Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Исследовательская статья
Это исследование выявило повышение уровня HMGA1 и снижение экспрессии HAND1 при раке гортани, что указывает на обратную связь и значимую связь с метастазами и клинической стадией, что свидетельствует о том, что оба способствуют прогрессированию опухоли.
В данном исследовании изучались профили экспрессии генов HMGA1 и HAND1 при плоскоклеточной карциноме гортани (LSCC), а также в соседних нормальных слизистых тканях гортани с помощью иммуногистохимии и RT-ПЦР-методов. Целью было изучить их возможную роль в инициации, развитии, вторжении и метастазировании LSCC. И HMGA1, и HAND1 были обнаружены в раковых и прилегающих нормальных тканях. Тем не менее, HMGA1 показал значительно повышенную экспрессию в тканях LSCC, тогда как HAND1 показал значительно сниженный уровень экспрессии. Повышенная экспрессия HMGA1 была положительно связана с метастазами лимфатических узлов (100,0% против 50,0%) и поздней клинической стадией (91,7% против 44,4%), но не связана с гистологической степенью опухоли, клиническим типом или возрастом пациента. В отличие от этого, снижение экспрессии белка HAND1 было связано с метастазами лимфатических узлов, клинической стадии и патологической степени, что указывает на роль в прогрессировании опухоли и метастазах. Кроме того, была отмечена линейная отрицательная корреляция между экспрессиями HMGA1 и HAND1, что указывает на потенциальное регуляторное взаимодействие, при котором HMGA1 может подавлять экспрессию HAND1. Эти результаты указывают на то, что HMGA1 и HAND1 выполняют взаимодополняющие функции в патогенезе LSCC, при этом HMGA1 потенциально способствует развитию опухоли, а HAND1 служит супрессором. Взаимодействие между этими двумя генами может предложить новые взгляды на молекулярные механизмы, управляющие прогрессированием и метастазированием LSCC.
Рак гортани является второй по распространённости первичной злокачественной опухолью головы и шеи после рака носоглотки, составляя 26%–30% всех опухолей головы и шеи вмире 1. Более 90% случаев рака гортани классифицируются как плоскоклеточный карцинома гортани (LSCC)2. Основными методами лечения рака гортани являются хирургия и лучевая терапия. Местные рецидиви и метастазирование лимфатических узлов являются основными причинами смерти у пациентов с раком гортани. Поэтому эффективное управление рецидивами и метастазами остаётся серьёзной клинической задачей. С развитием молекулярной биологии были выявлены различные гены с аномальной экспрессией при раке гортани. Однако механизмы, лежащие в основе опухолевой инвазии и метастазирования при раке гортани, остаются неясными и требующими дальнейших исследований.
Белки высокой подвижности группы A (HMGA) — это белки, не связывающие хроматин, расположенные в ядре клетки. HMGA1 связывается с ДНК и сопутствующими белками, вызывая структурные изменения хроматина, регулирующие транскрипциюгенов 3. В качестве транскрипционного регулятора, ассоциированного с хроматином, HMGA1 модулирует экспрессию нескольких генов, связанных с опухолями, участвующих в пролиферации и метастазах. Предыдущие исследования показали, что HMGA1 гиперэкспрессируется при широком спектре видов рака человека, включая щитовидную, колоректальную, поджелудочную железу, а также злокачественные опухоли головыи шеи 4,5,6,7, а также другие эпителиальные и солидные опухоли, описанные в литературе. HMGA1 регулирует опухологенез, модулируя экспрессию нескольких следующих целевых генов, участвующих в пролиферации иметастазах 8.
