Bex-Plex позволяет одновременно визуализировать белковые маркеры и транскрипты рибонуклеиновой кислоты для глубокого пространственного профилирования целостных тканей

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол сочетания итеративного окрашивания белков (IBEX) с технологией гибридизации RNAscope in situ для глубокого пространственного фенотипирования целостных фиксированных замороженных тканей для высокоразрешающих пространственных профилей.

Аннотация

Здесь мы представляем протокол, позволяющий одновременно пространственное профилирование маркеров белка и рибонуклеиновой кислоты (РНК) с разрешением одной клетки в целостных тканях. Одной из основных проблем, связанных со солидными опухолями, является невозможность предсказать реакцию пациента на терапевтическое вмешательство. Для расшифровки этих сложностей требуется количественное измерение клеточного поведения, взаимодействий и фенотипов внутри целостных тканей. В частности, протеом и транскриптом предоставляют перекрывающуюся, но неизбыточную информацию, которая может быть критически важна для разработки рациональных иммунотерапевтических средств. Однако в настоящее время не существует простого и экономически эффективного способа глубоко пропрофилировать как транскрипционное, так и функциональное состояние всех клеток в микросреде опухоли, сохраняя при этом их критическую пространственную информацию о локализации. С этой целью мы успешно объединили платформу IBEX (итеративное отбеливание расширяет мультиплексность) с HiPlex RNAscope для одновременной визуализации маркеров с высоким уровнем плекса и транскриптов с высоким содержанием рибонуклеиновой кислоты (РНК) с разрешением одной клетки. Этот подход включает модифицированный этап поиска РНК-мишени для сохранения морфологии ядра и обеспечения точного выравнивания изображений по циклам. «Bex-Plex» позволяет нам выполнять немодифицированный протокол IBEX на фиксированных замороженных тканях, за которым следует протокол HiPlex RNAscope, при котором используется модифицированная РНК-мишена для обеспечения ядерного согласования с циклами IBEX. Этот протокол оптимизирован для фиксированных замороженных тканей и позволяет проводить интегрированный пространственный анализ транскрипционных и функциональных клеточных состояний. Способность профилировать на уровне одной клетки не только предоставляет глубокий источник информации о самой ткани, но и может дать возможность предсказывать тонкие клеточные взаимодействия, которые определяют терапевтическую реакцию, предоставляя основу для изучения пространственной биологии в микроокружениях опухолей и связанных с ними системах.

Введение

С момента их внедрения в 2011 году иммунотерапии рака, снижающие подавление цитотоксических Т-клеток путём блокировки ингибиторных молекул иммунных контрольных точек, таких как PDL-1 и CTLA-4, стали золотым стандартом лечения твердых^{опухолей 1}. Однако, несмотря на масштабное применение у пациентов, клиническая эффективность этих препаратов сильно варьируется, поскольку многие солидные опухолевые виды опухоли либо по сути проявляются, либо в конечном итоге формируют к ним^{устойчивость 2.} Во многих случаях это связано с крайне гетерогенной природой солидных опухолей, даже среди одного и того же рака^3-го типа. Более глубокое понимание клеточных отношений, возникающих в солидных опухолях, является ключом к улучшению методов лечения. Таким образом, определение точных механизмов и взаимодействий, которые формируют и поддерживают эту устойчивость, находится в центре внимания исследований рака. Здесь мы стремимся разработать метод, позволяющий интегрированный пространственный анализ экспрессии белков и РНК в целостных тканях для лучшей характеристики этих сложных клеточных взаимодействий.

