Методическая статья

Картирование иммунитета младенцев с минимальными затратами: интегративное одноклеточное и мультиомическое профилирование

DOI:

10.3791/70279

⸱

3 апреля 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Yale University School of Medicine, 2Department of Biomedical Informatics and Data Science, Yale University School of Medicine, 3Department of Biostatistics, Yale University School of Public Health, 4Center for Systems and Engineering Immunology, Yale University, 5Department of Immunobiology, Yale University School of Medicine, 6Department of Obstetrics, Gynecology, & Reproductive Sciences, Yale University School of Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает сбор и сохранение образцов крови у неонатальных и педиатрических пациентов, а также применение scRNA-seq, протеомики и спектральной цитометрии для характеристики иммунных клеток из этих образцов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

При рождении иммунная система новорождённых внезапно сталкивается с радикально иной средой, богатой микробными и экологическими стимулами. Всё больше данных указывает на то, что иммунитет в раннем возрасте не просто незрел, а уникально адаптирован для удовлетворения специфических требований этого периода развития. В этот период иммунная система становится очень динамичной, быстро меняясь для адаптации к меняющемуся внешнему ландшафту. Понимание этого сложного и меняющегося иммунного ландшафта требует прямого изучения у новорождённых. Однако основным ограничением таких исследований является низкий общий объём крови у новорождённых (~100 мл/кг), что ограничивает количество данных, которые можно безопасно собрать для исследований, особенно у крайне низкой массы при рождении (ELBW) или крайне недоношенных младенцев. В нашей недавней работе мы решаем это ограничение, демонстрируя, как можно проводить высокомерное иммунное профилирование с использованием крошечных объёмов неонатальной крови. Мы внедряем набор оптимизированных протоколов для продольного отбора проб в ранние годы жизни и применяем передовые методы, включая потоковую цитометрию, протеомику и секвенирование одноклеточной РНК, чтобы максимизировать информацию, полученную с минимальных входных данных. Вместе эти методы позволяют всесторонне рассмотреть транскриптомические и протеомные сигнатуры циркулирующих иммунных клеток у новорождённых, предоставляя новые знания о уникальной траектории иммунитета в раннем возрасте.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол оптимизирован для образцов крови 100-250 мкл, обработанных в течение 12 часов после сбора, как криоконсервированных, так и немедленного использования. При рождении иммунная система новорождённых оказывается в радикально иной среде, обогащённой микробными и экологическими стимулами, которые ранее отсутствовали в защищённой внутриматочнойсреде 1,2. Этот сдвиг требует, чтобы иммунная система адаптировала и реагировала на широкий спектр новых антигенов — процесс, необходимый для выживания, но также создающий серьёзные трудности 1,2. Всё больше данных свидетельствуют о том, что иммунитет в раннем возрасте — это не просто незрелый или миниатюрный вариант взрослой иммунной системы. Вместо этого он уникально адаптирован для удовлетворения конкретных потребностей этого критического периодаразвития 3,4. В течение этого неонатального окна клеточные компоненты иммунной системы, включая различные типы Т-клеток, В-клеток и миелоидных клеток, созревают и развивают уникальные характеристики и функции, характерные для ранних лет 5,6,7,8. Несмотря на свою важность, неонатальный иммунитет по-прежнему трудно изучать напрямую из-за этических и практических ограничений. Основным ограничением является небольшой объём крови у новорождённых, средний ~100 мл/кг 9,10. Эта проблема становится ещё более выраженной при сборе крови у крайне недоношенных младенцев (родившихся до 30 недель беременности) и младенцев с ELBW, которые могут весить всего 400 г при циркулирующей крови всего 40 мл. Это ограничивает, сколько можно безопасно собрать кровь, подчёркивая необходимость подходов, максимизирующих объём данных из минимального количества образцов. Для решения этой задачи наша работа демонстрирует оптимизированные протоколы для высокомерного иммунного профилирования с использованием миниатюрных объёмов крови (100-250 мкл), например, полученных у младенцев с ELBW.

