Методическая статья

Метод стабилизации мембранных белков в нанодисках

DOI:

10.3791/70283

⸱

30 апреля 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Biology, Hunan University, 2State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources, College of Life Science and Technology, Guangxi Key Laboratory for Sugarcane Biology, Guangxi University, 3Jinshan Hospital, Zhongshan Hospital, Institute for Translational Brain Research, State Key Laboratory of Medical Neurobiology, MOE Frontiers Center for Brain Science, Fudan University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании описывается процедура реконструкции мембранного белка, связанного с кислотой TWIK, K+ канала 2 (Задача 2) в нанодиски. Успешная сборка была подтверждена криоэлектронной микроскопией с использованием одной частицы, которая дала чётко определённые двумерные средние значения классов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Многие мембранные белки демонстрируют низкую стабильность, потерю активности и гетерогенность образцов при извлечении в детергентных средах, что создаёт серьёзные трудности для высококачественного крио-электронного микроскопического анализа. Технология нанодисков решает эти ограничения, используя мембранные белки каркасов (MSP) и фосфолипидов для восстановления целевых белков в нативный липидный бислой. В этом исследовании человеческий калиевый канал Task2 экспрессировался, растворялся и очищался в присутствии соответствующих моющих средств перед сборкой нанодиска. Полученный протокол устанавливает воспроизводимый рабочий процесс для восстановления нанодисков Task2, что демонстрируется ключевыми этапами валидации: явным изменением профилей хроматографии исключения размера (SEC), подтверждающим увеличение частиц, комиграцией Task2 и MSP на SDS-PAGE, а также чётко определёнными средними значениями 2D-классов с видимыми вторичными структурными особенностями. Первоначальная трёхмерная реконструкция дополнительно подтверждает целостность белка, встроенного в нанодиск. Улучшая чистоту, однородность и качество частиц образцов, этот подход предоставляет надёжную платформу для высококачественных структурных исследований Задачи 2 и методологическую основу, применимую к другим мембранным белкам.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мембранные белки играют ключевую роль в передаче клеточного сигнала, транспорте метаболитов, поддержании структурной целостности клетки и иммунных ответах. Дисрегуляция мембранных белков связана с различными заболеваниями, что делает их важными мишенями для разработкилекарств 1. Появление криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) позволило провести структурные исследования крупных и динамических мембранныхбелков 2. Основная задача при получении структур высокого разрешения заключается в извлечении этих белков из их естественных липидных бислоев при сохранении их естественных конформаций и биохимических функций. Кроме того, высокодинамичная конформация мембранных белков и сложность скрининга антител создают дополнительные препятствия для таргетного открытиялекарств 3,4. Традиционные методы экстракции мембранного белка часто используют моющие средства для имитации свойств гидрофобного липидного двуслойного слоя. Однако такой подход часто нарушает стабильность мембранного белка, что приводит к агрегации или частичномуразворачиванию. 5. Кроме того, моющие средства могут удалять необходимые липидные молекулы, критически важные для стабилизации белковой конформации, потенциально изменяя конформацию белка или даже нарушая их функцию, тем самым ограничивая их применение в скрининге антител и других последующихприложениях 6.

Технология нанодисков была впервые представлена Слигаром и егоколлегами 7. Эта самособирающаяся структура обычно формируется производными аполипопротеинов A1 (ApoA1), а именно MSP, а также синтетическими или натуральными липидами, обеспечивая стабильную среду для мембранных белков 7,8,9. MSP образует дисковидную структуру, окружая гидрофобные края липидного бислоя. Эта структура имеет гидрофобную поверхность, взаимодействующую с ациллипидными хвостами, стабилизируя мембранный белок, а также гидрофильную поверхность, обращённую наружу, позволяя мембранному белку оставаться растворимым в водныхрастворах 10. Нанодиски служат универсальной платформой для изучения мембранных белков. Сохраняя очищенные мембранные белки в почти родной липидной среде, они преодолевают ограничения традиционных методов на основе детергентов и сохраняют конформацию и биологическую функцию белков in vitro. В результате этот метод стал мощным инструментом для структурных исследований мембранных белков. По сравнению с традиционными моющими средами, липидный бислой в нанодисках обеспечивает структурную поддержку мембранных белков, стабилизируя их нативную конформацию — особенность, жизненно важная для белков, подверженных инактивации, таких как рецепторы, связанные с G-белками, и ионныеканалы 11. Кроме того, высокая однородность частиц нанодисков после сборки обеспечивает более сильную поддержку получения высококачественных крио-ЭМ данных и надёжных данных по поверхностному плазмонному резонансу/биослоевой интерферометрии12.