Микросреда опухолей (ТМЭ) состоит из нераковых клеточных и структурных компонентов, формирующих рост опухоли и иммунный ответ, включая аферо-афрофильные фибробласты, инфильтрирующие иммунные клетки, сосудистые компоненты и внеклеточную^{матрицу 4}. В последнее время стало очевидно, что состав и организация ТМЭ сильно влияют на то, являются ли опухоли проницательными или устойчивыми к иммунной инфильтрации, что является одним из основных факторов, определяющих реакцию на^{иммунотерапию 5}. Во многих видах рака фенотип «иммунной пустыни», характеризующийся низким количеством Т-клеток и наличием высокоиммуносупрессивных миелоидных популяций, коррелирует с плохой реакцией на терапию блокадных точек^6,7. Сигнализация хемокина регулирует многие из этих динамик набора. Например, CXCL1 и CCL2 привлекают иммуносупрессивные миелоидные клетки, тогда как ось CXCR3-CXCL9/CXCl10 привлекает как цитотоксичные, так и регуляторные Т-клетки в^{опухоль 8}. В результате специфическая нишевая сигнальная среда может существенно влиять на фенотип и функцию клеток. Например, у пациентов с колоректальным раком ось CCL5-CCR5 контролирует подавляющую функцию макрофагов, связанных с опухолями (TAM), и блокировка этого сигнала смещает TAM в сторону антиопухологенного фенотипа и коррелирует с улучшением клинических^{ответов 9}. Кроме того, прямое взаимодействие между иммунными клетками, афрофилированными фибробластами и/или опухолевыми клетками через ICAM и PDL-1 может вызывать истощение иммунитета и ослаблять противоопухолевой^{иммунитет 10}. Вместе эти результаты подчёркивают важность пространственно разрешённых анализов для понимания того, как TME влияет на терапевтическую эффективность.

Иммунофлуоресцентная (ИФ) визуализация остаётся основополагающим подходом к визуализации экспрессии белков и взаимодействия между клетками в тканях. Эта область продвинулась от традиционных 3-4 цветных IF к высококонтентным процессам изображений, основанным на итеративном окрашивании и визуализации. В этих методах большие наборы данных генерируются посредством повторяющихся циклов маркировки антител, визуализации и инактивации или удаления флуорофоров, чтобы можно было окрашить и сфотографировать дополнительные^{маркеры 11}. Итеративное отбеливание расширяет мультиплексность (IBEX) недавно была представлена как удобная и экономичная итеративная платформа для визуализации¹². Совместимый с использованием коммерческих антител и традиционных микроскопов, IBEX использует литий-боргидрид (_{LiBH 4}) для подавления флуоресценции наиболее часто используемых красителей без повреждения эпитопов тканей, что позволяет получить до 75 параметров для одной^{ткани 13}. Изображения, полученные циклическим окрашиванием, выравниваются с помощью открытого программного обеспечения SimpleITK для создания составных наборов данных, подходящих для пространственного анализа с высокой размерностью.

Дополняя белоковое фенотипирование, пространственные транскриптомные методы могут предоставить ценную информацию о транскрипционном состоянии клеток в их естественной среде. Примечательно, что гибридизация in situ (ISH) — популярный метод идентификации локализации последовательностей ДНК или РНК в определённой^{ткани 11}. RNAscope — это хорошо зарекомендовавший себя подход ISH, который использует зонды с уникальной Z-химией для специфической амплификации транскриптов РНК с одномолекулярным разрешением и совместим со многими различными типами^{образцов 14}. Как широко принятая и коммерчески доступная платформа через Advanced Cell Diagnostics (ACD), RNAscope предлагает проверенные зонды для широкого спектра целей, упрощая проектирование экспериментов для различных применений.

Более полное представление о идентичности и функциях клеток можно получить, объединив обнаружение белков и РНК в одной ткани. Кратковременные секретируемые белки, такие как цитокины и хемокины, традиционно не подвергаются надёжному окрашиванию антител с помощью IHC, но информацию об их экспрессии можно получить с помощью количественной оценки их мРНК-транскриптов. Предыдущие попытки совместного обнаружения РНК и белка, такие как обычные хромогенные IHC или TSA-OPAL, были ограничены нелинейным усилением сигнала и трудоёмкими протоколами получения^{антигена 15}. По сравнению с этими подходами, метод Bex-Plex позволяет одновременно обнаруживать высокоплексные белки и РНК, сохраняя пространственный контекст и ядерную морфологию для точной регистрации изображений.

