С ростом интереса к внутриопухолевой иммунотерапии крайне важно выбирать доступные и практичные модели опухолей. Подкожные опухоли легко выявить, но их сложно визуализировать и манипулировать. В этом протоколе мы описываем методы создания внутрикожных опухолей, обеспечивающих улучшенную видимость и доступность.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Внутрикожная имплантация опухолей как надёжная модель для исследований внутриопухолевой иммунотерапии рака мышей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Создание воспроизводимых моделей опухолей мышей крайне важно для оценки биологии рака и стратегий иммунотерапии. Внутриопухолевая иммунотерапия лечит устоявшиеся опухоли иммуностимулирующими реагентами, чтобы обратить местное иммуносупрессие и стимулировать системный противоопухолевой иммунитет. Большинство исследований рака у мышей определяют опухоли в подкожном пространстве, что имеет свои трудности для экспериментальной внутриопухолевой иммунотерапии из-за невозможности визуализировать внутриопухолевые инъекции. Внутрикожная инъекция опухолевых клеток обеспечивает надёжный подход к созданию визуализируемых опухолей, поддерживающих точную и воспроизводимую внутриопухолевую инъекцию, а также мониторинг кинетики роста и терапевтических ответов. Здесь мы представляем воспроизводимую методологию установления и лечения внутрикожных опухолей с использованием модели меланомы у мышей B16F10 у мышей C57BL/6 в качестве примера. Суспензии опухолевых клеток вводятся внутрикожно, и через 7–10 дней после имплантации, когда опухоли достигают ~60мм 3, можно напрямую применять внутреннюю инъекцию иммуностимулирующих агентов или физическое лечение, такое как электропорация или нагрев. Это позволяет точно проводить лечение и измерять рост опухоли с помощью суппортов, а также избегает проблем с присущей вариабельности множества методов лечения подкожных опухолей, которые невозможно визуализировать. Предоставляя подробное представление об этой методике, эта статья направлена на поддержку воспроизводимости и продвижение доклинических исследований внутриопухолевой иммунотерапии.
Введение
Модели опухолей мышей являются незаменимым инструментом в исследованиях рака. В оптимальной модели мышей можно индуцировать опухоли, которые близко имитируют человеческие опухоли как на генетическим, так и на морфологическомуровне 1. Это позволяет оценивать и эффективно применять новые терапевтические подходы в различных областях, включая внутриопулевевую иммунотерапию (ITIT). ITIT — это новая область лечения рака, которая включает прямое введение иммуностимулирующих агентов в микроокружение опухолей (TME). Эта локализованная доставка может усиливать локальную иммунную активацию, обратить вспять иммуносупрессивную микросреду опухоли и запускать системные противоопухолевые иммунные ответы, известные как абскопальныйэффект 2. Однако эффективность, точность и последовательность внутриопухолевого введения зависят от способности визуализировать и контролировать параметры инъекции в различных моделях опухолей.
Большинство доклинических исследований рака используют подкожную имплантацию опухоли. Однако этот подход имеет ограничения для внутриопухолевых терапий, поскольку опухоль нельзя напрямую визуализировать во время инъекции без проведения операции. Многие методы внутриопухолевой иммунотерапии требуют точной доставки реагентов в мелкие мышиные опухоли и часто требуют выполнения этой задачи несколько раз. Без визуального подтверждения точность инъекций и удержание реагентов в подкожных опухолях становятся плохо контролируемыми переменными. Это может привести к неправильной интерпретации или изменению экспериментальныхданных 3.
Внутрикожная имплантация опухолей обеспечивает прямую, доступную, визуализируемую и воспроизводимую альтернативу для наблюдения, измерения и внутриопухолевых инъекций, тем самым повышая консистенцию опухоли. Кроме того, исследования показали, что опухоли, имплантируемые внутрикожно, в отличие от подкожных инъекций, усиливают иммуногенность и подавляют опухологенностьопухолевых клеток 4. Внутрикоженые опухоли вызывали быстрый и сильный трафик дендритных клеток к лимфатическим узлам, что приводило к более ранней и более устойчивой активации цитотоксичныхТ-клеток 4. В настоящем исследовании описывается подробный и воспроизводимый протокол установления внутрикожных опухолей B16F10 у мышей C57BL/6 и проведения последующих внутриопухолевых процедур.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры проводились с одобрения и в соответствии с руководящими принципами Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) 5. Все процедуры на животных проводились в Ветеринарном центре Дартмута. Самки C57BL/6 в возрасте 6–8 недель содержались в стандартных условиях на вентилируемых стеллажах с едой и водой. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.