Гены, экспрессированные сердечными и нейронными гребнями (HAND), относятся к семейству bHLH (базовая спираль–петля–спираль), включая HAND1 и HAND2. HAND1, как транскрипционный фактор, играет роль в дифференциации трофобластов и развитиисердца 9. Однако механизм экспрессии HAND1 в внеэмбриональном клеточном слое остаётся неясным. Подтверждено, что HMGA1 напрямую связывается с промотором HAND1, подавляя активность HAND1 как in vivo, так и in vitro10. HAND1, как репрессорный белок, участвует в регуляции дифференцировки клеток и формирования рака. Исследования показали, что экспрессия HAND1 заглушается и гиперметилируется при раке желудкау человека 11, рака поджелудочнойжелезы 12, рака яичников13 и рака щитовиднойжелезы 14. Однако, насколько нам известно, ограниченные исследования изучали экспрессию HAND1 в тканях рака гортани.
В настоящем исследовании для обнаружения экспрессии белков и мРНК HMGA1 и HAND1 и мРНК в LSCC и соседних нормальных слизистых тканях использовались иммуногистохимия (двухступенчатый метод обнаружения) и обратная транскрипционная полимеразная цепная реакция (RT-PCR). Иммуногистохимия позволяет визуализировать локализацию белков в архитектуре тканей, тогда как RT-PCR позволяет чувствительно обнаруживать экспрессию генов на транскрипционном уровне, предоставляя дополнительные представления о паттернах экспрессии белков и мРНК. В сравнении с количественным ПЦР (qPCR), обеспечивающим более высокую чувствительность и точную количественную оценку, вестерн-блоттингом, позволяющим валидацию на уровне белка, но без пространственного контекста, и секвенированием РНК (RNA-seq), обеспечивающим комплексное транскриптомическое профилирование, но требующим продвинутого вычислительного анализа, совместное использование иммуногистохимии и RT-PCR представляет собой экономически эффективную и клинически применимую стратегию для изучения биомаркеров. Целью исследования было изучение роли и корреляции этих двух факторов в возникновении, развитии, прогрессировании и метастазах LSCC. Кроме того, оценка экспрессии HMGA1 и HAND1 может предоставлять биомаркеры для диагностики и прогностической оценки при раке гортани, что потенциально улучшает стратификацию риска и способствует принятию клинических решений.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Это исследование было рассмотрено и одобрено Комитетом по этике исследований Народной больницы Шицзячжуан (Одобрение No YKLS 2026 No 041; 27 марта 2026 года). Исследование проводилось в соответствии с Правилами об этическом обзоре биомедицинских исследований с участием людей, Правилами этического обзора наук о жизни и медицинских исследований с участием людей, Хельсинкской декларацией и Международными этическими рекомендациями по исследованиям, связанным со здоровьем с участием людей. Образцы человеческих тканей были получены из архивированных хирургических образцов в соответствии с этическими требованиями института, обеспечивая анонимизацию и конфиденциальность данных пациентов. От участников было получено письменное информированное согласие или этический комитет предоставил отказ от согласия на использование анонимных архивных образцов, если это применимо.
Экспериментальные материалы
Источник образцов
Всего с февраля 2011 по август 2012 года в отделении отоларингологии и хирургической хирургии ЛСКК были получены 42 случая тканей LSCC и смежных нормальных слизистой слизистой гортани. Из них 25 случаев смежной нормальной слизистой (взятых из участка > 1,0 см от края рака) патологически подтвердились как воспалительная или нормальная слизистая. 42 образца LSCC были патологически подтверждены как плоскоклеточный карцинома. Все ткани хранились при -80 °C. 42 пациента были мужчинами, женщин не было. Среди случаев LSCC 15 были хорошо дифференцированы, 18 — умеренно дифференцированы, а 9 — слабо дифференцированы. Восемнадцать случаев имели метастазы в лимфатических узлах, а в 24 — нет. Клиническая стадия была основана на системе классификации и стадирования TNM (UICC, 2002), с 20 случаями на стадии I и II, и 22 случаями на стадии III и IV. Было зарегистрировано 30 случаев супраглоттического типа, 11 случаев глоттического типа и 1 случай субглоттического типа. Возрастной диапазон пациентов составлял 40–75 лет, медианный возраст — 60 лет. Ни один из пациентов не проходил лучевую или химиотерапию до операции, и клинические данные были полными.
