравнивалась между двумя методами лечения (90% FBS + 10% DMSO и TRIzol) при -80 °C в течение 1, 3 и 6 месяцев (см. рисунок 1). Концентрация, чистота и целостность РНК (измеряемые с помощью RIN) оценивались с помощью многообразцового спектрометра UV-Vis и автоматического микрофлюидного электрофоретического биоанализатора. Данное исследование направлено на создание теоретической основы для сохранения образцов РНК высокого качества и развитие трансляционных исследований и сохранения образцов в прецизионной медицине опухолей.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами человеческих тканей и клиническими образцами в этом исследовании, были выполнены в соответствии с институциональными рекомендациями и одобрены Этическим комитетом онкологической больницы Цзилинь (этическое одобрение No 202507-002-01). Письменное информированное согласие было получено от всех участников или их законных опекунов перед сбором образца. Периферические образцы крови (10 мл на пациента) были собраны у 19 пациентов с выраженным немелкоклеточным раком лёгких (НМРЛ) в онкологической больнице Цзилинь, получив всего 133 образца РНК. Для обеспечения безопасности лабораторий все операции с опасными химикатами выполнялись в биологическом шкафу безопасности.

Подробная информация об инструментах, реагентах и расходных материалах, использованных в эксперименте, была предоставлена в Таблице материалов.

Изоляция PBMC
Образцы периферической крови были обработаны для выделения PBMC в течение 2 часов после сбора. PBMC были выделены и очищены с помощью центрифугации по градиенту плотности Фиколла-Пака при 400 × г в течение 25 минут при комнатной температуре с отключённым тормозом. После центрифугирования промежуточный молочно-белый лимфоцитный слой (содержащий PBMC) был аккуратно^{аспирирован 16}. Важно отметить, что мы строго стандартизировали входную концентрацию PBMC для каждого образца и каждой группы, чтобы обеспечить согласованное количество клеток во всех экспериментальных условиях, минимизируя вариации, вызванные вводом и обработкой клеток. Это гарантирует, что наблюдаемые различия отражают реальные эффекты различных методов сохранения, а не техническую вариабельность. Для каждого пациента изолированные PBMC делились на 7 пробирок: одна трубка использовалась для немедленной экстракции РНК, оценивалась концентрация, чистота и целостность. Оставшиеся шесть трубок были криоконсервированы при скорости охлаждения -1 °C/мин: три обработаны 1 мл 90% FBS + 10% DMSO, а три — 1 мл TRIzol, после чего хранили при -80 °C. Экстракция и оценка качества РНК проводились после 1, 3 и 6 месяцев замороженных условий.

Экстракция РНК
Образцы извлекали из хранилища при -80 °C и оттаивали при 4 °C до полного^{оттаивания 17} °C. Образцы, сохранившиеся с 90% FBS + 10% раствором криоконсервации DMSO или TRIzol, были промыты один раз PBS, центрифугированы при 200 × г в течение 5 минут при 4 °C, после чего супернатант отбрасывался для сохранения клеточной гранулы. Общая РНК была извлечена с помощью TRIzol. В частности, реагент TRIzol добавлялся в микроцентрифугу с обработанным образцом, смешивался инверсией и инкубировался при комнатной температуре в течение 5 минут для полного лизиса. Впоследствии добавляли 200 мкл хлороформа, тщательно перемешали встряхиванием и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут. После центрифугирования при 2400 × г в течение 15 минут при 4 °C верхняя водная фаза была аккуратно аспирирована и перенесена в новую трубку Эппендорфа. Затем добавляли изопропанол (0,5 мл), хорошо перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 5–10 минут. После центрифугирования при 2400 × г в течение 10 минут при 4 °C супернатант отбрасывался, оставляя РНК на дне трубки.

Осадок ресуспензировали в 75% этаноле (1 мл) с лёгким встряхиванием, затем центрифугировали при 1600 × г в течение 5 минут при 4 °C. Супернатант был выброшен, а РНК-гранулу оставили сушиться на воздухе при комнатной температуре в течение 5–10 минут. Наконец, образцы РНК растворялись в воде, обработанной DEPC с концентрацией 50 мкл, и инкубировали в водяной бане при температуре 55–60 °C в течение 5–10^{минут 18}. Обнаружение концентрации и чистоты РНК. Концентрация и чистота РНК измерялись методом ультрафиолетового поглощения с помощью многообразцового микрообъёмного УФ-ВИС-спектрофотометра (диапазон измерений: 2,5–3000 нг/мкл). Концентрация РНК определялась на основе значения поглощения на расстоянии 260 нм, а чистота РНК оценивалась с использованием соотношения A260/A280. Было запущено программное обеспечение для измерений; На главном интерфейсе было нажато слово «Нуклеиновая кислота». Платформа обнаружения дважды промывалась двойной дистиллированной водой, затем на неё пипетировали 1,5 мкл образца РНК. РНК-40 был выбран для типа образца, нажат «Измерение», а также зафиксированы значения концентрации и чистоты A260/280. Соотношение A260/A280 между 1,9 и 2,1 указывало на высокую чистоту РНК, тогда как значения ниже 1,8 указывали на загрязнение белками, а значения выше 2,2 — на потенциальную деградацию РНК или остаточный изотиоцианат¹⁹.