За последнее десятилетие технология нанодисков стала мощным инструментом для изучения мембранных белков в естественных липидных средах. Например, Вилела и коллеги13 разработали систематическую основу сборки нанодисков, оптимизируя условия восстановления и проверяя качество конечных компонентов. В частности, они объединили хроматографию исключения размеров (SEC) с количественными показателями (включая эффективность сборки и пиковую симметрию) для объективной оценки однородностиобразцов 13. В настоящее время нанодиски стали универсальной платформой. Используя одночасточный крио-ЭМ для обнаружения собранных нанодисковых белков, можно получить высококачественные структуры мембранных белков, и их применимость была окончательно подтверждена. Особенность двойной кольцевой плотности зоны MSP является решающим структурным доказательством успешногосвязывания 10,14,15. Кроме того, нанодиски служат ценным инструментом как для функционального анализа мембранных белков в липидных бислоях средах, так и для их применения в исследованиях ядерного магнитного резонансав растворах 16,17.

Этот протокол описывает метод сборки мембранного белка человека Task2 в нанодиски. Human Task2 — это pH-зависимый член семейства каналов K+ (K 2P) с двухпоровой доменной областью,18,19. Как и другие каналы K2P, Задача 2 является гомодимером с перестановкой доменов, каждая цепочка протомера содержит четыре трансмембранных спирали (TM1–TM4), две реэнтрантные поровые спирали (PH1 и PH2), два фильтра селективности (SF1 и SF2) и две внеклеточные спирали, образующие колпачки (CH1 и CH2). Целевым белком была усечённая форма Task2, лишённая C-терминальных 166 аминокислот — область, которая, как предполагалось, в значительной степени неструктурирована — что было установлено в улучшении экспрессии белков и биохимической стабильности. Молекулярная масса рекомбинированного Task2 составляет примерно 72 кДа с меткой GFP. Он был предварительно растворён и очищен с помощью моющего средства. Он был комбинирован с липидами и MSP при точно рассчитанном стехиометрическом соотношение. После удаления моющего средства с помощью Bio-Beads образец дополнительно очищался с помощью хроматографии с исключением размера (SEC) для получения препарата, подходящего для крио-ЭМ. Затем были получены двумерные (2D) средние значения классов на основе однокомпонентных крио-ЭМ данных для проверки целостности образца.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка липидного бульона