Экспериментальные методы и шаги
Процедура окрашивания HE
Подготовка стекла и окрашивание гематоксилином–эозином
Стеклянные стекла для иммуногистохимии сначала замачивались в концентрированной кислоте в течение 24 часов, затем тщательно промывались под проточной водопроводной водой не менее 10 минут для удаления остаточной кислоты, а затем погружение в дистиллированную воду на 30 минут дважды с мягким перемешиванием для полного промывания. После замачивания в 95% этаноле в течение 2 часов затворы сушили в духовке при температуре 60 °C, затем погружали в смесь APES: ацетон (1:49, V/V) в течение 1 минуты с мягким встряхиванием для равномерного покрытия, после чего промывали чистым ацетоном. Затем их сушили на воздухе при комнатной температуре (20–25 °C) для обеспечения правильной адгезии тканей во время последующих процедур окрашивания.
Срезы ткани, вложенные в парафин, последовательно погружались в ксилол I и ксилол II по 10 минут для удаления парафина, затем регидратировали с помощью градированного этанола (100%, 95%, 80%) по 5–10 минут каждая, после чего промывались в дистиллированной воде в течение 2 минут. Затем срезы подвергались окрашиванию гематоксилином-эозином (HE) следующим образом: окрашивание гематоксилином в течение 4 минут, промывание под проточной водопроводной водой в течение 3 минут с непрерывным потоком для удаления лишних пятен, дифференцировка с использованием 1% соляной кислоты в этаноле в течение 30 секунд, трижды промывка водопроводной водой для завершения дифференцировки и эозиновое окрашивание в течение 10 секунд. Рутинное постепенное обезвоживание проводилось последовательно с использованием 70% этанола, 80% этанола, 95% этанола, безводного этанола I и безводного этанола II по 5 минут каждая. После высыхания затвор монтировался с использованием нейтрального бальзама.
Процедура иммуногистохимии
Парафиновые срезы толщиной 4 мкм были нарезаны, уложены ровно на стекли с покрытием APES и помещены в печь при температуре 67 °C на ночь, после чего депарафинизировали ксилолом I и II по 10 минут каждая. Постепенное обезвоживание проводилось с использованием 100%, 90% и 70% спирта по 5 минут каждая, после чего промывали водопроводной и дистиллированной водой в течение 3 минут. Для блокировки активности эндогенной пероксидазы препараты инкубировали свежеприготовленным раствором перекиси метанола и водорода 3%, что обеспечивало полное покрытие тканевого участка при комнатной температуре (20–25 °C) в течение 20 минут, после чего следовали три промывания дистиллированной водой в течение 5 минут с интервалом 0,01 M PBS.
Извлечение антигена проводилось путём погружения препаратов в буфер цитратного вещества (pH 6,0) и нагрева в скороварке при ~ 95–100 °C в течение 8 минут для HMGA1 и 10 минут для HAND1 с надёжно закрытыми крышками для поддержания стабильного давления. Затем секции охлаждались при комнатной температуре (20–25 °C) и мылись три раза с 0,01 м PBS по 3 минуты каждый при мягком перемешивании. Первичные антитела против HMGA1 и HAND1 разбавлялись в разбавляющем веществе (1:150 и 1:100 соответственно) и аккуратно смешивались с помощью пипетирования, прежде чем равномерно нанести для полного покрытия каждого среза ткани. Горки инкубировали ночью при 4 °C в увлажнённой камере. После ночной инкубации затворы извлекали из увлажнённой камеры и давали балансировать до комнатной температуры в течение 10 минут. Стекли были промыты три раза с температурой 0,01 M PBS (5 минут на промывку) при мягком перемешивании для удаления несвязанных антител. Избыточная жидкость была удалена, а вторичные антитела (полимерный анти-кролик/мышь с маркировкой HRP) были добавлены для полного покрытия поверхностей тканевых срезов. Дальнейшая инкубация проводилась при 37 °C в течение 35 минут.
