Fructus xanthii Экстракт облегчает остеоартрит, сохраняя целостность хряща

Краткое содержание

Этот протокол исследования был разработан для систематического изучения потенциальных хондропротекторных эффектов экстракта Fructus Xanthii при остеоартрите с помощью интегрированного мультиомического анализа и экспериментов in vivo .

Аннотация

Остеоартрит (ОА) — это прогрессирующее дегенеративное заболевание суставов, при котором современные фармакологические и хирургические вмешательства в основном облегчают симптомы, а не обращают всплошные патологические изменения, что подчёркивает острую потребность в новых терапевтических препаратах. Этот протокол был направлен на изучение потенциальных хондропротекторных эффектов экстракта Fructus Xanthii против остеоартрита. Во-первых, нетаргетное профилирование метаболомики проводилось с использованием сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с высокоразрешающей тандемной масс-спектрометрией (UHPLC-HRMS/MS) для характеристики химических компонентов экстракта. Затем была применена интегрированная стратегия, объединяющая сетевую фармакологию и транскриптомический майнинг для выявления биоактивных компонентов и предполагаемых мишеней экстракта, после чего последовал перекрёстный анализ с дисрегулированными генами, связанными с ОА, для получения основных целевых генов. Были проведены анализы обогащения генной онтологии (GO) и Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG) для аннотирования основных биологических процессов и сигнальных путей, модулируемых экстрактом. Для валидации in vivo были использованы модели повреждения хряща у данио-рерио и OA-модели мышей для оценки хондропротекторных эффектов экстракта. Для анализа транскриптомических изменений в хондроцитах после лечения было дополнительно внедрено секвенирование РНК (РНК-секвенирование), с акцентом на пути, ассоциированные с ОА, и профили экспрессии генов; Впоследствии был проведён ферментно-связанный иммуносорбентный анализ (ELISA) для проверки уровней экспрессии ключевых белков/рецепторов, скринингируемых с помощью RNA-seq, с целью дополнительного подтверждения регуляторных эффектов экстракта Fructus Xanthii на основные мишени ОА. Этот интегрированный мультиомический и экспериментальный протокол обеспечивает систематический подход к изучению потенциала экстракта Fructus Xanthii как перспективного ботанического кандидата для вмешательства при ОА.

Введение

Остеоартрит (ОА) — это дегенеративное заболевание суставов, характеризующееся прогрессирующей деградацией суставного хряща, субхондрального костного склероза, воспаления синовиума и формированием^{остеофитов 1}. Согласно исследованию Global Burden of Disease (GBD), распространённость ОА стабильно увеличивалась в 204 странах и территориях с 1990 по 2020^годы, и ожидается, что эта тенденция будет ускоряться вместе с глобальным^{демографическим старением 3}. Текущие оценки показывают, что более 250 миллионов человек по всему миру затронуты, что создаёт значительную нагрузку на благополучие, системы здравоохранения и социально-экономические^{структуры 4}. Современные методы лечения преимущественно направлены на облегчение симптомов, при этом наиболее распространёнными методами являются нестероидные противовоспалительные препараты (НПВС) и внутрисуставная вискодобавка гиалуроновой кислотой (HA). Однако эти подходы приносят ограниченную клиническую пользу и связаны со значительными побочными^{эффектами 5,6}. Это подчёркивает критическую необходимость эффективных препаратов, модифицирующих заболевания от остеоартрита (DMOADs).