Обнаружение целостности РНК
Целостность РНК (RIN) оценивалась с помощью автоматизированного микрофлюидного электрофоретического биоанализатора и набора для обнаружения. RIN варьируется от 1 до 10, при этом 1 указывает на сильно деградированную РНК, а 10 — на целую РНК. Для анализа 1,2 мкл РНК помещали в ПЦР-трубку, термически денатурировали при 70 °C в течение 2 минут с помощью термического циклера и сразу же помещали на лёд. Впоследствии 1 мкл денатурированной РНК был добавлен в ямы обнаружения чипа для анализа²⁰. Программное обеспечение было запущено, выбрано «Анализы», а из выпадающего меню — «РНК». Программа «Eukaryote Total RNA Nano Series II.xsy» была выбрана в зависимости от используемого реагента. Был нажат «Start» для запуска обнаружения. Примерно через 10 минут пиковое число и высота лестницы проверялись на нормальность.

Статистические методы
Для всех данных были проведены тесты на нормальность. Обычно распределённые данные выражались как среднее ± стандартное отклонение (SD), а ненормально распределённые данные — как медиана (межквартильный диапазон, IQR). Сравнения между двумя группами анализировались с использованием парного t-теста для нормально распределенных данных и непараметрического теста связанных выборок для ненормально распределённых данных. Для сравнения между тремя и более группами использовался повторяемый анализ дисперсии для нормально распределённых данных, а непараметрический тест с родственными выборками — для ненормально распределенных данных. Все статистические анализы проводились с использованием SPSS 19.0 и GraphPad Prism 9.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.

Результаты

Влияние различных времен криосохранения и методов обработки на концентрацию РНК в образцах PBMC
Влияние разного времени криоконсервации: Свежие образцы PBMC от пациентов с продвинутыми НМРЛ служили контрольной группой. Образцы обрабатывались либо TRIzol, либо 90% FBS + 10% DMSO и хранили при -80 °C в течение 1, 3 и 6 месяцев; Общая РНК была извлечена для измерения концентрации РНК. Для образцов, обработанных TRIzol, концентрации РНК в четырёх группах были следующими: ...

Обсуждение

На качество РНК в биологических образцах влияет множество факторов, включая преданалитические переменные, условия транспорта, продолжительность обработки при окружающей температуре, некроз тканей, температуру и продукты заморажения, размер и количество аликвотов, а также продолжительность хранения существенно влияют на качество^{РНК 21}. Для идентичных образцов вариации времени криоконсервации и методов обработки могут существенно повлиять на качество РНК. Предыдущие...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Биоанализатор Agilent 2100	Agilent	G2939B	Обнаружение целостности РНК, оценка качества РНК с помощью генерации числа целостности РНК (RIN)
Нанокит Agilent RNA 6000	Agilent	5067-1511	В сотрудничестве с биоанализатором Agilent 2100, который предоставляет специализированные реагенты и чипы для обеспечения целостности РНК
Центрифуга	Eppendorf	5424R	Для извлечения РНК
Центрифуга	Eppendorf	5810R	Для извлечения PBMC
Хлороформ	Китайская национальная фармацевтическая группа	20191031	Для экстракции РНК методом Тризола используется для отделения водной фазы, содержащей РНК, от органической фазы, содержащей примеси
Диметилсульфоксид	Пекин Динго Чаншэн	DH105-2	В качестве криоконсервационного решения для PBMC, позволяющего долгосрочное хранение образцов при -80 и градусах; C
Трубка	Корнинг	MCT-150-C	Для хранения образцов, смешивания реагентов, центрифугирования и других экспериментальных операций
Этанол	Шаньдун Лиеркан	25071901A	Экстракция IIn РНК методом Тризола, используемая для промывания РНК-осадков с целью удаления остаточных веществ
Сыворотка плода крупного рогатого скота	Xpbiomed	C04001-500	В качестве криоконсервационного решения для PBMC, обеспечивающего долгосрочное хранение
Решение для разделения Фиколла	Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology CO., LTD	CC0161	Для выделения и очистки PBMC с помощью центрифугации градиента плотности
Термический циклер GeneTouch(Plus)	Bioer	TC-EA-48DA	Для термической денатурации РНК (70 & °; C в течение 2 минут), после чего следует обнаружение с помощью биоанализатора
Изопропанол	Китайская национальная фармацевтическая группа	20210929	В экстракции РНК методом Тризола, используемой для осадки РНК
Спектрофотометр Nanodrop 8000	GeneCompany	ND-8000	Для концентрации РНК (на основе поглощения при 260 нм) и чистоты (по соотношению A260/A280) с использованием метода ультрафиолетового поглощения
ПЦР-лампы	Корнинг	PCR-02-C	Для термической денатурации РНК (70 & °; C в течение 2 минут), после чего следует обнаружение с помощью биоанализатора
Фосфатно-буферный физиологический раствор	Система Процелла	PB180327	Для прямого лизиса и сохранения PBMC, или последующей полной РНК
Тройной изоляционный реагент	Adsin	ads60154	Для прямого лизиса и сохранения PBMC, или последующей полной РНК