Раствор субстрата DAB наносился каплями, чтобы покрыть ткань, а развитие цвета контролировалось под микроскопом в течение 1–3 минут, пока не появилось коричневое пятно, которое сразу же прекратилось промыванием дистиллированной водой после достижения оптимальной интенсивности окрашивания. Проводились повторное окрашивание гематоксилином, дифференцировка солянокислотного спирта и аммиачный раствор для обратного синего цвета. Затем последовала рутинная сортировка спиртового обезвоживания, прозрачность ксилола и монтаж с нейтральным бальзамом для наблюдения под микроскопом. PBS использовался как контрольный блок вместо первичного антитела. Кроме того, ранее подтверждённые HMGA1-положительные срезы плоскостной карциномы головы и шеи и HAND1-положительные срезы плацентарной ткани использовались в качестве положительных контролей для обеспечения качества и консистенции окрашивания.
Определение результата
Хромоген, используемый в этом эксперименте, — это система DAB-H2O2. После повторного окрашивания гематоксилином положительное окрашивание HMGA1 и HAND1 в основном наблюдается в ядре клетки, с некоторым цитоплазматическим окрашиванием. Для оценки был выявлен регион с наибольшей плотностью положительно окрашенных клеток при низком увеличении (×40). При увеличении ×100 были выбраны пять полей с наибольшей положительной плотностью клеток, и в каждом поле было насчитано 100 ячеек. Для каждого слайда используется средний процент положительных ячеек из пяти полей. Критерии оценки были следующими: отсутствие окрашенных клеток (-), положительные клетки < 25% (+), положительные клетки 25%–50% (++), положительные клетки > 50% (+++), основанные на полуколичественном методе оценки, широко используемом в иммуногистохимических анализах. Оценка проводилась независимо двумя квалифицированными патологами в двойной слепойформе 15,16,17. Если их мнения расходятся, им следует обсудить и прийти квыводу 18.
Метод RT-PCR
Праймеры
Праймеры разрабатывались с использованием программного обеспечения для проектирования праймеров на основе последовательностей целевых генов, с учетом специфичности праймера, совместимости с температурой плавления и ожидаемым размером продукта. Подробные последовательности праймеров, размеры продуктов и температуры отжига приведены в таблице 1. Праймеры синтезировались до концентрации 2 OD, разделялись на две трубки и разбавлялись до 10 пмоль/мкл водой, обработанной DEPC, для хранения при -20 °C. Температура отжига рассчитывалась по формуле: Tm= 2(A + T) + 4(G + C)
РНазная обработка экспериментальных материалов и оборудования:
Пластиковые изделия (например, наконечники пипеток, трубки EP): Пластиковые изделия помещались в стерилизованную бутылку с реактивами с широким горлом, подготовленная вода, обработанная DEPC, добавлялась до полного погружения, а материалы инкубировали ночью в вытяжке с дымом при комнатной температуре (20–25 °C). Затем их стерилизовали под давлением в течение 120 минут и сушили при 65 °C.
Стеклянные изделия: Стеклянную посуду замачили на ночь в кислоте, тщательно промыли, высушили, завернули в алюминиевую фольгу и запекали в духовке при температуре 200 °C 6 часов, после чего хранили в чистом месте для дальнейшего использования.
Металлические изделия (например, ножницы, пинцеты): металлические изделия очищались, запекали в духовке при температуре 200 °C 6 часов и хранили в чистом месте для будущего использования.
Подготовка растворов
0,1% (v/v) раствор DEPC: 1 мл DEPC был добавлен в дистиллированную воду объёмом 1000 мл для достижения конечной концентрации 0,1% (v/v), хорошо взбавлен, инкубирован при 4 °C ночью, стерилизован автоклавом и хранён при 4 °C.