Недавние достижения в сборе и обработке крови позволили изучать иммунные ответы в популяциях, где сбор образцов традиционно затруднен. Микроигольные устройства, такие как системы Tasso и системы Touch-Activated Phlebotomy, изначально были разработаны для удобного домашнего сбора крови у взрослых. Позже их адаптировали для использования у младенцев, что позволяет первичным опекунам и клиническим командам собирать образцы с минимальным дискомфортом. Кроме того, их можно использовать дома без стресса от повторных клинических визитов, что способствует соблюдению требований и доступности. С устройством следует использовать микропробирку с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) и отправлять в лабораторию ночью с соблюдением соответствующих протоколов биологической опасности. На следующее утро, когда образцы прибывают, их следует обработать с помощью лиза эритроцитов (эритроцитов) для захвата циркулирующих иммунныхклеток 6. Стоит отметить, что ЭДТА-трубки обеспечивают изоляцию живых клеток, но важны временные соображения. Для функциональных тестов с стимуляцией образцы должны быть обработаны менее чем за 4 часа и, желательно, менее чем за 2 часа после сбора. Для нефункциональных фенотипических анализов, представленных ниже, образцы должны быть обработаны в течение 12 часов, чтобы обеспечить ночную отправку и обеспечить восстановление, поскольку жизнеспособность клеток со временемснижается 12. По сравнению с традиционным разделением плотностно-градиентного разделения с Ficoll, лизис быстрее, менее трудоёмкий и даёт более высокоевосстановление 13. Однако изоляция мононуклеарных клеток периферической крови путём лизиса может оставить загрязняющие гранулоциты, снижая чистоту, но может быть полезно для исследований, изучающих эти типыклеток 14. Эти компромиссы подчёркивают, как методологические адаптации уравновешивают осуществимость и точность при изучении редких или чувствительных клинических образцов, таких как образцы новорождённых. Обработка изолированных клеток на последующих этапах также получила методологические усовершенствования. Криоконсервация с помощью сыворотки плода (FBS) и диметилсульфоксида (DMSO) остаётся надёжным подходом для иммунных клеток, особенно в фетальной и неонатальной крови, где жизненность и восстановление клеток имеют решающее значение. Помимо оптимизации процесса сбора крови, мы также внедрили последующие методы, позволяющие извлекать максимальную информацию из небольших объёмов образцов. Мы вводим набор оптимизированных протоколов, которые способствуют отбору проб в раннем возрасте, позволяя подробно изучать иммунную динамику с течением времени. Наш подход использует передовые методы, такие как спектральная потоковая цитометрия, протеомика и секвенирование одноклеточных РНК, которые в совокупности дают непревзойденный взгляд на протеомные и транскрипционные сигнатуры циркулирующих иммунных клеток в раннем возрасте. Кроме того, спектральная потоковая цитометрия предоставляет возможности получить функциональное понимание с минимальным вкладом клеток.

За годы для анализа иммунных клеток, полученных из крови, применялись различные методы, такие как полные анализы крови (CBC), а другие анализировали соотношение иммунных клеток в образцах цельной крови новорождённых с помощью метилированияДНК 16,17. Хотя эти методы помогают определить пропорции известных иммунных клеток, у нас всё ещё есть ограничения в получении глубоких сведений о клетках без мультиомической системы. CBC предоставляет лишь общие показатели основных типов кровяных клеток, что делает их полезными для установления общего иммунного статуса в клинических условиях, но ограниченными в способности различать подтипы или функциональные состояния. В последнее время исследования начали решать это ограничение, используя транскриптомные и метаболомные изменения плазмы у младенцев уже на первой недележизни 18. Протеомика на основе масс-спектрометрии была адаптирована для изучения иммунных профилей в неонатальныхобразцах 19. Этот подход эффективен для беспристрастного измерения широкого спектра белков и выявления потенциальных биомаркеров. Однако ключевые ограничения включают необходимость относительно большого количества белков и отсутствие прямой информации о идентичности клетки, несмотря на захват как растворимых, так и нерастворимых белков. Таргетированный мультиплексный протеомный анализ (TMPA) предлагает альтернативы для низковводимых образцов. Эти методы используют таргетное обнаружение на основе антител, обеспечивая высокочувствительное профилирование образцов с ограниченным материалом. Один из них, в частности, использовался для отслеживания траекторий развития иммунного развития в раннем возрастепо продольной 20-й точке зрения.