Традиционная китайская медицина (ТКМ) давно используется в лечении ОА, основанная на концепции «костного би» — подтипа «би-синдрома^»7. В этом контексте патогенез ОА объясняется преимущественно дефицитом эссенции печени и почек, недостаточностью ци и крови, а также последующим прониклением ветра, холода и^{сырости 8}. Соответственно, терапевтические стратегии направлены на устранение ветровой влажности, рассеивание холода и разблокирование^{последствий 9}. Лечение ТКМ известно своими многоцелевыми эффектами, благоприятным профилем побочных эффектов и клинически значимой^{эффективностью 10}. Заметные формулы, такие как капсула Buqi Tongluo (BQTL) и отвар Fuzi (FZD), показали явный анти-ОА эффект в клинической практике, тогда как Du Huo Ji Sheng Tang (DHJST) облегчает симптомы ОА, подавляя путь инфламасомы NLRP3, что подтверждается многовековым эмпирическим применением. Аналогично, смесь Shenjinhuoxue (SHM) смягчает боль и дегенерацию хряща за счёт снижения активности провоспалительных медиаторов, таких как IL-1β и TNF-α 11,12,13. На уровне мономера сообщается, что такие соединения, как икарин (цианозид A, CyA) и эрианин, получаемые из лекарственных растений, способствуют пролиферации хондроцитов, ингибируют воспалительный выброс цитокинов и поддерживают гомеостаз^{суставов 14,15}. В совокупности ТКМ предлагает комплексный терапевтический подход с противовоспалительными, хондропротекторными и облегчающими симптомами свойствами. Однако сложность его механизмов и вопросы, связанные со стандартизацией, требуют постоянных и тщательных исследований.

Сушеные спелые плоды Fructus Xanthii (Compositae), известные как «Цан-эр-Цзы», задокументированы как обладающие широким спектром фармакологических эффектов, включая антимикробные, противовоспалительные и антиоксидантные, обезболивающие, противонеопластические и иммуномодуляторые^{эффекты 16}. Феноловые кислоты, выделенные из Fructus Xanthii, эффективно снижают синовиальную гиперплазия при ревматоидном артрите (РА)¹⁷. Среди них хлорогеновая кислота (CGA), представительный производный кофеоилхиновой кислоты, была обнаружена способностью стимулировать пролиферацию и дифференцировку остеобластов, одновременно ингибируя остеокластогенез, опосредованный RANKL, тем самым сохраняя скелетный^{гомеостаз 18}. Другие феноловые кислоты, обнаруженные в том же экстракте, такие как неохлорогенная кислота (5-CQA), криптохлорогеновая кислота (CCA) и протокатехуиновая кислота, также обладают антимикробными, противовоспалительными, противоопухоловыми и антиоксидантными^{свойствами} 19,20,21. Помимо фенольных кислот, различные вторичные метаболиты, присутствующие в Цан-Эр-Цзы, участвуют в этих^{биоактивностях} 16,20,22,23,24,25. Однако точная роль и механизмы экстракта Fructus Xanthii в ОА остаются в значительной степени неизученными.

Нецелевая жидкостная хроматография-тандемная масс-спектрометрия (LC-MS/MS) Метаболомика характеризуется отсутствием гипотез, высокой пропускной способностью и глобальным покрытием. Она позволяет одновременно обнаруживать тысячи метаболитных особенностей, обеспечивая панорамный обзор метаболических сетей и систематически открывать новые биомаркеры и аномрантные метаболические пути без предварительной спецификации цели^26,27. В сочетании с высокоразрешающей масс-спектрометрией этот подход подходит для всестороннего анализа различных биологических образцов (например, сыворотки, синовиальной жидкости, мочи, хрящевой ткани и др.) и демонстрирует значительные преимущества в исследованиях остеоартрита (ОА). С одной стороны, он может всесторонне скрининговать дифференциальные метаболиты, тесно связанные с патологическим прогрессированием ОА (например, различные классы метаболитов, выявленные в синовиальной жидкости и синовиальной ткани), и сопоставлять их с ключевыми путями, включая энергетический метаболизм, восстановление хряща, остеогенез и липидный метаболизм, тем самым углубляя понимание патогенеза ОА. С другой стороны, интеграция мультиомических данных, таких как транскриптомика и протеомика, помогает выявить роль метаболического перепрограммирования в дегенерации хряща, воспалительных реакциях и повреждении структуры суставов, предоставляя критические доказательства для раннего выявления диагностических биомаркеров, оценки прогрессирования заболевания и разработки целевых стратегий метаболического вмешательства (например, регуляции метаболизма желчных кислот, триптофана или жирных кислот), подчёркивая их трансляционный потенциал в исследования по точному типизированию ОА и персонализированному лечению.