Раствор этанола 75% (v/v): 75 мл абсолютного этанола смешали с водой, обработанной DEPC, объёмом 25 мл для достижения конечной концентрации 75% (v/v), и хранили при 4 °C.
Полная экстракция РНК из ткани
После экстракции РНК целостность РНК оценивалась перед обратной транскрипцией и дальнейшим анализом. 80 мг ткани взвешивались с помощью электронных весов, нарезали на мелкие кусочки и помещали в предварительно обработанный стеклянный гомогенизатор. При температуре 4 °C был добавлен 1 мл предварительно охлаждённого реагента для экстракции РНК, и образец гомогенизировали на льду с помощью многократного измельчения до получения однородного лисата без видимых фрагментов ткани, что предотвращало образование пузырьков. Гомогенизированная смесь была перемещена в 1,5 мл РНаз-бессодержащую ЭП-трубку и инкубировала на льду в течение 5 минут. В каждую трубку добавляли 400 мкл хлороформа, интенсивно вихрь в течение 10–15 секунд для полного смешивания фазы, после чего следовала инкубация на льду в течение 5 минут. Трубки были центрифугированы при 4 °C, 12 000 x g в течение 15 минут. После центрифугирования верхняя водная фаза аккуратно аспирировала с помощью пипетки без РНаз, не нарушая межфазный слой в новую трубку. Добавлялся равный объём изопропанола, смешивался путём аккуратного переворачивания трубки 8-10 раз, пока слои не исчезли, и инкубировался при -20 °C не менее 10 минут. Смесь была центрифугирована при 4 °C, 12 000 x g в течение 10 минут. Поверхностный слой был отброшен, добавлено 400 мкл 75% ледяного этанола для суспензии РНК-гранулы. Смесь снова центрифугировала при 4 °C, 12 000 x g . в течение 5 минут. Поверхностный слой был отброшен, а РНК-гранулы слегка высохли. РНК-гранулу растворяли в воде без РНазы и хранили при -80 °C для дальнейшего использования.
Обнаружение целостности РНК
Для обнаружения целостности РНК 5 мкл образца РНК смешивалось с 5 мкл буфера с бромофенол-синим буфером, а электрофорез проводился на 2% агарозном геле. Целостность РНК считалась приемлемой, когда были видны прозрачные полосы 28S, 18S и 5S без явного размазания.
Обратная транскрипция (RT) для синтеза cDNA
6 мкл РНК предварительно нагревалось при 70 °C в течение 10 минут, затем последовательно добавлялись 25 мМ MgCl2 (4,0 мкл), dNTP (2,0 мкл), AMV (0,7 мкл), 10× AMV буфер (2,0 мкл), олиго(dT) (1,0 мкл), RNasin (0,5 мкл) и деионизированная вода последовательно добавлялись на льд для достижения итогового реакционного объёма 20 мкл, после чего последовало аккуратное смешивание и кратковременная центрифугирование. Условия реакции были 25 °C в течение 1 минуты, 42 °C в течение 60 минут, 98 °C в течение 5 минут, после чего хранили при 4 °C бесконечно. Когда реакция достигала 4 °C, продукт извлекали из ПЦР-аппарата, использовали как шаблон для кДНК для следующей реакции ПЦР и хранили при -20 °C для последующего использования.
Усиление ПЦР
Для каждой ПЦР-реакции смесь содержала шаблон cDNA (1 мкл), прямой праймер, специфичный для HMGA1, HAND1 или GAPDH (1 мкл), обратный праймер, специфичный для целевого гена или GAPDH (1 мкл), мастер-смесь ПЦР (10 мкл) и обработанную DEPC-водой (7 мкл), общий объём 20 мкл. Для каждого мишенного гена (HMGA1, HAND1) и внутренний контрольный ген (GAPDH), при этом каждая реакция содержит соответствующую геноспецифическую пару прямого и обратного праймера.