Проточная цитометрия позволяет проводить количественный анализ белков иммунных клеток на уровне одной клетки, пропуская флуоресцентно маркированные клетки через сфокусированный лазерный луч и измеряя полученные сигналы рассеяния света и флуоресценции. В этой технике флуоресцентно маркированные антитела связываются с определёнными поверхностными или внутриклетвенными белками. Это позволяет одновременно обнаруживать и количественно оценивать несколько подтипов иммунных клеток и их определяющих характеристик на основе флуоресцентных профилей. Спектральная потоковая цитометрия расширяет этот подход, фиксируя полный эмиссионный спектр каждого фторохрома, что позволяет проводить точное спектральное смешивание и одновременное обнаружение более 35 маркеров в одноманализе 21,22,23. Это позволяет анализировать гораздо больше маркеров, чем обычные панели проточной цитометрии, которые ограничены ~8-12 маркерами. В дополнение к этим цитометрическим методам, секвенирование одноклеточной РНК (scRNA-seq) преобразило иммунологические исследования, обеспечив высокоразрешающее, беспристрастное транскриптомическое профилирование на основе минимального входногоматериала 24. Несмотря на более высокие затраты и зависимость от жизнеспособности клеток, scRNA-seq даёт непревзойдённые представления о гетерогенности иммунной гетерогенности в раннем возрасте по сравнению с массовым секвенированием. В совокупности эти достижения демонстрируют, как инновации в сборе, сохранении и анализе адаптируются для преодоления уникальных задач изучения иммунитета плода и новорожденных.

Этот протокол был оптимизирован для анализа криоконсервированных периферических иммунных клеток, выделенных путём серийного лиза эритроцитов. Исследователям следует рассмотреть этот протокол, если их исследования требуют высокоразрешающего иммунного профилирования из небольших объёмов крови (100–500 мкл), особенно когда продольный анализ критически важен. Метод широко применим как для недоношенных новорождённых, так и для недоношенных новорождённых, совместим с широким спектром последующих анализов, что делает его подходящим для различных исследовательских вопросов в неонатальной и детской иммунологии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Информированное согласие родителей и полное соблюдение соответствующих национальных этических норм были обеспечены в соответствии с Институциональным обзорным советом Йельского университета (IRB). Как указано в утверждённом протоколе IRB, исследовательская группа связывалась с родителями в течение первой недели после рождения младенца для получения согласия до начала зачисления. Никаких процедур изучения материалов, полученных от человека, не начиналось до получения задокументированного этического одобрения.

1. Сбор, обработка и хранение образцов (рисунок 1)

  1. Стационарный забор крови
    1. После получения образцов младенцев соберите и обработайте их при 4 °C и обработайте в течение 12 часов после забора.
    2. Соберите ~250 мкл цельной крови и храните в антикоагулянте для ЭДТА-пробирки крови. Инвертируйте трубку для сбора крови 8 раз, чтобы смешать антикоагулянт.
    3. Продолжите обработку всей крови с использованием лизиса красной крови, как описано в разделе 1.3 (обработка образцов цельной крови).
    4. Чтобы собрать сухие кровяные пятна, используйте стерильный ланцет, чтобы сделать прокол на очищенном пальце/пятке.
      1. Альтернативно, пипетку — ~25-30 мкл крови из ЭДТА-трубки на фильтрующую бумагу. Легко коснитесь фильтрующей бумаги капли крови.
    5. Заполните хотя бы один круг свободно текущей кровью, по одной капле на круг. Дайте пятну крови высохнуть. Держите фильтрационную бумагу открытой, пока пятна крови не высохнут.
    6. Маркируйте с указанием времени сбора, даты обработки, времени и идентификации образца.