1. Бритьё мышей
ПРИМЕЧАНИЕ: Весь персонал должен пройти институциональную подготовку по обращению с живыми животными и анестезии перед проведением этих процедур.
- Перед внутрикожной инъекцией побрить бок каждой мыши, как описано ниже; Правый фланг использовался для инъекций и описанных процедур. Брийте мышей за день до инъекции опухолевых клеток.
- Поставьте мышь на устойчивую поверхность. Обхватите мышь за кожу затылка большим пальцем левого и указательного пальцев, а левую сторону тела аккуратно заправьте в ладонь, чтобы открыть правую. Используйте безымянные и/или мизинцы, чтобы удерживать левую ногу и хвост, чтобы правый бок был полностью открыт.
- Сбрийте шерсть от задней лапы до нижних рёбер, чтобы создать свободное место для инъекций.
- Обе стороны могут быть выбриты, если требуется дополнительное пространство для практики.
ПРИМЕЧАНИЕ: Новички могут анестезировать мышей при обучении бритью и правильной загривке.
2. Практикуйте инъекции с красителем
ПРИМЕЧАНИЕ: Практика может проводиться как на живых (анестезиированных), так и на усыпленных мышах, а также у любого пола. Самцы мышей обычно имеют более толстую и менее гибкую кожу по сравнению с самками, что делает процесс более технически сложным. По этой причине практика на мужчинах полезна для развития мастерства.
- Смешайте пищевой краситель с фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) в трубке Эппендорфа объёмом 1,5 мл до темнообразия (в этом исследовании использовался синий пищевой краситель).
- Заведите тренировочных мышей и анестезируйте их в соответствии с институциональными рекомендациями по уходу за животными.
- Поместите анестезированную мышь под носовой конус и наклоните корпус, чтобы открыть правый бок. Убедитесь, что анестезия достаточно, аккуратно зажав подушечку стопы и наблюдая отсутствие реакции.
- Загрузите 30 мкл раствора красителя в шприц с инсулиновым шприцем на 0,3 мл с иглой диаметром 29 г 1/2". Удалите все воздушные пузырьки.
- Используя недоминантную руку, аккуратно щипните и растягите ногу/кожу, чтобы создать гладкую, натянутую поверхность (избегайте подъёма кожи вверх). Введите иглю в дерму под небольшим параллельным углом к коже. Держите иглу видимой под поверхностью, чтобы подтвердить расположение кожи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время тренировки проверяйте разные положения хватки руки, чтобы поддерживать стабильное напряжение кожи и при этом держать пальцы подальше от пути иглы. Введите иглу на ~2 мм в кожу. Чтобы уменьшить обратный поток, введите иглу ~3 мм, затем немного отведите, чтобы создать «карман» перед инъекцией. Это помогает удержать краситель в месте инъекции. - Медленно вводите все 30 мкл раствора красителя, пока под поверхностью кожи не образовается небольшой заметный «пузырь»
ПРИМЕЧАНИЕ: Отсутствие видимых пузырьков указывает на то, что инъекция была введена подкожно, а не внутрикожно. Поддержание скоса в вертикальном положении помогает обеспечить точное расположение кожи и предотвращает слишком глубокие инъекции. - Продолжайте практику, пока внутрикожные пузырьки не будут стабильно формироваться. С каждой стороны может быть проведено от шести до восьми инъекций.
- После завершения практических инъекций усыпьте мышей в соответствии с утверждёнными протоколами Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) 5.
3. Подготовка опухолевых клеток для инъекций
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все этапы, связанные с клетками, в стерильном капюшоне. Имейте в виду, что разные линии опухолей мышей растут по-разному.
- Оттаять опухолевые клетки (B16F10, использовавшийся в этом исследовании) за несколько дней до внутрикожных инъекций.
- Культивировать клетки до 70%–80% слияния при сохранении достаточного количества свежих сред
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте 100% слияния, которое останавливает пролиферацию и замедляет рост опухоли. - Забирайте и готовьте клетки в концентрации 7 x 106 клеток/мл либо в 1x PBS, без сыворотки RPMI, либо в других средах, используемых для роста клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Модель опухоли B16F10, используемая в лаборатории, использует 2 x10-5 клеток в 30 мкл. Объём инъекции 30 мкл подходит, но количество клеток можно корректировать по мере необходимости для создания желаемой модели опухоли. Клетки оседают и собираются на дне трубки, поэтому, чтобы концентрация клеток оставалась постоянной, периодически аккуратно смешивайте их, чтобы они оставались в подвешенном состоянии. - Оставьте клетки на льду после обработки и быстро приступайте к введению. Длительное хранение на льду снижает жизнеспособность клеток, что может уменьшить количество живых клеток и негативно повлиять на образованиеопухоли 6.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки собираются и используются сразу в лаборатории. Инъекции проводятся в течение 20–60 минут после обработки клеток и положения их на лёд. Используйте партнёра при работе с большими группами, чтобы минимизировать время на льду.
4. Внутрикожные инъекции
- Анестезируйте экспериментальных мышей.
ПРИМЕЧАНИЕ: В лаборатории используется анестезия с использованием изофлуранного газа, но могут применяться инъекционные анестетики. - После анестезии поместите мышь под носовой конус и расположите тело так, чтобы полностью открыть правый бок.
- Аккуратно переверните подвеску ячейки, чтобы равномерно смешиваться.
- Внимать 30 мкл клетки в шприц объёмом 0,3 мл с иглой 29 G 1/2". Удалите воздушные пузырьки.
- Используя недоминантную руку, аккуратно растягивайте ногу/кожу в сторону, чтобы она стала гладкой и плотной (не поднимай её вверх). Введите скошенную иглу в дерму под небольшим параллельным углом. Игла должна оставаться видимой под кожей, показывая, что она не слишком глубокая.
ПРИМЕЧАНИЕ: Глубина иглы должна быть ~2 мм в кожу. Чтобы избежать обратного течения клеток, введите иглу на ~3 мм в кожу, слегка оттяните иглу назад, чтобы создать «карман» для введения клеток. Это значительно снижает обратный поток. - Очень медленно вводите все 30 мкл клеточной суспензии, пока под кожей не образуется небольшой видимый «пузырь». Подождите 5–10 секунд, прежде чем снимать иглу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Слишком быстрое удаление иглы может привести к тому, что раствор выйдет из кожи из-за давления. - Повторяйте это для каждой мыши. Заменяйте шприцы после каждой клетки (4–5 мышей), чтобы избежать притупления иглы.
- Следите за всеми мышами, пока они полностью не восстановятся после наркоза.
- Следите за образованием опухоли у мышей.
5. Внутриопухолевые инъекции
ПРИМЕЧАНИЕ: Опухоли обычно готовы к лечению через 7–10 дней после имплантации, когда достигнут нужного размера. Подходящий размер, используемый в лаборатории, составляет ~50мм 3 или выше по формуле: Объём = (Длина/2) * (Ширина*Ширина)7,8.
- Заранее подготовьте все методы лечения (например, в этом исследовании использовался 1x PBS). Храните растворы на льду или при комнатной температуре, в зависимости от конкретной обработки.
- Индуцировать анестезию согласно институциональным рекомендациям.
- Положите мышь под носовой конус для поддержания анестезии и разместите её так, чтобы опухоль была открыта.
- Набрать необходимый объём (например, 30 мкл, используемый здесь) в инсулиновый шприц на 0,3 мл с иглой 29 G, 1/2". Удалите воздушные пузырьки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объём будет различаться в зависимости от выбранного лечения и оптимальных условий. - Введите иглу горизонтально в опухоль и продвигайтесь к центру опухоли.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте введения сверху или под крутым углом, так как это может привести к тому, что инъекция будет слишком глубоко или в окружающую ткань. Описанное лечение было введено в виде одной инъекции. Дозы и частота приёма зависят от выбранного лечения и оптимальных условий. При небольших опухолях достаточно одной дозы для распределения лечения, но при крупных опухолях может потребоваться несколько инъекций для равномерного распределения лечения по опухоли. - Вводите лечение медленно и постепенно. Сделайте паузу на 10 секунд, прежде чем медленно убирать иглу, чтобы минимизировать обратный поток или утечку. Некоторые опухоли имеют высокое внутреннее давление, поэтому следует следить за тем, чтобы инъекция не протекала через отверстие для иглы.
- Повторяйте процедуру для каждой мыши. Заменяйте шприцы после каждой клетки по 4–5 мышей и при смене групп обработки, чтобы предотвратить перекрёстное загрязнение.
- Следите за мышами после анестезии, пока они не восстановят подвижность и нормальное дыхание. Продолжайте ежедневный мониторинг реакции на лечение и общего состояния здоровья.
ПРИМЕЧАНИЕ: Имейте в виду, что разные клеточные линии могут вызывать язвенность опухолей в разное время. Каждый эксперимент и каждый протокол IACUC чётко указаны конечные точки и критерии исключения. В лаборатории конечные точки для мышиных экспериментов составляют 1500мм3 , и возникающие язвы принимаются и не исключаются из исследования.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
При практике инъекций с красителем успешная внутрикожная доставка может быть подтверждена без эвтаназии мыши, наблюдая образование видимого «пузыря» в месте инъекции. Правильно выполненная внутрикожная инъекция образует большой, чётко выраженный и приподнятый «пузырь» (рисунок 1A–F). Мелкие или плоские пузырьки указывают на то, что инъекция может быть частично подкожной. Если не образуется «пузырь» и краситель или клетки распространяются под...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Успех этого протокола (рисунок 4) зависит от поддержания постоянной глубины внутрикожинного инъекции и точного размещения иглы для обеспечения доставки в дерму, а не в подкожный слой. Если угол иглы слишком крутой или давление инъекции слишком высокое, краситель или опухолевые клетки могут отложиться через кожу в подкожное пространство. После инъекции короткая пауза перед постепенным удалением иглы помогает предотвратить вытекание или образование дублетных о...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликтов интересов, которые нужно раскрывать.
Благодарности
AS признаёт грант на обучение иммунологии, T32 AI007363. KSK с благодарностью выражает признательность Фонду Schlumberger за поддержку через программу «Факультет будущего».
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
```html
```
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1.5 мл натуральная центрифужная пробирка | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Культуральная колба 150 см2 | Corning | 430825 | |
| Fluriso | Vet One | 13985-528-60 | изофлуран |
| Краситель для пищевых продуктов | Durkee | для практики | |
| Инсулиновая шприц-игла 0,33 x 12,7 мм | Exel | 26018 | |
| Мини Arco | Wahl | 08787-450A | машинка для бритья мышей |
| PBS, 1X без кальция & магния | Corning | 06325002 | рН 7.4 +/- 0.1 |
| RPMI 1640, 1x | Corning | 12225004 | |
| Электронный випаризатор низкого потока SomnoFlo | Kent Scientific | SF-01 | аппарат для анестезии |
Ссылки
- Zhang, W., Moore, L., Ji, P. Mouse models for cancer research. Chin J Cancer. 30 (3), 149-152 (2011).
- Silihe Kamga, K., Fiering, S. Intratumoral immunotherapy prior to cancer surgery a promising therapeutic approach. Front Immunol. 16, 1545000 (2025).
- Carlson, P. M., et al. Depth of tumor implantation affects response to in situ vaccination in a syngeneic murine melanoma model. J Immunother Cancer. 9 (4), e002107 (2021).
- Bonnotte, B., et al. Intradermal injection as opposed to subcutaneous injection enhances immunogenicity and suppresses tumorigenicity of tumor cells. Cancer Res. 63 (9), 2145-2149 (2003).
- Garber, J. C., et al. . Guide for the care and use of laboratory animals. , (2011).
- Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy. Curr Protoc Immunol. 109, 20.1.1-20.1.43 (2015).
- Mao, C., Beiss, V., Ho, G. W., Fields, J., Steinmetz, N. F., et al. In situ. vaccination with cowpea mosaic virus elicits systemic antitumor immunity and potentiates immune checkpoint blockade. J Immunother Cancer. 10 (12), e005834 (2022).
- Ho, G. W., et al. Intratumoral expression of IL-12 and CD40 ligand (CD154) from plasmids generates antitumor responses that eliminate tumoral T regs. Sci Rep. 15 (1), 24439 (2025).
- Kim, Y. C., Jarrahian, C., Zehrung, D., Mitragotri, S., Prausnitz, M. R. Delivery systems for intradermal vaccination. Curr Top Microbiol Immunol. 351, 77-112 (2012).
- Chen, X. Emerging adjuvants for intradermal vaccination. Int J Pharm. 632, 122559 (2023).
- Hickling, J. K., Jones, K. R., Friede, M., Zehrung, D., Chen, D., et al. Intradermal delivery of vaccines: potential benefits and current challenges. Bull World Health Organ. 89 (3), 221-226 (2011).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