Общий объём реакции составлял 20 мкл. После аккуратного смешивания компонентов реакции и краткого центрифугирования в течение 5–10 секунд на низкой скорости лампа была помещена в предварительно нагретую ПЦР-машину и усилена в соответствии с условиями реакции в таблице 2.
Подтверждение и анализ продуктов с помощью ПЦР
Приготовление геля
2 г агарозы взвешивали и помещали в треугольную колбу. Были добавлены 2 мл буфера электрофореза 50× TAE и 100 мл дистиллированной воды (готовьте 2% агарозный гель), затем нагревались в микроволновой печи с периодическим закручиванием (интервалы 15–20 с), пока агароза полностью не растворилась. После охлаждения примерно до 55 °C добавляли 10 мкл раствора EB и тщательно перемешивали. Затем гель заливали в чистый гелевый лоток при комнатной температуре (20–25 °C), промывали дистиллированной водой, и вставляли гребень для создания пробных колодц. Толщина геля составляла 0,4 см. Лоток ставили на ровную поверхность при комнатной температуре (20–25 °C) на 30 минут, пока гель полностью не затвердеет. Гребень был аккуратно снят.
Загрузка образцов
4 мкл каждого образца ДНК добавлялись в колодцы геля, а маркер ДНК — в левую яму.
Электрофорез
Загруженный гелевый лоток помещался в электрофорезный резервуар, заполненный буфером электрофореза TAE, обеспечивая сохранение уровня буфера примерно на 1 мм выше поверхности геля. Один конец колодцев находился у катода (чтобы ДНК могла мигрировать к аноду). Система электрофореза была подключена к источнику питания и работала при напряжении 120 В и 60 мА примерно 45 минут, пока буфер нагрузки не переместился за пределы средней линии геля, после чего питание отключалось.
Наблюдение и визуализация результатов
После электрофореза гель аккуратно удаляли, а результаты наблюдались под ультрафиолетовым транслиминатором и сравнивались с ДНК-маркером, чтобы определить, появилась ли молекулярная масса амплифицированных фрагментов на ожидаемых позициях. Гелевая система визуализации использовалась для захвата изображений и сохранения результатов на компьютере.
Настройка управления
Вместо кДНК использовалась дистиллированная вода в качестве отрицательного контроля.
Полуколичественный анализ
Результаты электрофореза агарозного геля были проанализированы и зафиксированы с помощью гелевой системы визуализации. Для анализа яркости полос использовалось программное обеспечение для анализа изображений. Были измерены абсолютные интегрированные значения OD зоны амплификации целевых генов и соответствующей внутренней контрольной амплификационной зоны. Результаты были выражены в виде отношения абсолютного интегрированного значения OD целевой полосы к абсолютному интегрированному OD значения соответствующего внутреннего управляющего диапазона.
То есть относительная экспрессия = значение OD целевых генов / значение внутреннего контроля гена OD.
Статистический анализ
Все данные были организованы в Excel и проанализированы с помощью статистического программного обеспечения. Непрерывные переменные были выражены в виде среднего ± стандартного отклонения (SD) и сравнивались между двумя группами с помощью t-теста независимых выборок. Номинальные категориальные переменные, включая иммуногистохимические положительные показатели экспрессии, анализировались с помощью теста χ2 . Порядковые категориальные переменные, включая патологическую степень и клиническую стадию, анализировались с помощью теста ранговой суммы (тест Mann-Whitney U для двухгрупповых сравнений, где это применимо). Корреляция между выражением HMGA1 и HAND1 была оценена с помощью линейного корреляционного анализа. Все испытания были двусторонними; P < 0,05 считался статистически значимым, а P. < 0,01 — высокозначительным.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты иммуногистохимического обнаружения
Показаны репрезентативные изображения окрашивания гематоксилин–эозином (HE), иллюстрирующие гистологическую морфологию соседней нормальной слизистой гортани и LSCC с разной степенью дифференцировки (ну, умеренной и плохой). В частности, на рисунке 1A показана соседняя нормальная слизистая гортань, на рисунке 1B показана хорошо дифференциро...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Рак гортани, одна из самых распространённых опухолей головы и шеи, в последние годы показал рост заболеваемости, вероятно, связанный с факторами окружающей среды и образом жизни. Как и другие злокачественные опухоли, их рецидив и метастазирование остаются основными причинами смерти. С развитием молекулярной биологии было выявлено множество факторов, связанных с развитием рака гортани, однако механизмы возникновения и метастазирования до сих пор не полностью изучены. HMGA1, как транскрипц...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Ни одного.