    7. Положите в прозрачный пластиковый пакет с молнией. Храните кровяные пятнистые карты при −20 °C или −80 °C для длительной стабильности до готовности к протеомному анализу.
  2. Амбулаторный забор крови
    ПРИМЕЧАНИЕ: С одобрения Институционального обзорного совета Йельского университета родителям амбулаторных участников была предоставлена возможность брать образцы крови дома с помощью микроигольного устройства для самостоятельного отбора. Это устройство получает капиллярную кровь через ланцет, наносящий на кожу. Родители, выбравшие этот метод, проходили обучение в клинике с использованием демонстрационных наборов, а затем получали подробные письменные инструкции и наборы для домашнего использования.
    1. Мойте руки и надевайте перчатки перед использованием. Соберите все необходимые предметы, включая зеркало, если только один из родителей занимается забором крови.
    2. Достаньте устройство из инструмента и открутите крышку из совместимой трубки.
    3. Прижимайте трубку к устройству, пока она не будет плотно с заполнением, направленными наружу.
    4. Снимите подгузник младенца и держите его вертикально.
    5. Следуйте инструкциям грелки для активации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если рюкзака недоступна, используйте другой способ прогрева, например, руку.
    6. Держите грелку на месте (ягодицы) 2-4 минуты, чтобы согреть и улучшить кровоток.
    7. Очистите место спиртовой прокладкой и дайте высохнуть.
    8. Снимите прозрачную крышку с красной кнопки. Снимите язычок с устройства и плотно приклейте к самой полной части ягодиц младенца, держа его вертикально.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости корректируйте их осанку, чтобы трубка оставалась полностью вертикальной для правильного сбора крови.
    9. Нажмите кнопку до конца один раз и отпустите. Установите таймер на 5 минут. Наблюдайте, как трубка заполняется с помощью зеркала по мере необходимости.
    10. В первые 1-2 минуты крови может не появляться. Удалите устройство максимум через 5 минут или раньше, если кровь наполняется до верхней индикаторной линии раньше 5 минут.
    11. Снимите трубку с устройства с лёгким поворотом и потяните вниз. Быстро защёлкни крышку полностью к трубке. Инвертируйте трубку не менее 10 раз, чтобы при каждом инверсии кровь соприкасалась с крышкой, чтобы предотвратить тромбирование.
    12. Отправьте образцы ночью после сбора.
  3. Обработка образцов цельной крови
    1. Обрабатывайте образцы крови в шкафу биологической безопасности.
    2. Аккуратно переведите 250 мкл крови в коническую трубку объёмом 50 мл с 10 мл 1x буфера лизиса эритроцитов. Промывайте трубку для сбора крови 10 мл буфера для лизиса эритроцитов до опустошения. Дайте клеткам лизировать при комнатной температуре (RT) в течение 15 минут.
    3. После завершения лизиса добавьте ~30 мл PBS при RT, чтобы промыть и отвести при 430 × г в течение 5 минут при 4 °C. Аспирируйте супернатант с помощью вакуума, не нарушая гранулу.
    4. Продолжайте переносить и промывать образец в соответствии с шагом 1.3.2, пока клетка не освободится от видимых эритроцитов. Центрифугуйте при 430 × г в течение 5 минут, затем аккуратно удалите супернатант, не нарушая гранулу.
    5. На каждые 250 мкл собранной крови восстановите полученную клеточную гранулу в 2 мл замораживающей среды (10% DMSO в FBS) и разделите на два криовиала для сохранения.
    6. Проверяйте жизнеспособность клеток, подсчитывая клетки, ресуспендированные в феизирующей среде, с помощью гемоцитометра с использованием трипан-синего исключения.
    7. Перенесите 1 мл с шага 1.3.5 на каждый криовиал. Правильно маркируйте время сбора, дату обработки, точку времени и идентификацию образца.
    8. Храните криовиальные изделия промежуточно при -80 °C в замораживающем контейнере с изопропанолом. Через 24 часа переведите криовиальные материалы в жидкий азот до готовности к анализу.