Данио-рерио служит отличным модельным организмом благодаря множеству преимуществ: её геном отличается от генома человека, разделяя гомологию примерно с 70% генов, кодирующих белки^{человека (28,29}). Он обладает ключевыми характеристиками, включая быстрое развитие, экстракорпоральное оплодотворение, прозрачные эмбрионы для удобной in vivo визуализации, высокую плодовитость и низкие затраты на обслуживание^{30, 31, 32, 33.} В исследованиях скелета данио позволяет чётко визуализировать формирование костей, процессы минерализации и способность к регенерации, а также может использоваться для моделирования патологических состояний, таких как остеопороз и повреждение хряща. Однако в изучении остеоартрита (ОА) — сложного заболевания целого сустава, характеризующегося дегенерацией суставного хряща, воспалениями синовиализма и субхондральными изменениями костей, применение модели данио-рерио остаётся относительно ограниченным.

В этой статье представлен протокол, который интегрирует нецеленаправленную метаболомику на основе UHPLC-HRMS/MS, сетевую фармакологию, транскриптомическое майнингование и экспериментальную валидацию in vivo для изучения потенциала экстракта Xanthium sibiricum как жизнеспособного кандидата в растение для вмешательства в ОА. Цель заключается не только в выявлении биоактивных компонентов, потенциальных мишеней и основных регуляторных путей экстракта Xanthium sibiricum, связанных с ОА, посредством мультиомиксовой интеграции и вычислительного анализа, но и подтверждение его хондропротекторного эффекта на ОА с помощью in vivo моделей и дальнейшее уточнение регуляторного механизма на транскриптоме хондроцитов.

Протокол

Все эксперименты с использованием клинических образцов и мышей проводились в соответствии с протоколом, утверждённым Комитетом по этическому обзору Шаньдунского медицинского биотехнологического исследовательского центра. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Выделение и культура суставных хондроцитов человека

Образцы человеческого суставного хряща были получены у пациентов, проходящих артроскопическую операцию или тотальную артропластику суставов в Первой аффилированной больнице Первого медицинского университета Шаньдуна. Срезы хряща транспортировались в лабораторию на льду в течение 30 минут после хирургического удаления. Ткань была тщательно промыта ледяной физиологической жидкостью Dulbecco, буферированной фосфатом (DPBS; 3–5 промывки), затем мелко измельчена до фрагментов размером примерно 1^{мм 3} с помощью стерильных хирургических ножниц. Проводилось последовательное ферментное переваривание, начиная с предварительного переваривания с использованием 0,25% трипсина-ЭДТА в течение 30 минут при 37 °C. Процесс пищеварения контролировался до тех пор, пока фрагменты хряща не стали истончеными, уменьшенными в размере и полупрозрачными, после чего фрагменты хряща собирались центрифугированием (200 × г, 5 мин) при комнатной температуре. За этим последовало ночное пищеварение (8 ч, 37 °C) с 0,2% коллагеназой типа II при непрерывном мягком перемешивании. Процесс пищеварения контролировался до полного растворения всех макроскопически видимых фрагментов хряща. Выпущенные клетки были собраны центрифугированием (200 × г, 5 мин) при комнатной температуре, повторно суспензированы в полном DMEM с добавлением 10% сыворотки плода бычьего скота, 100 U/mL пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, а также посеяны в культурные колбы размером 75^см² . Клетки содержались при 37 °C в увлажнённой атмосфере с содержанием 5%_CO2. Адгезентные хондроциты отделялись с помощью 0,25% трипсина-ЭДТА, а клетки субкультивировались в соотношении 1:3, когда приклеенные клетки достигали 80% слияния с поверхностью колбы культуры.