Авторы хотели бы выразить признательность своему учреждению и всем лицам, внесшим вклад в это исследование.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Автоматическая машина для вложения тканей | Sakura Finetek, Токио, Япония | Tissue-Tek TEC 5 | Вложение парафина |
| Микротом | Leica Microsystems, Вецлар, Германия | RM2135 | Секционирование (4 и мю; m) |
| Слайд-сушилка | Xiaogan Hongye Medical Instrument Co., Ltd., Китай | CS-VI | Сушка на слайдах |
| Нагревательный инкубатор | Shanghai Yangguang Experimental Instrument Co., Ltd., Китай | 303-4A | Инкубация с контролируемой температурой |
| Оптический микроскоп | Olympus Corporation, Токио, Япония | BX41 | Гистологическое наблюдение |
| Система захвата изображений | QImaging, Канада | QCapture Pro 7 | Микроскопическая визуализация |
| Чистая скамейка | Пекинский завод полупроводникового оборудования, Китай | SW-CJ-1FD | Стерильное рабочее пространство |
| Рефрижераторная центрифуга | Пекинский завод по ремонту медицинских инструментов, Китай | LXJ-64-01 | Разделение РНК |
| Настольная центрифуга | Shanghai Peiqing Technology Co., Ltd., Китай | PQ-1600A | Обработка РНК/ДНК |
| Магнитная мешалка | Фабрика медицинских инструментов Цзянсу Цзиньтань, Китай | HJ-3 | Подготовка раствора |
| Мини-миксер | Шанхай Пэн s Industrial Co., Ltd., Китай | H-1 | Микширование сэмплов |
| Электронный баланс | METTLER Toledo, Швейцария | PB3002-S | Взвешивание образца |
| ПЦР-усилитель | Eppendorf AG, Германия | Мастерсайклер 5333 | Усиление ПЦР |
| Электрофорезный блок питания | Пекинский завод приборов Люи, Китай | DYY-6C | Управление напряжением |
| Электрофорезный резервуар | Пекинский завод приборов Люи, Китай | DYCZ-24DN | Гель-электрофорез |
| Микроволновая печь | Шанхайский институт медицинских прикладных исследований, Китай | WD800SL23 | Приготовление агарозы |
| УФ-транслиминатор | Пекинский завод приборов Люи, Китай | WD-9403B | Визуализация ДНК |
| Гелевая система визуализации | Anlai Co., Ltd., Китай | AlphaImager HP | Документация Gel |
| Холодильник (4 градуса; C) | Haier Biomedical, Китай | BC-165D | Хранение образцов |
| Морозильник с ультранизкой температурой | Haier Biomedical, Китай | DW-86L388 | Хранение (-80 и градусов; C) |
| Ледяная коробка | Shanghai Fuzhi Technology Co., Ltd., Китай | FZ-IB-20L | Транспорт образцов |
| Криогенные сумки для хранения | Shanghai Yili Technology Co., Ltd., Китай | YL-ULT-50 | Сохранение образца |
| Исследовательские пипетки | Eppendorf AG, Германия | Research Plus | Обращение с жидкостями |
| Реагент для экстракции РНК (TRIzol) | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific), США | 15596026 | Экстракция РНК |
| Набор обратной транскрипции | Takara Bio Inc., Япония | RR037A | Синтез кДНК |
| PCR Master Mix | Takara Bio Inc., Япония | RR820A | Усиление ПЦР |