2. TMPA из засохших кровавых пятен (DBS) (Рисунок 2)

  1. В день обработки принесите фильтрующую бумагу в RT. С помощью металлического перфоратора диаметром 3 мм проделите 2-3 круга в фильтрующей бумаге, где проходила кровь, как можно ближе к месту крови.
  2. Поднимите каждый 3-мм пуансон пинцетом и добавьте в колодку пластину на 96 лунок или низкосвязывающую ПЦР-трубку с 20 мкл буфера элюции (1x PBS, 1x ингибитор протеазы, 0,05% Tween 20). Убедитесь, что пуансон покрыт элюсионным буфером.
  3. Закройте трубки или накройте пластину пластиковой юбкой и поставьте их на цифровой вихрь, вращающийся со скоростью 600 об/мин в течение 60 минут на RT.
  4. В конце инкубации аккуратно перенесите элуат в новую низкосвязывающую трубку или пластину с 96 лунками. Сбросьте трубки или пластины с помощью фильтрующих пуансонов.
  5. Измерите содержание белка с помощью анализа BCA.
    1. Возьмите по 2 мкл каждого образца или стандарта BSA, чтобы получить последовательные разбавления в воде в соотношении 1:10 и 1:100. Подготовьте образцы и стандарты в дубликате, добавляя 15 мкл разбавленных образцов или стандарт к 200 мкл рабочего раствора 1x. Инкубировать образцы в течение 30 минут при 37 °C.
    2. Считывайте сигнал с частотой 562 нм на считывателе пластин. Рассчитайте конечную концентрацию белка на основе стандартного наклона BSA и фона буфера элюирования.
  6. Изготовьте аликвоты по 30 мкл для образцов с концентрацией 0,5-1 мг/мл в микропробирках с низким уровнем связывания 1,5 мл с винтовыми крышками. Заморозить образцы при -80 °C для последующего подачи с использованием сервиса TMPA.