2. Приготовление экстракта Fructus Xanthii

Сушёные спелые плоды Xanthium strumarium L. (Fructus Xanthii) были собраны из природных популяций Северного Китая и подтверждены старшим фармакогностистом. Образец был помещён в гербарий Первого медицинского университета Шаньдуна. 20 г мелкопорошкового Fructus Xanthii были помещены в экстракционный наперсток, а исчерпывающая экстракция Soxhlet проводилась с использованием 95% этанола (примерно 250 мл) до завершения семи-восьми циклов сифона. Этаноловый экстракт фильтровался, а фильтрат концентрировался до сухости под пониженным давлением при 45 °C с помощью ротационного испарителя. Полученный остаток ресуспензировался в 60 мл двойной дистиллированной воды и последовательно разделялся с 60 мл этилацетата в сепаративной воронке. Смесь была энергично встряхивана и даётся пройти фазовое разделение при 4 °C в течение 24 часов. Водный слой затем собирался, лиофилизировался и хранился при −80 °C до дальнейшего использования.

3. Стандартизированный рабочий процесс для нецеленаправленной метаболомики LC-MS/MS

1. UHPLC-HRMS/MS на основе нецелевого анализа метаболомики
   Нецеленаправленное метаболомное профилирование проводилось на платформе сверхвысокопроизводительной жидкостной хроматографии и высокоразрешающей тандемной масс-спектрометрии (UHPLC-HRMS/MS). Метаболиты быстро закаливались и экстракцировались с помощью охлаждённой системы метанола-вода. Хроматографическое разделение осуществлялось на системе UHPLC, оснащённой хроматографической колонкой C18/T3 (100 × 2,1 мм, 1,8 мкм), поддерживаемой при температуре 40 °C. Бинарный градиент (0–28 мин), состоящий из 0,1% муравьиной кислоты в воде (A) и 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле (B), применялся при расходе 0,3 мл/мин. Масс-спектрометрическое обнаружение проводилось на гибридном квадрупольном приборе Orbitrap, работевшем в режиме полного MS/data-зависимого MS2 (Full MS/dd-MS2) с полным диапазоном сканирования от m/z 70 до 1 050 и разрешением 120 000 (FWHM при m/z 200). Фрагментация коллизионной диссоциации с высокой энергией (HCD) проводилась при 20, 40 и 60 эВ, при этом динамическое исключение было установлено на 10 с.
2. Сырые данные конвертировались в формат mzXML с помощью ProteoWizard. Пиковый набор, выравнивание времени удержания и деизотопирование выполнялись на XCMS Online с использованием параметров, оптимизированных для HRMS (ppm = 5, bw = 5, snthresh = 6). Объекты, содержащие более 50% отсутствующих значений по образцам, были исключены, а оставшиеся пиковые зоны нормализовались до общего ионного тока (TIC). Метаболиты были аннотированы путём сопоставления точной массы, спектров MS2 и времени удержания с внутренней справочной библиотекой с использованием массовой ошибки ≤ 5 ppm и порога балла по точечному произведению ≥80.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении всего рабочего процесса соблюдались строгие стандартные операционные процедуры. Образцы сразу после сбора замораживались в жидком азоте (−80 °C), транспортировались с помощью цепи сухого льда и обрабатывались с помощью рандомизированной экстракции, инъекции и пакетирования. Объединённые образцы контроля качества (QC) вставлялись после каждых 10 образцов для мониторинга дрейфа инструмента.