Здесь мы представляем «Bex-Plex» — протокол, который интегрирует платформы IBEX и RNAscope для одновременной, количественной характеристики транскрипционных и трансляционных состояний клеток внутри их нативных тканей. В Bex-Plex ткани с фиксированным ОКТ проходят стандартный протокол IBEX, за которым следует слегка модифицированный рабочий процесс RNAscope HiPlex, при котором получение цели проводится при 60°C при инкубации 1 час, по сравнению с первоначальной инкубацией при 99°C в течение 5 минут. Это сохраняет архитектуру ядер, позволяя точно выравнивать фидуциальные маркеры при регистрации отдельных изображений из циклов IF и ISH в одно. Этот протокол лучше всего подходит для исследований, требующих одновременного пространственного анализа экспрессии белков и РНК в целостных тканях, особенно когда доступность тканей ограничена или при критически важном сохранении пространственной архитектуры, например, при анализе микросреды опухолей или иммунном профилировании.

Используя широко доступные реагенты и совместимые с большинством платформ визуализации, Bex-Plex может выполняться любым технически подготовленным научным сотрудником, знакомым с флуоресцентной съёмкой и имеющим доступ к обычному микроскопу. Протокол, представленный здесь, оптимизирован для фиксированных замороженных образцов. В настоящее время протокол был проверен в фиксированных замороженных тканях, и может потребоваться дальнейшая оптимизация для применения к другим типам образцов, таким как FFPE или клинические образцы на людях.

Этот рабочий процесс будет бесценен в любых условиях, где ткани ограничены или ценны, например, биопсии тканей или эксперименты на животных с ограниченным размером выборки, а также для фенотипирования клеток, которые могут быть трудно извлечены с помощью диссоциативных методов. Bex-Plex предоставляет одновременную, количественно измеримую информацию о транскрипционных и трансляционных профилях отдельных клеток, сохраняя при этом их пространственный контекст — данные, которые уникально способны ответить на вопросы о взаимоотношениях и перекрёстном взаимодействии между клетками в их исходной среде.

Протокол

Процедуры, изложенные в этом протоколе, были утверждены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Калифорнийского университета в Сан-Диего (протокол номер S24049). Для этих экспериментов использовались самцы и самки мышей в возрасте 7–12 недель с генетическим фоном C57BL/6 и содержащиеся в специфических условиях, свободных от патогенов.

1. Подготовка тканей

1. Эвтаназия экспериментальных мышей с помощью утверждённых первичных и вторичных мер (например, эвтаназия с_CO2 и вывих шейки матки) и сбор интересующих тканей в дополненную среду.
2. Приготовьте свежий запас фиксирующего ткани, разбавляя 4% раствор параформальдегида (PFA) до 0,5% или 1% PFA в 1X PBS. Используйте 0,5% PFA для тканей с меньшим объёмом, таких как лимфатические узлы, и 1% PFA для тканей с большим объёмом, таких как опухоли...
   ВНИМАНИЕ: Параформальдегид горючий и токсичен при проглатывании или проглатении. Обращайтесь с подходящими средствами индивидуальной защиты и избегайте контакта с кожей или глазами.
3. Перенесите ткани в пластину на 24 лунки с фиксативом 2 мл на каждую скважину и инкубируемые на ночь при 4°C.
   Примечание: Время инкубации более 16 часов может привести к проблемам с перефиксацией.
4. Заполните колодцы новой пластины с 24 лунками 1X PBS и перенесите ткани с фиксирующей пластины.
   Точка паузы: При необходимости ткани можно хранить в 1X PBS при 4°C до 7 дней.
5. Убирайте лишний жир и остатки тканей по одному с помощью дискоскопа и инструментов. Добавьте небольшой объём 1X PBS непосредственно к ткани, чтобы предотвратить обезвоживание тканей во время стрижки.
6. Приготовьте 30% раствора сахарозы, разбавляя порошковый сахарозный бульон в 1X PBS.
7. Переместите ткани в пластину на 24 лунки с 2 мл сахарозы 30% в каждую скважину и инкубируем ночью при 4°C для обезвоживания. Ткани достаточно обезвожены, когда опускаются на дно колодцев.
8. Заполните маркированные криомолды ОКТ и помещайте ткани по одной в формы. Ориентация ткани зависит от происхождения, но наша стандартная рекомендация — чтобы самая большая площадь поверхности была параллельна дну криомолда. Убедитесь, что ткани полностью погружены в ОКТ.
9. Поставьте на сухой лёд на 10 минут для заморозки и храните при -80°C.