3. Спектральная цитометрия лизированной крови эритроцитов (Рисунок 3)

  1. В день эксперимента быстро разморозите флакон с клетками, лизированными эритроцитами, в водяной бане при температуре 37 °C, пока не останется одна маленькая капля льда.
  2. Добавьте суспензию клетки в коническую трубку объёмом 15 мл, содержащую 10 мл предварительно подогретого (37 °C) полного RPMI (приготовленного с использованием 500 мл RPMI 1640, 50 мл FBS, 5,6 мл пенициллин-стрептомицина и 5,6 мл добавки глутамина). Центрифуга при 400 × г в течение 5 минут при комнатной температуре. Аккуратно снимите и выбросьте супернатант.
  3. Аккуратно подвесьте гранулу в 3 мл полного RPMI и определите количество клеток соответствующим методом.
  4. Вращайте вновь взвешенные клетки при 400 × г в течение 5 минут при комнатной температуре. Аспирируйте и отвергайте супернатант.
  5. Отрегулировать концентрацию клеток на 1 × 106 клеток/мл при полном RPMI. Раздайте 100 мкл на одну скважину (0,1 × 10⁶ элементов) в пластину с V-образным дном на 96 лунок. Центрифугите при 764 × г на 2 минуты при 4 °C и удалите супернатант.
  6. Добавьте 100 мкл живого/мёртвого красителя в PBS при разбавлении 1:2 000 с блоком Fc и моноцитным блоком (разбавление 1:100) во все образцы, кроме неокрашенной контрольной. Инкубировать 15 минут при 4 °C.
  7. Промывайте 100 мкл PBS и центрифугу при 764 × г в течение 2 минут при 4 °C. Аккуратно отбросьте супернатант.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно использовать блок Fc и блок моноцитов, чтобы предотвратить неспецифическое связывание антител.
  8. Добавьте 100 мкл поверхностного коктейля, разбавлённого (1:200 разбавления) в буфере FACS (500 мл PBS, 2,5 г бычьего сывороточного альбумина (BSA), 2 мМ EDTA, pH 8,5) во все образцы, кроме неокрашенного контроля. Инкубировать 30 минут при 4 °C.
  9. Промыйте буфером FACS 100 мкл и центрифугой при 764 × г в течение 2 минут при 4 °C. Аккуратно отбросьте супернатант.
  10. Фиксируйте клетки, добавив 100 мкл 4% параформальдегида в каждый образец. Инкубировать 15 минут на RT в темноте.
  11. Промыть с помощью 100 мкл буфера FACS, промыть центрифугу при 764 × г в течение 2 минут при 4°C и снова суспензировать в 200 мкл буфера FACS.
  12. Подготовьте ультра-композитные бусины как одноцветные элементы. Окрашивайте одноцветные контрольные шарики по тому же протоколу, что и образцы, включая фиксацию, если образцы были фиксированы.
  13. Подготовьте люминесцентные контроли Минус Один (FMO) по той же процедуре, что и для образцов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно относиться к одноцветным контролям и FMO так же, как и к сэмплам. Например, если образцы фиксируются после окрашивания, то также должны быть фиксированы FMO и одноцветные элементы.
  14. Пропустите сэмплы, одноцветные элементы, неокрашенные и FMO контроли на обычном/спектральном потоковом цитометре. Анализируйте данные с помощью программного обеспечения.
  15. Устанавливайте элементы на основе соответствующих контролей изотипа и FMO. Во-первых, используйте гейт-клетки для выбора популяции лейкоцитов с помощью графика прямого рассеяния (FSC) против бокового рассеяния (SSC), что помогает исключить мусор и выбрать клетки по размеру и детализированности.
  16. После отбора лейкоцитарных клеток используйте гейт-клетки, чтобы исключить дублеты, используя график площади прямого рассеяния (FSC-A) и высоты прямого рассеяния (FSC-H).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это обеспечивает отбор отдельных ячеек (синглет), при этом клетки, расположенные по диагонали, считаются синглетами, а дублеты и сгустки исключаются.
  17. Гейт-ячейки для оценки жизнеспособности с помощью красителя жизнеспособности для исключения мёртвых клеток, гарантируя, что последующий анализ включает только живые клетки.
  18. После этих начальных этапов гейтинга можно дополнительно отключить живые одиночные клетки для получения определённых маркеров линии, чтобы подкатегоризировать различные популяции иммунных клеток. Разделить живые одиночные клетки на миелоидные клетки CD33+ и CD33-лимфоциты на основе экспрессии CD33.
  19. В популяции CD33+ дифференцировать моноциты CD14+ и определить дендритные клетки CD11c+ (DC) как клетки, экспрессирующие CD11c, но не CD14.
  20. Внутри популяции лимфоцитов CD33 откройте CD3+ Т-клетки и подгейт для идентификации подмножеств CD4+ и CD8+ Т-клеток.
  21. Кроме того, идентифицировать клетки естественных киллеров CD56+ (NK) по экспрессии CD56 и гейт CD19+ B-клеток по экспрессии CD19.