4. Анализ фармакологии в сети

1. Сетевой фармакологический скрининг активных соединений и прогнозирование целей
   Активные ингредиенты Fructus Xanthii были извлечены из баз данных TCMID (https://www.tcmsp-e.com/tcmspsearch.php) и HERB (http://herb.ac.cn/). Полученные соединения были отфильтрованы согласно рекомендованным порогам биодоступности пероральной АДМЕ ≥30% и похождости на препарат ≥0,18. Прогнозируемые человеческие цели квалифицированных соединений были получены из двух баз данных. Результаты скрининга были собраны и сопоставлены, что позволило выявить 15 активных соединений и 151 уникальную белковую мишень, связанную с Fructus Xanthii.
2. Интеграция транскриптомических данных и идентификация основных целей с ОА
   Дифференцированно экспрессированные гены (DEG) в хрящевых тканях между нормальными и остеоартритными (OA) образцами были извлечены из баз данных GEO GSE51588 (n = 5 нормальных, 6 OA) и GSE169077 (n = 10 нормальных, 40 OA) с помощью веб-инструмента GEO2R (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r). Гены с повышенной регуляцией OA были определены с использованием критериев логарифмического изменения fold >0,5 и скорректированного p-значения <0,05. Пересечение генов, повышенных OA, и 151 белковой мишени Fructus Xanthii было визуализировано с помощью пакета R ggvenn. Сети взаимодействия белков и белков (PPI) целей пересечения были построены с использованием базы данных STRING (https://string-db.org/). Данные сети PPI импортировались в Cytoscape, а топ-10 генов хаба были отбраны для последующего функционального анализа с помощью плагина CytoHubba с алгоритмом MCC.

5. Определение максимальной допустимой концентрации (MTC) у данио-рерио.

Трансгенные личинки данио-рерио (Tg col2a1a:EGFP) через 2 дня после оплодотворения (2 dpf) случайным образом распределялись по пластинам с 6 лунками при плотности 30 личинок на колодцу. Каждая скважина дополнялась 3 мл экспозиционной среды, содержащей серийно разбавленный экстракт Fructus Xanthii . Умирающие или умершие личинки удалялись ежедневно. Личинки подвергались непрерывному воздействию при 28 °C в течение 72 часов, после чего была определена максимальная допустимая концентрация (MTC) как самая высокая, при которой гибель личинок не превышает 10%.

6. Создание модели повреждения костей у данио-рерио.

Tg col2a1a:EGFP личинки данио-рерио, спустя 2 дня после оплодотворения (2 dpf), были распределены к четырём группам: контрольная, модельная, контрольная положительная к хондроитин сульфату (CS) и обработка экстрактом Fructus Xanthii . Все группы, кроме контрольной группы, подвергались воздействию Staphylococcus aureus (OD600 = 0,8, 1 × 10⁸ CFU/mL) в течение 24 часов для индуцирования повреждения костей. Успешное создание модели было подтверждено снижением интенсивности зелёной флуоресценции, специфичной для хряща, в краниофациальной области по сравнению с контрольной группой под эпифлуоресцентным микроскопом.

7. Количественная оценка хрящово-специфической флуоресценции у личинок данио-рерио.

Личинки подвергались непрерывному воздействию градированных концентраций экстракта Fructus Xanthii или 1 000 мкг/мл хондроитин сульфата натрия (положительный контроль) при 28 °C в течение 72 часов. Впоследствии случайным образом выбирались 10 личинок из каждой 6-колодцевой реплицы (n = 30 на группу). Отобранные личинки были анестезиированы с использованием 0,016% трикаина и размещены латерально на 1% низкоплавящих агарозных подушечках. Флуоресцентные изображения были получены при увеличении 2× (возбуждение 488 нм, излучение 525/50 нм) с помощью стереомикроскопа с флуоресцентной камерой. Специфическая интенсивность EGFP в краниофациальной области, включая цератогиальный и хрящ Меккеля, была количественно измерена с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Была проведена коррекция фона на интегрированных значениях плотности, а скорректированные значения нормализованы до контрольной группы для статистического анализа эффективности хондропротектора.

8. Индукция OA у мышей C57BL/6J

Самцы мышей C57BL/6J (6–8 недель, вес 20–22 г) содержались в специфических условиях без патогенов (SPF) при 22 °C ± 2 °C с циклом 12 часов свет/темнота. Мышам позволили акклиматизироваться в течение одной недели, после чего их случайным образом разделили на три группы (n = 8 на группу) с помощью таблицы случайных чисел: (1) контрольная схема, (2) вызванная ACLT ОА (ACLT), и (3) вмешательство ACLT плюс экстракт Fructus Xanthii (ACLT + экстракт Fructus Xanthii ). Все хирургические процедуры проводились в стерильных условиях в соответствии с ранее подтверждённым протоколом.

Мыши были анестезиированы внутрибрюшническим пентобарбиталам натрия (50 мг/кг) (согласно утверждённым институционально протоколами), а медиальный парапателлярный разрез был обнажен для обнажения капсулы правого коленного сустава. Передняя крестообразная связка была перерезана под операционным микроскопом для индуцирования нестабильности суставов, после чего капсула сустава и кожа были закрыты слоями с помощью 6-0 всыпающихся швов. Мыши, оперируемые имитацией, проходили идентичные процедуры артротомии без пересечения связок. Была оценена стабильность сустава, а успешное создание модели подтверждено с помощью теста в ящике или степени повреждения суставов в гистологических срезах мышей модельной группы.

Послеоперационная анальгезия с бупренорфином (0,1 мг/кг, подкожная инъекция) проводилась в течение трёх последовательных дней. Препараты для лечения вводились один раз в день с помощью гаважа. Группа экстракта ACLT + Fructus Xanthii получила 100 мкл экстракта Fructus Xanthii с концентрацией 1000 мкг/мл в обычном физиологическом растворе, тогда как две другие группы получили 100 мкл нормального физиологического раствора в качестве контроля транспортного средства. Через 8 недель после операции мыши были усыплены асфиксией_CO2 , затем шейным вывихом, а коленные суставы были взяты для гистологического анализа.

9. Гистопатологическое окрашивание

1. Гистологическая подготовка и окрашивание тканей коленного сустава
   Оперированные коленные суставы были удалены en bloc на 8-й послеоперационной неделе и фиксированы в 4% параформальдегиде (PFA) при 4 °C в течение 48 часов. Фиксированные суставы декальцифицировались в 10% этилендиаминтетрауксусной кислоте (ЭДТА; pH 7,4) в течение 14 дней, дегидрированы с помощью серии градированного этанола и добавлены в парафин. Из встроенных суставов были подготовлены последовательные сагиттальные сечения (5 мкм), а затем выполнены следующие гистологические процедуры окрашивания.
   1. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E)
      Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) проводилось для оценки общей архитектуры тканей, целостности хряща и гиперплазии синовиа.
   2. Safranin-O/Fast Green окраска
      Окрашивание Safranin-O/Fast Green проводилось для обнаружения протеогликанов внутри хрящевой ткани. Окрашенные срезы исследовались с помощью светового микроскопа с цифровой камерой, а изображения были сделаны с увеличениями 10× и 20×.
2. Полуколичественная оценка дегенерации хряща на основе OARSI
   Для полуколичественной оценки дегенерации хряща окрашенные срезы были ретроспективно переоценены и оценены в соответствии с системой оценки гистопатологии остеоартрита Международного общества остеоартрита, которая оценивает степень повреждения хряща на основе степени (0–6; степени потери хряща) и стадии (0–4; пространственное распределение повреждения) дегенерации суставного хряща.
   Для всех оценок была принята стратегия пост-хок ослепления. Все секции были сняты с идентификации за счёт удаления оригинальных групповых ярлыков и перекодированы с использованием анонимных серийных номеров. Два опытных патолога независимо оценивали разделы, не зная распределения групп. Была проведена перекрёстная валидация между двумя наборами результатов оценки. Когда разница в баллах составляла ≥1, разные разделы были совместно переоценены двумя патологами для установления консенсусного результата. Итоговые оценки консенсуса использовались для последующих статистических анализов с целью обеспечения объективности, надёжности и воспроизводимости гистопатологических результатов.

10. РНК-секвенирование (РНК-секвенирование)

Первичные суставные хондроциты человека (проходы 2–3) были посеяны в пластины с 6 лунками при плотности 5 × 10⁵ клеток на каждую скважину. Клетки подвергались сывороточному голоду в течение 24 часов, а затем распределены на две группы (n = 3 на группу): (1) Контрольная группа: клетки обрабатывались только транспортными средствами (0,1% DMSO); (2) Группа экстракта Fructus Xanthii : клетки обработаны экстрактом Fructus Xanthii с концентрацией 1000 мкг/мл, растворённым в DMSO.
Клетки обрабатывались в течение 24 часов, после чего общая РНК была извлечена с помощью реагента TRIzol согласно протоколу производителя. Целостность РНК (RIN ≥7.0) и концентрация оценивались с помощью РНК-анализатора. Цепочно-специфические библиотеки cDNA были подготовлены с помощью комплекта для подготовки библиотеки секвенирования РНК и секвенированы на высокопроизводительной платформе секвенирования следующего поколения (NGS) в режиме парного конца 150 bp (PE150). Контроль качества необработанных FASTQ-файлов осуществлялся с помощью FastQC, затем перерабатывался адаптер и обработка качества с помощью Trimmomatic перед следующим анализом.

11. Обработка данных по RNA-seq

Дифференцированно экспрессированные гены, пониженные экстрактом Fructus Xanthii (по сравнению с контрольной группой; p < 0.05 и logFC < −0.5) были извлечены из набора данных RNA-seq и пересечени с топ-10 целями хаба. Полученные основные мишени, связанные с экстрактом Fructus Xanthii и остеоартритом, визуализировались с помощью корпуса ggvenn.

12. ЭЛИЗА

Первичные суставные хондроциты человека в проходах 2–3 были посеяны в пластинах с 6 лунками при плотности 5 × 10⁵ клеток на колодцу. Клетки инкубировали в безсывороточной среде в течение 24 часов для индуцирования покоя. Клетки впоследствии были разделены на следующие три группы (n = 3 на группу):
(1) Пустой контроль: клетки обрабатывались только транспортными средствами (0,1% DMSO); (2) Положительный контроль: клеточное воспаление вызвано IL-1β, после чего лечение транспортным средством (0,1% DMSO); (3) Группа экстракта Fructus Xanthii : клеточное воспаление было вызвано IL-1β, после чего было обработано экстрактом Fructus Xanthii с концентрацией 1000 мкг/мл, растворённым в 0,1% DMSO. Супернатанты клеточной культуры собирались после 24 часов инкубации и хранили при −80 °C до использования. Уровни MMP1 и PGR в супернатантах в культуре были определены с помощью коммерчески доступных наборов иммуносуорбента с ферментами-связанными ферментами (ELISA), специфичных для MMP1 и PGR человека соответственно. Анализы проводились в соответствии с инструкциями производителя.

13. Статистический анализ

Все статистические анализы проводились с помощью программного обеспечения для статистического анализа и графиков, а данные представлялись в виде среднего ± стандартного отклонения (SD). Нормальность данных оценивалась с помощью теста Шапиро–Уилка, а гомоскедастичность — с помощью теста Левена. Межгрупповые сравнения проводились с использованием одностороннего или двустороннего анализа дисперсии (ANOVA), а затем пост-хок тестов Тукея или Шидака, по мере необходимости. Парные сравнения проводились с использованием двухстороннего t-теста Student. Непараметрические данные анализировались с помощью теста Манна–Уитни U. Двустороннее P-значение < 0,05 считалось статистически значимым.

Результаты

Оценка качества и метаболический ландшафт нецеленаправленных данных LC-MS/MS

Образцы QC продемонстрировали отличную воспроизводимость, что подтверждается сильно перекрывающимися хроматограммами TIC как в положительных, так и в отрицательных ионных режимах, при этом дрейф по времени удержания оставался менее 0,05 мин на всей аналитической партии. Исходные данные проходили предварительную обработку на базе XCMS, включая обнаружение пиков, интеграцию и выравнивание времени удержа...

Обсуждение

ОА — распространённое дегенеративное заболевание суставов и ведущая причина инвалидности во^{всем мире 36}. Его патогенез сложный и многофакторный, включающий биохимические, клеточные и молекулярные изменения в тканях суставов. Ранее считавшийся простым явлением «износа суставного хряща», ОА теперь широко признан хроническим заболеванием целых суставов, характеризующимся деградацией хряща, воспалением синовииальных веществ, образованием остеофитов и субхондральной ре...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
4% PFA	Biosharp, Китай	BL539A	pH 7.4, стерильный
Мыши C57BL/6	Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd, Китай	N/A	Самцы, 8-10 недель, 20-25г
Хондроитин сульфат	MCE, Америка	HY-B2162	Чистота ≥98%
ClusterProfiler (R Package)	Bioconductor	Свободный доступ	Интегрирован в R v4.2.2
Коллагеназ, тип II, порошок	Gibco, Америка	17101015	≥125 U/мг
Cytoscape	Cytoscape Consortium	Свободный доступ (https://cytoscape.org/)	v3.9.1 (с CytoHubba)
Cytoscape	Cytoscape Consortium	Свободный доступ	Версия 3.9.1
DESeq2 (R Package)	Bioconductor	Свободный доступ	Интегрирован в R v4.2.2
DMEM с высокой концентрацией глюкозы	Gibco, Америка	11965092	Стерильная среда
Этанол	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Китай	10009218	Аналитический градус, 95%
Этилацетат	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Китай	10009418	Аналитический градус
Фетальный бычий сывороточный альбумин (FBS)	Cellmax, Китай	SA102.02	Теплоинактивированный
Флуоресцентный микроскоп	Nikon, Япония	Eclipse Ti2-U	Оснащен фильтром GFP (возбуждение 488нм) & цифровой камерой
GEO база данных	NCBI	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r	GEO2R инструмент анализа
GraphPad Prism	GraphPad Software, LLC, Америка	Коммерческий	Версия 9.5.1
Набор для окрашивания гематоксилин-эозин (HE)	Solarbio, Китай	G1120	Готовые к использованию комплекты
HERB база данных	Китайская академия наук	http://herb.ac.cn/	V2.0
Human MMP-1 ELISA Kit	Yamei Biotechnology, Китай	HJ088	Для человека, 96-лунная пластинка
Human Progesterone Receptor (PR) ELISA Kit	Shanghai Enzyme-Linked Biotechnology Co., Ltd., Китай	ml05997	Для человека, 96-лунная пластинка
ImageJ	Национальный институт здравоохранения (NIH)	Свободный доступ	Версия 1.53t
Светлополевой микроскоп	Olympus, Япония	BX53	10×/20× объективы & цифровая камера
Лиофилизатор	Christ, Германия	Alpha 1-4 LDplus	Система лиофилизирования
Набор для окрашивания Saffron-O и Fast Green	Solarbio, Китай	G1371	Для окрашивания кости/хряща
Нейтральный бальзам	Solarbio, Китай	G8590	Монтажное средство
Пенициллин-стрептомицин	Gibco, Америка	15070063	100×, стерильный
Фосфатно-буферный раствор (PBS)	Sparkjade, Китай	CR0013-500ML	pH 7.2-7.4, стерильный
Программное обеспечение R	R Foundation for Statistical Computing	Свободный доступ (https://www.r-project.org/)	v4.4.1 (с ggvenn)
Сывороточная бесклеточная среда для замораживания клеток	Biosharp, Китай	BL203B	Стерильная
Staphylococcus aureus	American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC 25923	Стандартная штамм
STRING база данных	STRING Consortium	https://string-db.org/	Анализ взаимодействия белков
TCMID база данных	Shaanxi Qinling Qiyao Collaborative Innovation Center	https://www.tcmsp-e.com/tcmspsearch.php	V3.0
Tg(col2a1a:EGFP) Zebrafish	Zebrafish International Resource Center (ZIRC)	N/A	Личинки (2 дпф), штамм AB
TRIzol реагент	Thermo Fisher, Америка	15596018CN	Для общей экстракции РНК
Трипсин-ЭДТА (0,25%), феноло-красный	Gibco, Америка	25200056	Стерильный раствор
Ультравысокопроизводительная жидкостная хроматография (UHPLC)	Thermo Fisher, Америка	Q Exactive Focus	Совмещенный с HRMS/MS
XCMS-online	Scripps Research Institute	Свободный доступ	Веб-платформа