| dNTP Mix | Takara Bio Inc., Япония | 4030 (типичный) | Компонент ПЦР |
| Ингибитор РНазы (РНазин) | Promega, США | N2111 | Защита РНК |
| Oligo(dT) Primer | Takara Bio Inc., Япония | 3806 (типичный) | Праймер синтеза кДНК |
| Агарозе | Sigma-Aldrich, США | A9539 | Приготовление геля |
| TAE Buffer (50 и больше раз;) | Sigma-Aldrich, США | TAE50X-1L (типичный) | Буфер электрофореза |
| ДНК-маркер (лестница) | Takara Bio Inc., Япония | DL2000 (3421A) | Отсылка по размеру |
| Этидий бромид (EtBr) | Bio-Rad, США | 1610433 | Визуализация ДНК |
| Буфер PBS | Gibco (Thermo Fisher Scientific), США | 10010023 | Промывочный буфер |
| Вода, обработанная DEPC | Invitrogen, США | AM9916 | Защита РНК |
| Хлороформ | Sigma-Aldrich, США | C2432 | Экстракция РНК |
| Изопропанол | Merck, Германия | 109634 | Осадки РНК |
| Этанол (абсолют) | Merck, Германия | 100983 | Обезвоживание |
| Метанол | Merck, Германия | 106009 | Блокировка пероксидазой |
| Перекись водорода (H2O2) | Sigma-Aldrich, США | H1009 | Эндогенная блокировка пероксидазы |
| Ксилол | Sigma-Aldrich, США | 534056 | Депарафинизация |
| Буфер для извлечения цитратного антигена | Abcam, Великобритания | ab93678 | Извлечение антигена |
| Разбавление антител | Дако, Дания | S3022 | Разбавление антител |
| Первичные антитела к HMGA1 | Abcam, Великобритания | ab129153 | Разбавление 1:150 |
| Первичный антител HAND1 | Abcam, Великобритания | AB200040 | Разбавление 1:100 |
| Вторичные антитела (сопряжённые с HRP) | Дако, Дания | K5007 | Система обнаружения |
| Комплект для подкладки DAB | Дако, Дания | K3468 | Хромогенное обнаружение |
| Окраска с гематоксилином | Sigma-Aldrich, США | H9627 | Ядерное окрашивание |
| Эозин Стейн | Sigma-Aldrich, США | E4009 | Цитоплазматическое окрашивание |
| Нейтральный монтажный материал для бальзама | Sinopharm Chemical Reagent Co., Китай | 10004160 | Крепление затвора |
| Праймеры HMGA1 | Кастомный синтез (например, IDT/Sangon) | Н/Д | Амплификация генов |
| Праймеры HAND1 | Кастомный синтез (например, IDT/Sangon) | Н/Д | Амплификация генов |
| Праймеры GAPDH (внутреннее управление) | Индивидуальный синтез | Н/Д | Ген ведения хозяйства |
| АПЕС (аминопропилтриэтоксисилан) | Sigma-Aldrich | Н/Д | Покрытие затвора |
| Микроцентрифугальные трубки без РНазы | Eppendorf | Н/Д | Обработка РНК |
| Насадки для пипетт без РНазы | Eppendorf | Н/Д | Обращение с жидкостями |
| Лоток и гребень для отливки геля агарозы | Дженерик | Н/Д | Приготовление геля |
| Программное обеспечение для проектирования грунтов | Integrated DNA Technologies, США | Инструмент PrimerQuest | Конструкция грунта |
| Программное обеспечение для анализа изображений | Media Cybernetics, США | Image-Pro Plus 6.0 | Количественная оценка диапазонов |
| Программное обеспечение для статистического анализа | IBM Corp., США | SPSS Версия 13.0 | Статистический анализ |