4. scRNA-seq лизованной крови эритроцитов (рисунок 4)

  1. Разморозить один флакон криоконсервированных лизерных клеток эритроцитов в водяной бане при температуре 37 °C. Добавьте образец в 10 мл Т-клеточной среды в конической трубке объёмом 15 мл. Центрифуга при 430 × г в течение 5 минут при 4 °C. Отбросьте супернатант.
  2. Добавьте ещё 10 мл 1x PBS в образец. Центрифуга при 430 × г в течение 5 минут при 4 °C. Отбросьте супернатант.
  3. Посчитайте клетки и оцените жизнеспособность с помощью трипан-синего. Если жизнеспособность менее 70%, переходите к удалению мертвых клеток с помощью Набора для удаления мертвых клеток.
    1. Удаление мёртвых клеток
      1. Разведите 20-кратный буферный приклад с помощью стерильной двойной дистиллированной воды, чтобы получить рабочий раствор в 1 раз.
      2. Подвешивать клеточную гранулу в 100 мкл удаления мёртвых клеток Микрошарики на 1 × 107 клеток. Тщательно перемешайте и инкубуйте 15 минут при комнатной температуре (RT).
      3. Вставьте магнитную сепарационную колонку в соответствующую магнитную стойку. Перед использованием промыйте колонку 500 мкл 1x Binding Buffer, чтобы уравновесить.
      4. Увеличите объём ячейки до 500 мкл с 1x буфером связывания. Прикладывайте суспензию ячейки к колонке и собирайте поток в новую микроцентрифугную трубку объёмом 1,7 мл.
      5. Промывайте 2 раза с 500 мкл буфера для крепления. Соберите поток в той же микроцентрифугной трубке.
      6. Центрифугуйте элюат при 300 × г в течение 10 минут. Отбросьте супернатант.
    2. Посчитайте клетки и оцените их жизнеспособность с помощью трипан-синего.
    3. Ресуспензировать 20 000 жизнеспособных клеток в 40 мкл PBS с 0,04% BSA в новой микроцентрифуге на 1,7 мл.
    4. Немедленно отправьте клетки на льду в геномный центр для генерации и секвенирования библиотек. Сбор результатов секвенирования в формате выходов Cell Ranger.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы собрали карты DBS у 10 крайне недоношенных младенцев в три временных периода: 1 неделя (n = 12), 1 месяц (n = 7) и 2 месяца (n = 3) для протеомического анализаTMPA 6 (рисунок 2A). Эти образцы анализировались вместе с кровью пуповины полновременного младенца (TCB; n = 4) и здоровой взрослой кровью (AB; n = 5). Нормализованная экспрессия белка (NPX) 92 иммунно-связанных белков была количественно измерена с помощью платформы TMPA (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Получение высококачественных иммунологических данных из минимальных объёмов неонатальной и младенческой крови требует методологических адаптаций на нескольких этапах. В этом протоколе мы описываем четыре взаимодополняющие стратегии: (i) оптимизированный сбор крови и криоконсервация для сохранения жизнеспособных клеток для дальнейшего использования, (ii) применение спектральной цитометрии для мультипараметрического иммунофенотипирования, (iii) scRNA-seq для выявления иммунной гетерогеннос...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим следующие основные учреждения Йеля: ядро Yale Flow Cytometry core; Центр геномного анализа Йельского университета. Мы благодарим Йельский центр клинических исследований, Йельский офис по развитию врачей-учёных и учёных, а также Программу развития детских специалистов по интенсивной терапии и травматологии/NICHD. Респирометрические исследования проводились Ядром химического метаболизма Йельского университета. Эта работа была профинансирована грантами: P01 AI179570 (Л.К.), R01AI171980 (Л.К.), R01DK129552 (Л.К.), R01HL163043 (Л.К.), Фонд муковисцидоза (Л.К.); K08 AI177743 (N.N.B.), премия Hartwell (N.N.B.); K08DK133687 (O.O.), Медицинская школа Йельского университета, кафедра педиатрии (O.O.); R01AI123204 (C.R.O). Содержание лежит исключительно на авторах и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения. Рисунок 1 был создан в BioRender. Гавон, К. (2025) https://BioRender.com/7embw10.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,5 M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher Scientific 15575-038 
1x буфер лизиса эритроцитов и nbsp;Invitrogen 3177165 
Набор анализа белков BCA  Abcam ab287853 
BD Microtainer MAP MicrotubeFisher Scientific 22-253-270
Бел-Арт Крио-Сейф -1 градус; C Freeze Controller Millipore Sigma 41122800 
Бычий сывороточный альбумин (BSA)Sigma-Aldrich A9647-100G 
Brilliant Ultra Violet 496 Anti-Human CD3 Thermo Fisher Scientific 364-0038-42 
Brilliant Ultra Violet 661 античеловеческий CD11c Бакалавр бионауки 612968 
Brilliant Vil750 Anti-Human CD14 BioLegend 367135 
Brilliant Violet 570 Anti-Human CD8a BioLegend 301038 
Brilliant Violet 711 Anti-Human CD56 BioLegend 318336 
cOmplete, Mini, без ЭДТА Коктейль с ингибиторами протеазыMillipore Sigma 11836170001 
Набор для удаления мертвых клеток;Miltenyi Biotec 130-090-101 
Диметилсульфоксид (DMSO) Thermo Fisher Scientific BP231-100 
Дульбекко s Фосфатно-буферный физиологический раствор (DPBS), без кальция, без магния и БСП;Thermo Fisher Scientific 14190144 
Сыворотка плода для крупного рогатого скота (FBS) Gibco A5256801 
Фишербранд Digital Vortex Mixer Thermo Fisher Scientific 02215418 
Буфер фиксации BioLegend 420801 
Добавка GlutaMAXGibco 35050061 
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 
MS columns Miltenyi Biotec 130-042-201 
НазваниеКомпанияКаталожный номер
OctoMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-109 
Pacific Blue Anti-Human CD4 BioLegend 344619 
Пенициллин-стрептомицин (10 000 U/мл)Thermo Fisher Scientific 15140-122 
RB780 Античеловеческий CD33 BD Biosciences 755606 
Rierdge 3 мм металлический перфоратор  Rierdge SDD231031PC-01 
RPMI 1640 MediumGibco 11875-093 
Spark UV 387 Античеловеческий CD19 BioLegend 302289 
Наборы коллекции ТассоTasso Н/Д
Микротрубки Thermo Scientific с винтовой крышкойThermo Fisher Scientific 14-755-287 
Whatman 309 ProteinsaverCytiva 41111700 
Комплект для исправляемой жизнеспособности Zombie NIR BioLegend 423105 
<Сильно>Программное обеспечение и пакеты
Adobe Illustrator2024
bbknn1.5.1
FlowJo10.8.1
GraphPad Prism9.4.0
НазваниеВерсия
Скэнпи1.9.1
Срублет0.2.3
<сильные>коммерческие анализы
Хромовая одиночная ячейка 5' Набор10X ГеномикаPN-1000263
Olink  Раскрытие или Цель 96 воспалительная панельOlinkhttps://olink.com/products/olink-target-96