2. Сечение тканей

Примечание: Все реагенты и лабораторные материалы, используемые для этого протокола, должны быть без РНазы. Следите за предотвращением загрязнения при работе с горками.

1. Покрытие микроскопов без РНазы 15 мкл хромированного квасца и инкубировать в духовке 1 час при 60°C. Стекли с хромированным алюмом можно хранить при RT (комнатной температуре) до месяца до использования.
2. Достаньте ткани, вложенные в ОКТ, из морозильника при -80°C и поместите в криостат/криотом при -20°C для балансирования минимум на 20 минут.
3. Сечение тканей на хромированные квасцевые стекли толщиной 10–15 мкм.
4. Храните стекли с вырезанными участками при 4°C или, если окрашиваете в тот же день, дайте стеклам уравновесить до RT. Секционные стекли можно хранить при 4°C до 5 дней перед использованием.

3. Белковое окрашивание

1. В танке для макка замочите стекло для окрашивания в 1X PBS без РНазы на 5 минут, чтобы удалить избыток ОКТ из тканей.
2. Используйте гидрофобную барьерную ручку, чтобы нарисовать коробки вокруг тканей на затворе и дать высохнуть 2 минуты.
3. Приготовьте блокирующий раствор 10 мкг·мл⁻¹ противомышиного блока FC-рецептора в 1X PBS без РНаз. Добавьте блокирующий буфер к образцам на слайде, используя достаточное количество для создания пузыря, полностью покрывающего ткань (100–150 мкл·^{сечение-1}).
   Примечание: иногда требуется добавление FBS или BSA (обычно 1–2%) в блокирующий буфер для сложных тканей и/или маркеров.
4. Инкубировать стекли на RT в влажном контейнере для окрашивания 1 час, затем полностью погрузить их в бак с РНаз-безсодержащим 1X PBS на 5 минут.
5. Приготовьте раствор для окрашивания первичных антител в 1X PBS без РНаз, планируя 100-200 мкл на срез ткани. Стандартные разбавления антител варьируются от 1:50 до 1:200, но рекомендуется проводить однократные титрации для определения оптимального фактора разбавления для конкретного антитела и/или типа ткани. Вихрь и импульс вращают антитела перед пипетированием, чтобы предотвратить появление флуоресцентных агрегатов.
6. Снимите стекла из стирки и аккуратно отведите лишнюю жидкость из угла коробок с образцами с помощью впитывающей салфетки, чтобы не разбавлять раствор антител.
7. Наносите раствор антител так же, как и блокирующий, создавая пузырь на ткани.
8. Поставьте слайды горизонтально в духовку при 37°C и инкубуйте 1 час. В качестве альтернативы используйте слайды Incubate на RT 3–4 часа в влажном контейнере. Могут использоваться стандартные ИФ-протоколы, уже оптимизированные для желаемой ткани. Во время инкубации держите слайды во влажной среде, чтобы предотвратить обезвоживание. (например, используйте влажное бумажное полотенце на дне лотка для окропления).
9. Помойте стеклы, погрузив их в 1X PBS без РНазы на 2 минуты. Повторите дважды, всего три раза. При необходимости для панели для окрашивания подготовьте вторичный раствор для окрашивания антител в 1X PBS без РНазы в этот период. Стандартные разбавления антител варьируются от 1:500 до 1:1000, однако рекомендуется проводить однократное титрование для определения оптимального фактора разбавления для конкретного типа антитела и/или ткани.
10. Отведите лишние PBS с стекло с помощью абсорбирающей салфетки и добавьте 100–200 мкл вторичного раствора для окрашивания антител в каждый участок ткани. Поставьте слайды горизонтально в духовку при температуре 37°C и инкубуйте 30 минут. В качестве альтернативы стекли могут быть окрашены на RT в течение 1–2 часов в влажной коробке.
11. Помойте слайды, погрузив в 1X RNase-free PBS на 2 минуты. Повторите дважды, всего три раза.
12. Разведите ядерный краситель DAPI до конечной концентрации 0,2 мкг·мл⁻¹ в 1X PBS без РНазы и добавьте 100–200 мкл в каждый участок ткани.
13. Инкубируйте слайды в течение 10 минут на RT в влажном контейнере, затем один раз помойте, погрузив в 1X PBS без РНазы и ненадолго окунув вверх и вниз.
14. Отведите лишнюю жидкость с затворов впитывающей салфеткой и добавьте 20–30 мкл водного основания антифейдного крепления в каждую секцию. Аккуратно положите накладку на затвор, минимизируя пузырьки, и дайте монтажному материалу затвердеть 15–30 минут.
15. Представьте запятнанные слайды. Для более подробного объяснения аспектов конструкции панелей и получения изображений для IBEX см. оригинальные опубликованные протоколы^{IBEX 12,13}.
    Точка паузы: храните стекли в темноте при 4°C до 3 дней, однако рекомендуем действовать немедленно, чтобы минимизировать разрушение РНК.

4. Отбеливание флуорофором и итеративное окрашивание белков

1. Погрузите затворы в 1X PBS без РНазы, пока крышка не скользит легко без применения силы. В зависимости от того, как долго установлена накладка, это может занять до 16 часов.
2. Пока стекли замачиваются, приготовьте раствор LiBH₄ объемом 1 мг·^мл⁻1 в DI H₂O, аккуратно перемешивая до полного растворения и ждите 10 минут до активации. Активация происходит, когда в растворе присутствуют пузырьки, а активность длится до 4 часов.
   Внимание:_{LiBH 4} реактивен на воду, избегайте чрезмерного воздействия порошкового бульона влаги и правильно утилизируйте отходы.
3. Промыйте стекли один раз в течение 2 минут в 1X PBS без РНаз, чтобы удалить остатки монтажной среды, затем нанесите пипетку 100–150 мкл раствора_{LiBH 4} на каждую ткань. Инкубировать в влажной коробке 15 минут.
   Примечание: в зависимости от используемых флуорофоров для окрашивания, это время инкубации может потребовать увеличения (подробно обсуждается в статьях по методам IBEX)^12,13.
4. Помойте слайды один раз, погрузив их в 1X PBS без РНазы и ненадолго окунув вверх и вниз.
5. Переходите к окрашиванию слайдов дополнительными белковыми маркерами, следуя шагам 3.5-3.15. Не обязательно повторно окрашивать ядерный краситель, так как он не отбеливает_{LiBH 4}. При необходимости повторяйте белоковое окрашивание.
   Точка паузы: Установленные стекли можно хранить при 4°C на ночь перед отбелением последнего цикла белка/IBEX и переходом к РНК.
6. Немедленно переходите к RNAscope HiPlex после отбеливания флуорофоров из последнего цикла. Хотя было проведено до шести циклов стандартного IBEX без потери тканей или эпитопов, мы не рекомендуем превышать три цикла окрашивания белками для этого протокола из-за вероятности снижения качества транскрипта РНК за более длительный период.

5. Подготовка слайдов для RNAscope HiPlex

1. Полностью погружайте стекли в 1X PBS без РНазы, пока накладка легко не соскользнёт без применения силы. В зависимости от того, как долго установлена накладка, это может занять до 16 часов. Постирайте один раз в течение 2 минут в 1X PBS без РНазы, чтобы удалить остатки монтажной среды.
2. Приготовьте 200 мл этанола 50%, 200 мл этанола 70% и 400 мл этанола 100%.
3. Включите духовку для гибридизации и установите температуру на 60°C. Разведите реагент Target Retrieval Reagent 10X до рабочего запаса 1X в DI H_2Oбез РНазы и предварительно разогрейте, поместив его в духовку до шага 5.8.
   Примечание: Несоблюдение предварительного нагрева реагента для получения мишени до 60°C повлияет на последующей регистрации изображений из отдельных циклов. Целевой реагент для извлечения должен оставаться при температуре 60°C на протяжении всего этапа забора.
4. Окуните затворы в 50% этанола. Инкубировать 5 минут на RT.
5. Снимите стекла с 50% этанола и погрузите их в 70% этанола. Инкубировать 5 минут на RT.
6. Снимите стекли с 70% этанола и погрузите его в 100% этанол. Инкубировать 5 минут при RT и повторить с новым 100% этанолом.
7. Снимите затворы из 100% этанола и дайте высохнуть на RT 5 минут.
8. Добавьте 100–150 мкл 60°C 1X Target Retrieval Reagent в каждую тканевую секцию и поместите стекла в гибридизационную печь. Инкубировать при 60°C в течение 1 часа.
9. Снимите стекли и прополосните, погрузив их в DI H2O без РНазы на 15 секунд. В этот момент измените установленную температуру духовки на 40°C.
10. Переведите стекли на 100% этанол и инкубуйте 5 минут, затем высохите на RT минимум 5 минут.
11. Нанесите Протеазу III на стеклы, по 1–2 капли на секцию ткани. Поставьте слайды в духовку для гибридизации и инкубуйте при 40°C в течение 30 минут.
12. Погрузите слайды в DI_{H 2}O без РНазы и промыйте, ненадолго окунув вверх и вниз. Повторяйте это со свежей дистиллированной водой — всего 2 промывки.

6. Подготовка реагентов РНКскопа и гибридизация зонда

1. Подготовьте приклады для зонда RNAscope HiPlex и разбавитель HiPlex, нагрев их до 40°C в течение 10 минут в духовке или водяной бане.
2. Кратковременно опустите все акции 50X зондовой системы. Подготовьте рабочую смесь для зонда, разбавляя каждый уникальный целевой зонд до 1X с помощью разбавления РНК-скопа. Планируйте использовать 50–100 мкл зондовой смеси на одну ткань и хорошо перемешать её путём вихря перед использованием. Протокол RNAscope HiPlex, способный поддерживать до 3 циклов по 4 зондов (всего 12 зондов, обозначенных как T1-12). Для получения рекомендаций по проектированию зонда обратитесь к оригинальному опубликованному протоколу^{RNAscope 14}.
3. Разместите реагенты RNAscope HiPlex Amp 1–3 и HiPlex Fluoro T1-T4 в RT для уравновесия.
4. Возьмите обработанные препараты Protease III и пипетку 50–100 мкл смеси зонда на каждый участок ткани. Поставьте горизонтально в гибридизационную печь и инкубируем 2 часа при 40°C.
5. Промывайте стекла, полностью погрузив их в буфер 1X Wash на 2 минуты. Повторяйте с новым буфером — всего 2 промывания.
   Точка паузы: Слайды могут храниться в 5X SSC-буфере на RT ночью, как описано в протоколе RNAscope от ACD. Если эта точка паузы используется, обратите внимание, что на следующее утро потребуется два мойки по 2 минуты в буфере 1X.

7. Усиление зонда

Примечание: убедитесь, что все реагенты уравновешены RT перед применением на слайды.

1. Добавьте 1–2 капли реагента HiPlex Amp1 в затворы и инкубуйте в печи для гибридизации при 40°C в течение 30 минут. Промывайте стеклы, полностью погрузив их в буфер 1X Wash на 2 минуты. Повторяйте — всего два раза.
2. Добавьте 1–2 капли реагента HiPlex Amp2 в затворы и инкубируйте в гибридизационной печи при 40°C в течение 30 минут. Промывайте стеклы, полностью погрузив их в буфер 1X Wash на 2 минуты. Повторяйте — всего два раза.
3. Добавьте 1–2 капли реагента HiPlex Amp3 в затворы и инкубуйте в печи для гибридизации при 40°C в течение 30 минут. Промывайте стеклы, полностью погрузив их в буфер 1X Wash на 2 минуты. Повторяйте — всего два раза.
4. Добавьте 1–2 капли реагента HiPlex Fluoro T1-T4 в затворы и инкубируете в печи для гибридизации при 40°C в течение 15 минут. Промывайте стеклы, полностью погрузив их в буфер 1X Wash на 2 минуты. Повторяйте — всего два раза.
5. Добавьте 3–4 капли реагента HiPlex DAPI в каждый участок ткани и инкубировать в течение 1 минуты при RT.
6. Удалите DAPI, отведя жидкость от затворов с помощью впитывающей салфетки. Немедленно добавьте 100 мкл водного основания антифейдного монтажного материала (может быть таким же, как при этапе окрашивания IBEX) в каждую секцию. Аккуратно положите на затвор, минимизируя пузырьки, и дайте монтажному среде высохнуть 15–30 минут.
7. Переходите к визуализации.
   Точка паузы: Установленные слайды можно хранить в темноте при 4°C до 3 дней, однако мы рекомендуем действовать быстро, чтобы минимизировать разрушение РНК.

8. Расщепление флуорофоров и итеративная гибридизация РНК

1. Чтобы снять скользящие слои с затворов, замочите в буфере 4X SSC минимум на 30 минут в RT. Промыйте один раз, полностью погрузив затворы в свежий буфер 4X SSC и ненадолго окунув вверх и вниз.
2. Откройте свежий ампулу раствора для расщепления и сделайте 10% рабочий бульон, разбавляя его 4X SSC-буфером.
3. Поместите стекли в влажный ящик и добавьте 3–4 капли 10% раствора для разреза. Инкубировать на RT 15 минут, затем промой стекли, полностью погрузив в 0,5% PBST на 2 минуты. Повторяйте с свежим PBST — всего 2 промывки.
4. Для прохождения второго цикла визуализации панели РНКскопа необходимо уравновесить реагент HiPlex Fluoro T5-T8 с RT.
5. Включите духовку для гибридизации и установите температуру на 40°C.
6. Добавьте реагент HiPlex Fluoro T5-T8 в затворы и инкубируете в печи для гибридизации при 40°C в течение 15 минут. Промывайте стеклы, полностью погрузив их в буфер 1X Wash на 2 минуты. Повторяйте — всего два раза.
7. Аккуратно отведите лишнюю жидкость из затворов. Немедленно добавьте 100 мкл монтажного материала в каждую секцию и аккуратно наместите на затвор. Дайте монтажному материалу высохнуть на 15–30 минут и переходите к визуализации.
8. Повторите шаги 8.1–8.7 с реагентом HiPlex Fluoro T9-T12, если это уместно, всего 3 цикла РНК-скопа. Обратите внимание, что хотя с протоколом RNAscope HiPlex, возможно 3 цикла, дополнительное время, необходимое для окрашивания белков с этим протоколом, может повлиять на качество РНК. Поэтому 3 цикла могут быть не всегда возможны в зависимости от конкретных расшифровок, которые выбираются.

9. Обработка изображений

1. Индивидуально обрабатывайте исходные файлы каждого раунда и выполняйте обработку изображений с использованием последовательных параметров, включая настройки фонового вычитания, фильтры сглаживания и тип трансформации регистрации... Каналы должны называться с единым разделительным символом (например, Цикл 1: CD45 AF532, где «:» различает цикл и маркер/флюор).
2. Запустите программное обеспечение SimpleITK (https://github.com/niaid/sitk-ibex) и нажмите на расширения Imaris > SimpleITK > аффинную регистрацию z-стека через общий канал.
3. Загрузите по одному файлу изображения из каждого цикла мультиплекса и введите символ разделителя для всех названных каналов (например, ":").
4. Выберите канал для регистрации изображения и фиксированное изображение, к которому будут выровнены все остальные изображения. Рекомендуется использовать DAPI в качестве фидуциального маркера, хотя можно использовать любой общий именованный канал между всеми циклами.
5. Нажмите «Зарегистрироваться», затем «Пересэмплировать и сохранить комбинированное изображение».
6. Переходите к следующему анализу с выбранным вами программным обеспечением. Для получения дополнительной информации о обработке и регистрации изображений обратитесь к оригинальному протоколу IBEX^12,13.

Результаты

Рисунок 1 : Обзор рабочего процесса Bex-Plex.
Фиксированные замороженные ткани, нанесённые на хромированные квасцевые стекли, проходят до 3 циклов стандартного IBEX, после чего до трёх циклов RNAScope HiPlex, при этом начальный этап получения цели выполняется при 60°C в течение 1 часа. Изображения из отдельных циклов затем регистрируются и выравниваются с помощью фидуциального маркера...

Обсуждение

Рабочий процесс Bex-Plex интегрирует итеративную платформу окрашивания белков IBEX с гибридизацией RNAscope in situ , что позволяет одновременно обнаруживать белки и транскрипты РНК с разрешением одной клетки. Основная цель этого протокола — предоставить воспроизводимый метод интегрированного пространственного анализа экспрессии белков и РНК внутри целостных тканей. Возможность измерять экспрессию белков и РНК в одной ткани ранее представляла технические сложности: высокие затра...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1.5 ml microcentrifuge tubes	Biopioneer	MCNT-1.5F
200 proof EtOH	Fisher Scientific	BP28184
20X SSC buffer	Invitrogen	AM9765
24 well plates
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD11b Antibody	Biolegend	101217
Alexa Fluor 523 anti-mouse CD3e Antibody	Invitrogen	58-0032-82
Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G Antibody	Biolegend	127610
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD68 Antibody	Biolegend	137025
BD Cytofix/Cytoperm fixation and permeablization solution	BD	554722
Chrome alum gelatin	Fisher	NC1692262
Confocal microscope (e.g Leica Stellaris)
Cryomolds	VWR	25608-922
Cryostat (e.g CryoStar NX50 Cryostat)	Thermofisher Scientific	957100
Cryostat blades (e.g Leica Low Profile Disposable Blades DB80LX)	Leica Biosystems	14035843496
DAPI	Thermofisher Scientific	62248
Dissection microscope (e.g Zeiss SteREO Discovery.V8)
Dissection tools
Dry Ice
Dunk tank for slide staining (e.g Simport Scientific EasyDip Slide Staining Jars)	Fisher Scientific	22-038-489
Fluoromount-G	Fisher	OB10001
Heated water bath
Histology brushes (e.g. Ted Pella Camel Hair Brushes)	Fisher Scientific	NC2023341
Hybridization oven (e.g. HybEZ II Hybridization System)	ACD	321710
Image analysis software of choice
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen	Vector Laboratories	H-4000
Kimwipes	VWR	21905-026
Lithium borohydride	STREM Chemicals	93-0397
Micropipettes (P-10, P-20, P-200, P-1000)
Mini Microcentrifuge (e.g. Corning LSE Mini Microcentrifuge)	Corning	6770
Mouse BD Fc Block	BD	553142
No 1.5 Coverglass	VWR	48393-241
Pipette tips (P-10, P-20, P-200, P-1000)
RNAscope HiPlex Probe, mm-CD274-T7	ACD	420501-T7
RNAscope HiPlex Probe, mm-IL-10-T6	ACD	317261-T6
RNAscope HiPlex12 Reagents Kit v2 (includes detection kit, cleaving stock solution, protease reagents, target retreival reagents, and wash buffer)	ACD	324409
RNAscope Protease III	ACD	322337
RNase ZAP	Millipore Sigma	R2020-250
Simple ITK software: https://github.com/niaid/sitk-ibex
Slide staining tray/humidity chamber
Sucrose Bioxtra	Sigma	S7903-1KG
Superfrost Plus Microscope slides	VWR	48311-703
Tissue-Tek OCT	VWR	25608-930
Tween-20, Molecular Biology grade	Promega	H5152
UltraPure DNase/RNase free water	Fisher Scientific	10977023