  1. Подготовка липидов
    1. Приготовьте липидные смеси с использованием трёх фосфолипидов: 1,2-диолеоил-сн-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE), 2-олеоил-1-пальмитоилглицеро-3-фосфохолин (POPC) и 1-пальмитоил-2-олеоилфосфатидилсерин (POPS).
    2. Используйте заранее подготовленные бульонные растворы этих липидов в хлорформе, каждый с концентрацией 25 мг/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При обращении с хлороформом необходимы средства индивидуальной защиты, и все процедуры должны проводиться в выхлопной вытяжке. Храните хлороформ в специализированном химическом шкафу.
    3. Из-за волатильности хлороформа, при измерении микрошприцом проверяют, совпадает ли объем раствора липидного запаса с первоначально зафиксированным объёмом до каждого использования. Если происходит испарение, пополните раствор чистым хлороформом до исходного объёма и тщательно перемешайте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед каждым измерением промывайте микрошприц дважды хлороформом.
    4. Приготовьте липидную смесь на 100 мкл с соотношением массы DOPE:POPC:POPS = 2:1:1. Исходя из этого соотношения, объедините 50 мклV POPE, 25 мкл VPOPC и 25 мкл VPOPS. Измерьте соответствующий объём по рассчитанному числу. Добавьте её в стеклянную пробирку и тщательно перемешайте.
    5. Поместите стеклянную пробирку в водяную ванну, чтобы уменьшить испарение хлороформа и поддерживать стабильную температуру окружающей среды.
  2. Подготовка липидной плёнки
    1. Испарить хлороформ под мягким струёй азота, пока вся жидкость не будет удалена, и на дне пробирки образуется прозрачная, однородная гелеобразная пленка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что на дне стеклянной трубки видна равномерная, сухая липидная плёнка, без остаточных капель жидкости. Избегайте чрезмерного потока азота, так как он может вызвать пузырьки и предотвратить полное высыхание хлороформа.)
    2. Добавьте примерно 2 мл n-пентана по капле в стеклянную пробирку. Затем испарите растворитель с помощью метода сушки азота, описанного в 1.2.1, чтобы получить сухую, прозрачную липидную пленку. n-пентан испаряется в стеклянной пробирке благодаря своей химической инертности и совместимости с органическими растворителями. Стекло предотвращает риск выщелачивания или деградации пластика, связанного с многими пластиковыми лабораторными материалами, тем самым сохраняя чистоту липидов во время образования пленки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: n-Pentane должен храниться в специальном шкафу с реагентами и, при использовании, осторожно обращаться в вытяжной вытяжке с надеванием соответствующих средств индивидуальной защиты.
    3. Ослабьте крышку пробирки и поместите её в вакуумный десикатор. Выпустите осушитель и поддерживайте его в вакууме, чтобы удалить остатки растворителей. Нанесите самовказующийся силикагель на дно десикатора для впитывания влаги.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Испарить остаточный хлороформ и n-пентан до сухости в вытяжной жидкости.
  3. Гидратация липидов и подготовка бульонного раствора
    1. Удалите липидную плёнку из вакуумного осушителя и увлажните её, добавив 250 мкл бездетергентного буфера с низким содержанием соли (LSB) (Дополнительная таблица 1). Это даёт итоговую концентрацию липидов 10 мг/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Был выбран буфер на основе ионов калия, потому что Задача 2 — это канал калиевых ионов
    2. После повторного суспензирования липида равномерно разделите липид на четыре стеклянные трубки и соникуйте суспензии до тех пор, пока они не станут прозрачными и прозрачными, что указывает на успешное формирование липосом (примерно 1,5 часа). Выполняйте звуковую обработку с амплитудой 60%, используя цикл 4 с включением и 6 секунд выключения.
    3. Сконцентрируйте очищенный липидный раствор и аквотуйте 1,5 мл в отдельные микроцентрифугные трубки. Немедленно промыть промежуточный просек каждой трубки азотным газом и хранить при -80 °C до использования.

2. Чрезмерная экспрессия и очистка MSP

  1. Прокариотическая экспрессия MSP
    1. Трансформация плазмиды: используйте плазмиду MSP1D1 с меткой 7×His для трансформации клеток, способных к E. coli BL21 (DE3). Переместить преобразующую смесь на агарные пластины Лурия-Бертани (LB), содержащие канамицин (50 мкг/мл), и инкубировать в течение ночи при 37 °C, чтобы получить отдельные колонии.
    2. Амплификация культуры: выберите один клон, инокулируйте его в 5 мл среды LB с канамицином и инкубировать ночью при 37 °C с встряхиванием. Инокулировать ночную культуру в жидкую LB-среду в соотношении 1:100, затем выращивать при 37 °C с встряхиванием до достижения оптической плотности при 600 нм (OD 600) до 2,0–3,0.
    3. Индукция экспрессии белка: индуцировать экспрессию MSP путём добавления изопропил β-d-1-тиогалактопиранозида (IPTG) к конечной концентрации 0,5–1 мМ. Продолжайте культивировать клетки при 16 °C в течение 16–20 часов с встряхиванием.
  2. Разрушение клеток
    1. Сбор гранул: центрифугировать бактериальную культуру при 4 °C в течение 10 минут. Отбросьте супернатант и оставьте клеточную гранулу.
    2. Лизис бактерий: Ресуспензировать гранулу, полученную из 1 л культуры, в 100–150 мл буфера Лизиса (Дополнительная таблица 1). Тщательно гомогенизируйте до достижения равномерного подвешения без видимых комков. Добавьте PMSF в подвеску, чтобы подавить протеазы и уменьшить пенение.
    3. Соникация: используйте охлаждаемый ультразвуковой клеточный дезруптор для уничтожения бактерий. Установите мощность на 35 % и задействуйте циклы по 3 с импульсами, за которыми следуют 6 с пауз. Чтобы избежать перегрева, позволяйте делать 2-минутный интервал отдыха после каждых 15 минут совокупного звукового времени. Продолжайте, пока лизат не станет прозрачным и светло-коричневым.
    4. Уточнение: центрифугуйте лизат при 30 000 г в течение 45 минут при 4 °C и соберите супернатант для последующих этапов.
  3. Очистка MSP
    1. Подготовка смолы Ni-NTA: возьмите 3–5 мл смолы Ni-NTA и уместите её в гравитационную колонну (размер: 26,4×134,8 мм). Промыйте смолу с 3 столбцами (CV) дистиллированной воды и уравновесьте её с помощью 3 CV буфера для промывки 1 (дополнительная таблица 1).
    2. Связывание MSP со смолой: после центрифугирования лизата клетки смешивают супернатант с уравновешенной Ni-NTA-смолой. Добавьте имидазол до конечной концентрации 5 мМ и инкубируете смесь при 4 °C в течение 2 часов с мягким вращением в темноте.
    3. Промывка для удаления примесей: последовательно промывайте с градиентами Буфера Wash Buffer 1, Wash Buffer 2 (Дополнительная таблица 1) и Wash Buffer 3 (Дополнительная таблица 1), используя не менее 50 мл каждого буфера. Следите за поглощением ультрафиолета на 280 нм (A 280) протока и продолжайте промывку, пока значениеA 280 не опустится ниже 0.01.
    4. Элюция: Элюируйте целевой белок с помощью буфера элюции (дополнительная таблица 1) и собирайте элюатные фракция. Продолжайте процесс элюирования, собирая фракции, пока уровень A₂₈₀ элюата не опустится ниже 0,01.
    5. Мониторинг и анализ процессов: Сбор образцов с ключевых этапов очистки — включая супернатанты, осадки, проточные, промывочные фракции и элюсионные частицы. Проанализируйте их с помощью SDS-PAGE для оценки эффективности очистки (дополнительный рисунок 1).
    6. Диализ для обмена буфером: Переведите скопленный элуат в диализную трубку и диализуйте его с буфером диализа (дополнительная таблица 1) при 4 °C с аккуратным перемешиванием в течение ночи.
    7. Ультрафильтрация и концентрация: концентрируйте диализованный раствор с помощью ультрафильтрационного устройства до конечной концентрации MSP 2–5 мг/мл. Очищенный и концентрированный MSP теперь готов к использованию в мембранной сборке белковых нанодисков.

3. Активация био-бусинок

  1. Взвешивание
    1. Взвесьте примерно 250 мг биошариков в центрифугу объёмом 50 мл с помощью аналитических весов.
  2. Метанольные промывки
    1. Добавьте в пробирку 25–30 мл метанола. Тщательно покрутите или закрутите смесь в темноте, затем инкубуйте 20 минут. Аккуратно выбросьте супернатант после инкубации.
    2. Повторите этот этап промывания метанола всего три раза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за летучости метанола эта процедура должна проводиться в выхлопной вытяжке с соответствующими средствами индивидуальной защиты. Собирайте использованный метанол и обрабатывайте его как биологическую жидкость.
  3. Водные промывки
    1. Добавьте 25–30 мл ddH20к бусинам. Встряхните или покрутите трубку, чтобы перемешать и инкубировать 20 минут.
    2. Отбросьте супернатант. Повторите этот этап водной промывки три раза.
  4. Равновесие с LSB
    1. Добавьте 25–30 мл безмоющего LSB в бусину. Встряхните или покрутите трубку на вращающемся столе, чтобы перемешать и инкубировать в течение 20 минут.
    2. Отбросьте супернатант. Повторите этот этап уравновесения LSB три раза, чтобы полностью кондиционировать шарики.
  5. Алицитирование и хранение
    1. Разделите активированные био-шарики поровну на три микроцентрифугных трубки по 1,5 мл. Убедитесь, что шарики остаются увлажнёнными небольшим количеством LSB.
    2. Оберните трубки алюминиевой фольгой для защиты от света и храните их на льду для немедленного использования.

4. Сборка нанодиска

  1. Подготовка липидов и MSP
    1. Уточнение липидного запаса: достайте один аликвот заранее подготовленного липидного запаса и разморозите его. Немедленно центрифугуйте трубку при 7 000 x g в течение 5 секунд при 4 °C, чтобы собрать содержимое на дне.
    2. Проводите ультразвуковое исследование в водяной бане и контролируйте прозрачность и температуру каждые 5–10 минут, чтобы предотвратить перегрев. Проведите соникацию с амплитудой 60%. Ультразвуковой анализ липидного стока, пока липидный запас не станет прозрачным и прозрачным.
    3. Размораживание MSP: Оттаять 1 аликвот подготовленного раствора MSP в ледяной водяной ванне.
  2. Подготовьте буфер в соответствии со стехиометрическим соотношением.
    1. Количественная оценка мембранного белка: Выделить очищенный мембранный белок (Задача 2), растворённый в 0,025% DDM/0,005% CHS, с помощью хроматографии с исключением размера (SEC). Ввести объём образца 500 мкл при расходе 0,5 мл/мин на колонку Superose 6 Increase (Cytiva). Соберите пиковое элюирование на 14,8 мл и сконцентрируйте его (рисунок 1). Определите концентрацию белка с помощью NanoDrop.
    2. Вычислите молярное количество белка: вычислите молярное количество (n) белка мишени по формуле: n = C × V, где C — молярная концентрация, а V — объём.
    3. Определить объемы MSP и липидных объёмов: рассчитать требуемые объемы растворов MSP и липидных запасов на основе молярного стехиометрического отношения целевой белка : MSP : липид = 1 : 5 : 250.
    4. Подготовьте мастер-микс: На основе результатов расчёта комбинируйте соответствующие объемы липидов и MSP для подготовки мастер-микса на 300 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что в эту смесь есть моющее средство, чтобы поддерживать концентрацию, соответствующую белковому раствору, тем самым предотвращая преждевременную агрегацию.
  3. Удаление моющего средства и сборка нанодисков
    1. Начальная инкубация с Reconstitution Mix: Инкубировать подготовленный буфер (дополнительная таблица 1) на льду в течение 10 минут. Затем медленно добавьте 50 мкл смеси в концентрированный белковый раствор, аккуратно перемешайте с помощью пипетирования для обеспечения однородности.
    2. Уравновесение белко-липидной смеси: Поместите смешанную смесь на лёд на 1 час. Аккуратно переворачивайте трубку каждые 15 минут, чтобы тщательно перемешивать.
    3. Первая инкубация с помощью биошариков: кратко центрифугайте смесь при 7 000 x г в течение 5 секунд при 4 °C, чтобы собрать белковый раствор на дне пробирки. Возьмите один аликвот предварительно активированных био-бусин, аспирируйте остаточный LSB, добавьте белковый раствор в шарики и инкубируете с вращением в темноте в течение 1 часа, чтобы предотвратить светоиндуцированное разрушение целевого белка.
    4. Вторая инкубация с биошариками: центрифугуйте смесь при 7 000 x г в течение 5 секунд при 4 °C и аккуратно перенесите супернатант во второй аликвот био-бусинок (из которых также был аспирирован LSB) и хорошо перемешайте мягким инверсией в темноте в течение 4–8 часов или ночью.
    5. Финальная инкубация с помощью био-бусин: После ночной инкубации извлечете раствор белка, кратковременно центрифугуйте его и перенесите супернатант в третью и последнюю часть предварительно активированных био-бусин. Инкубировать с вращением при 4 °C в темноте в течение 1 часа.
    6. После короткой центрифугирования перенесите супернатант в чистую трубку микроцентрифуги и центрифугуйте при 17 000 г при 4 °C на 10 минут, чтобы удалить заполнители.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Утилизировать использованные био-бусины как биологические отходы.
    7. Очистка нанодисков: очистка нанодисков-комплексов Task2 с помощью хроматографии с исключением размера (SEC): введите объём образца объемом 500 мкл при расходе 0,5 мл/мин в колонку Superose 6 Increase и собирайте пиковое элюирование на 15 мл (рисунок 2).
    8. Концентрация конечного продукта: Объедините пиковые доли от элюции SEC и концентрируйте их в итоговую нанодисковую концентрацию Task2 1,2–1,5 мг/мл, подходящую для подготовки образцов крио-ЭМ.

5. Проверьте успешность сборки нанодиска

  1. Анализ SDS-PAGE: образцы аликвота из фракций, очищенных SEC.
    1. Проанализируйте образцы с использованием 12% SDS-PAGE для подтверждения наличия ключевых компонентов (например, MSP и белка мембраны), что указывает на успешную сборку нанодиска (рисунок 3).
  2. Подготовка и анализ образцов крио-ЭМ.
    1. Сконцентрировать успешно собранный образец до конечной концентрации 1,2–1,5 мг/мл для подготовки образца крио-ЭМ.
    2. Начните с центрифугирования образца при 17 000 x g и 4 °C в течение 10 минут. Нанесите каплю объемом 3 мкл на свежесветившуюся золотую сетку Quantifoil R1.2/1.3 (сетка 300, отверстие углерод).
    3. Инкубировать при 4 °C при 100% влажности в течение 5 секунд. Замыкайте сетку на 4 секунды в Vitrobot Mark IV и заморозьте жидкий этан, поддерживаемый при температуре жидкого азота.
    4. Собирайте сверхразрешённые стеки фильмов с помощью программного обеспечения EPU на крио-EM Titan Krios G4 с нагружением 300 кВ и оснащённом детектором прямых электронов Falcon G4i.
    5. Установите время экспозиции на 2,78 с, что соответствует размеру пикселя 0,73 Å (165k ×) и общей накопленной дозе примерно 50 e⁻/Å2 на каждый стек фильма EER.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Успешная подготовка липидного запаса подтверждалась образованием прозрачного, прозрачного раствора после соникации. Для MSP хроматография с никелевой аффинностью дала продукт высокой чистоты примерно 3 мг/мл. Сборка нанодисков была подтверждена SEC, которая показала характерный профиль элюции (рисунок 2). По сравнению с профилем SEC Task2, полученным до сборки нанодиска (см. рисунок 1), пик белка смещается на более высокий объём элюции (позже элюция) после с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метод представлен для восстановления мембранных белков, растворённых в детергенте, в нанодиски посредством удаления детергента, что обеспечивает более естественную липидную двуслойную среду. Успех этого процесса сборки зависит от нескольких ключевых факторов. Главным из них является точное стехиометрическое соотношение между мембранным белком, MSP, и липидами. Неправильные стехиометрические соотношения могут привести к агрегации белков или неуспешной сборке. Например, первая попытка собр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликтов интересов, которые нужно раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят сотрудников Центра крио-ЭМ при Университете Хэнань, а также профессора Вэй Вана за их экспертную поддержку. Финансирование предоставлялось Национальным фондом естественных наук Китая (гранты 32371261 B.L. и 32301011 R.Z.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Био-бусиныБио-радиация1523920
ХолестерилгемисукцинатAnatraceCH210
ХлороформСинорагентИспользование в вытяжке
КРУТОAvanti850725P
МетанолСинорагент
n-Додецил-бета-D-мальтозидAnatraceD310
n-пентанАдамасИспользование в вытяжке
POPCAvanti850457P
POPSAvanti840034P
SECБио-радиацияСледуйте протоколу производителя для правильного использования
Трубка для диализа SnakeSkinТермо68011
Superose  6 Увеличение 10/300 GLЦитива29091596
Ультрафильтрационные спин-колонки Amicon Ultra-15МиллипорUFC905008

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rask-Andersen, M., Almén, M. S., Schiöth, H. B. Trends in the exploitation of novel drug targets. Nat. Rev. Drug Discov. 10 (8), 579-590 (2011).
  2. Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
  3. Dodd, R., Schofield, D. J., Wilkinson, T., Britton, Z. T. Generating therapeutic monoclonal antibodies to complex multi-spanning membrane targets: overcoming the antigen challenge and enabling discovery strategies. Methods. 180, 111-126 (2020).
  4. Hutchings, C. J., Colussi, P., Clark, T. G. Ion channels as therapeutic antibody targets. MAbs. 11 (2), 265-296 (2019).
  5. Kotov, V., et al. High-throughput stability screening for detergent-solubilized membrane proteins. Sci. Rep. 9 (1), 10379(2019).
  6. Barrera, N. P., Zhou, M., Robinson, C. V. The role of lipids in defining membrane protein interactions: insights from mass spectrometry. Trends Cell Biol. 23 (1), 1-8 (2013).
  7. Bayburt, T., Grinkova, Y., Sligar, S. G. Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Nano Lett. 2 (8), 853-856 (2002).
  8. Carlson, J. W., Jonas, A., Sligar, S. G. Imaging and manipulation of high-density lipoproteins. Biophys. J. 73 (3), 1184-1189 (1997).
  9. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Self-assembly of single integral membrane proteins into soluble nanoscale phospholipid bilayers. Protein Sci. 12 (11), 2476-2481 (2003).
  10. Vinogradova, O. Nanodiscs and solution nuclear magnetic resonance. Curr. Opin. Struct. Biol. 93, 103067(2025).
  11. Popot, J. L. Amphipols, nanodiscs, and fluorinated surfactants: three nonconventional approaches to studying membrane proteins in aqueous solutions. Annu. Rev. Biochem. 79, 737-775 (2010).
  12. Li, S. Detergents and alternatives in cryo-EM studies of membrane proteins. Acta Biochim. Biophys. Sin. 54 (8), 1049-1056 (2022).
  13. Vilela, F., Sauvanet, C., Bezault, A., Volkmann, N., Hanein, D. Optimizing transmembrane protein assemblies in nanodiscs for structural studies: a comprehensive manual. Bio Protoc. 14 (21), e5099(2024).
  14. Efremov, R. G., Gatsogiannis, C., Raunser, S. Lipid nanodiscs as a tool for high-resolution structure determination of membrane proteins by single-particle cryo-EM. Methods Enzymol. 594, 1-30 (2017).
  15. Grant, A. J., Schmidt-Krey, I. Nanodisc-reconstitution for single particle cryo-EM structure determination of membrane proteins. Curr. Opin. Struct. Biol. 93, 103072(2025).
  16. Yokogawa, M., Fukuda, M., Osawa, M. Nanodiscs for structural biology in a membranous environment. Chem. Pharm. Bull. 67 (4), 321-326 (2019).
  17. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nat. Struct. Mol. Biol. 23 (6), 481-486 (2016).
  18. Enyedi, P., Czirják, G. Molecular background of leak K+ currents: two-pore domain potassium channels. Physiol. Rev. 90 (2), 559-605 (2010).
  19. Reyes, R., et al. Cloning and expression of a novel pH-sensitive two pore domain K+ channel from human kidney. J. Biol. Chem. 273 (47), 30863-30869 (1998).
  20. Notti, R. Q., Walz, T. Native-like environments afford novel mechanistic insights into membrane proteins. Trends Biochem. Sci. 47 (7), 561-569 (2022).
  21. Pocanschi, C. L., Kleinschmidt, J. H. The thermodynamic stability of membrane proteins in micelles and lipid bilayers investigated with the ferrichrom receptor FhuA. J. Membr. Biol. 255 (4-5), 485-502 (2022).
  22. Hiotis, G., Notti, R. Q., Bao, H., Walz, T. Nanodiscs remain indispensable for cryo-EM studies of membrane proteins. Curr. Opin. Struct. Biol. 92, 103042(2025).
  23. Nakao, K., et al. Home is where the lipids are: a comparison of MSP and DDDG nanodiscs for membrane protein research. Soft Matter. 21 (33), 6596-6602 (2025).
  24. Dalal, V., et al. Lipid nanodisc scaffold and size alter the structure of a pentameric ligand-gated ion channel. Nat. Commun. 15 (1), 25(2024).
  25. Knowles, T. J., et al. Membrane proteins solubilized intact in lipid containing nanoparticles bounded by styrene maleic acid copolymer. J. Am. Chem. Soc. 131 (22), 7484-7485 (2009).
  26. Tao, X., Zhao, C., MacKinnon, R. Membrane protein isolation and structure determination in cell-derived membrane vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 120 (18), e2302325120(2023).
  27. Zhang, S., et al. One-step construction of circularized nanodiscs using SpyCatcher-SpyTag. Nat. Commun. 12 (1), 5451(2021).
  28. Ren, Q., et al. DeFrND: detergent-free reconstitution into native nanodiscs with designer membrane scaffold peptides. Nat. Commun. 16 (1), 7973(2025).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Task2SDS PAGE

Похожие статьи