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the newborn and young infant from infectious diseases: lessons from immune ontogeny. Immunity. 46 (3), 350-363 (2017).
  2. Jain, N. The early-life education of the immune system: moms, microbes and (missed) opportunities. Gut Microbes. 12 (1), 1824564(2020).
  3. Konnikova, L., et al. Fetal and neonatal T cell immunity: unique features and challenges. Front Immunol. 11, 594939(2020).
  4. Pieren, D. K. J., Boer, M. C., De Wit, J. The adaptive immune system in early life: the shift makes it count. Front Immunol. 13, 1031924(2022).
  5. Brodsky, N. N., et al. Early-life human CD8+ T cells exhibit rapid, short-lived effector responses and a unique transcription factor landscape. Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (31), e2421106122(2025).
  6. Olaloye, O., et al. A single-cell atlas of circulating immune cells over the first 2 months of age in extremely premature infants. Sci Transl Med. 17, eadr0942(2025).
  7. Watson, N. B., et al. The gene regulatory basis of bystander activation in CD8+ T cells. Sci Immunol. 9 (92), eadf8776(2024).
  8. Maymí, V. I., et al. Neonatal CD8+ T cells resist exhaustion during chronic infection. J Immunol. 212 (5), 834-843 (2024).
  9. Kandasamy, R., Kollmann, T. R. Challenges in neonatal immunology. Front Immunol. 8, 1756(2017).
  10. Howie, S. R. Blood sample volumes in child health research: review of safe limits. Bull World Health Organ. 89 (1), 46-53 (2011).
  11. Gross, R., et al. Researching COVID to enhance recovery (RECOVER) pediatric study protocol: rationale, objectives and design. medRxiv. , (2023).
  12. Bourguignon, P., et al. Processing of blood samples influences PBMC viability and outcome of cell-mediated immune responses in antiretroviral therapy-naïve HIV-1-infected patients. J Immunol Methods. 414, 1-10 (2014).
  13. Urbansky, A., et al. Rapid and effective enrichment of mononuclear cells from blood using acoustophoresis. Sci Rep. 7 (1), 17161(2017).
  14. Najar, M., et al. Proliferative and phenotypical characteristics of human adipose tissue-derived stem cells: comparison of purification methods. Cytotherapy. 16 (9), 1220-1228 (2014).
  15. Abebe, D. Diagnostic significance of complete blood cell count and hemogram-derived markers for neonatal sepsis. World J Clin Pediatr. 13 (2), 1-13 (2024).
  16. Martino, D., et al. DNA methylation signatures underpinning blood neutrophil to lymphocyte ratio during first week of human life. Nat Commun. 15, 8157(2024).
  17. Jones, M. J., et al. DNA methylation differences between cord and adult white blood cells reflect postnatal immune cell maturation. Commun Biol. 8, 237(2025).
  18. Lee, A. H., et al. Dynamic molecular changes during the first week of human life follow a robust developmental trajectory. Nat Commun. 10, 1092(2019).
  19. Mithal, L. B., et al. Evolution of the umbilical cord blood proteome across gestational development. Sci Rep. 15 (1), 2233(2025).
  20. Olin, A., et al. Stereotypic immune system development in newborn children. Cell. 174 (5), 1277-1292.e14 (2018).
  21. Spasic, M., et al. Spectral flow cytometry methods and pipelines for comprehensive immunoprofiling. Cancer Res Commun. 4 (3), 895-910 (2024).
  22. Park, L. M., Lannigan, J., Jaimes, M. C. OMIP-069: forty-color full spectrum flow cytometry panel. Cytometry A. 97 (10), 1044-1051 (2020).
  23. Sahir, F., et al. Development of a 43-color panel for comprehensive immune cell characterization. Cytometry A. , (2020).
  24. Tang, F., et al. mRNA-seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nat Methods. 6, 377-382 (2009).
  25. Wolf, F. A., Angerer, P., Theis, F. J. SCANPY: large-scale single-cell gene expression data analysis. Genome Biol. 19, 15(2018).
  26. Wolock, S. L., Lopez, R., Klein, A. M. Scrublet: computational identification of cell doublets. Cell Syst. 8 (4), 281-291.e9 (2019).
  27. Polanski, K., et al. BBKNN: fast batch alignment of single-cell transcriptomes. Bioinformatics. 36 (3), 964-965 (2020).
  28. Li, Y., et al. DMSO-free cryopreservation improves recovery and function of human T and NK cells. Cell Transplant. 31, 1-12 (2022).
  29. Meryman, H. T. Cryopreservation of living cells: principles and practice. Transfusion. 47 (5), 935-945 (2007).
  30. Wohnhaas, C., et al. RNA integrity in cryopreserved immune cells enables robust single-cell transcriptomics. Front Immunol. 10, 204(2019).
  31. Daae, L. N. W., et al. Comparison of haematological parameters in capillary and venous blood samples from hospitalized children. Scand J Clin Lab Invest. 51 (7), 651-654 (1991).
  32. Meites, S. Skin-puncture and blood-collecting technique for infants. Clin Chem. 34 (9), 1890-1894 (1988).
  33. Grüner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. Dried blood spots: preparing and processing. J Vis Exp. (97), e52619(2015).
  34. Waaijer, L. A., et al. Spectral flow cytometry panel for comprehensive immunophenotyping. Cytometry A. 107 (4), 226-232 (2025).
  35. Thieme-Ehlert, M. T., et al. OMIP-114: a 36-color spectral flow cytometry panel. Cytometry A. 107 (6), 364-371 (2025).
  36. Yamawaki, T. M., et al. Systematic comparison of high-throughput single-cell RNA-seq methods. BMC Genomics. 22, 66(2021).
  37. Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nat Methods. 14 (9), 865-868 (2017).
  38. Grandi, F. C., et al. Chromatin accessibility profiling by ATAC-seq. Nat Protoc. 17 (6), 1518-1552 (2022).
  39. Kim, N., et al. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing. J Pathol Transl Med. 57 (1), 52-59 (2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи