Bex-Plex позволяет одновременно визуализировать белковые маркеры и транскрипты рибонуклеиновой кислоты для глубокого пространственного профилирования целостных тканей

Summary

Здесь мы представляем протокол сочетания итеративного окрашивания белков (IBEX) с технологией гибридизации RNAscope in situ для глубокого пространственного фенотипирования целостных фиксированных замороженных тканей для высокоразрешающих пространственных профилей.

Abstract

Здесь мы представляем протокол, позволяющий одновременно пространственное профилирование маркеров белка и рибонуклеиновой кислоты (РНК) с разрешением одной клетки в целостных тканях. Одной из основных проблем, связанных со солидными опухолями, является невозможность предсказать реакцию пациента на терапевтическое вмешательство. Для расшифровки этих сложностей требуется количественное измерение клеточного поведения, взаимодействий и фенотипов внутри целостных тканей. В частности, протеом и транскриптом предоставляют перекрывающуюся, но неизбыточную информацию, которая может быть критически важна для разработки рациональных иммунотерапевтических средств. Однако в настоящее время не существует простого и экономически эффективного способа глубоко пропрофилировать как транскрипционное, так и функциональное состояние всех клеток в микросреде опухоли, сохраняя при этом их критическую пространственную информацию о локализации. С этой целью мы успешно объединили платформу IBEX (итеративное отбеливание расширяет мультиплексность) с HiPlex RNAscope для одновременной визуализации маркеров с высоким уровнем плекса и транскриптов с высоким содержанием рибонуклеиновой кислоты (РНК) с разрешением одной клетки. Этот подход включает модифицированный этап поиска РНК-мишени для сохранения морфологии ядра и обеспечения точного выравнивания изображений по циклам. «Bex-Plex» позволяет нам выполнять немодифицированный протокол IBEX на фиксированных замороженных тканях, за которым следует протокол HiPlex RNAscope, при котором используется модифицированная РНК-мишена для обеспечения ядерного согласования с циклами IBEX. Этот протокол оптимизирован для фиксированных замороженных тканей и позволяет проводить интегрированный пространственный анализ транскрипционных и функциональных клеточных состояний. Способность профилировать на уровне одной клетки не только предоставляет глубокий источник информации о самой ткани, но и может дать возможность предсказывать тонкие клеточные взаимодействия, которые определяют терапевтическую реакцию, предоставляя основу для изучения пространственной биологии в микроокружениях опухолей и связанных с ними системах.

Introduction

С момента их внедрения в 2011 году иммунотерапии рака, снижающие подавление цитотоксических Т-клеток путём блокировки ингибиторных молекул иммунных контрольных точек, таких как PDL-1 и CTLA-4, стали золотым стандартом лечения твердых^{опухолей 1}. Однако, несмотря на масштабное применение у пациентов, клиническая эффективность этих препаратов сильно варьируется, поскольку многие солидные опухолевые виды опухоли либо по сути проявляются, либо в конечном итоге формируют к ним^{устойчивость 2.} Во многих случаях это связано с крайне гетерогенной природой солидных опухолей, даже среди одного и того же рака^3-го типа. Более глубокое понимание клеточных отношений, возникающих в солидных опухолях, является ключом к улучшению методов лечения. Таким образом, определение точных механизмов и взаимодействий, которые формируют и поддерживают эту устойчивость, находится в центре внимания исследований рака. Здесь мы стремимся разработать метод, позволяющий интегрированный пространственный анализ экспрессии белков и РНК в целостных тканях для лучшей характеристики этих сложных клеточных взаимодействий.

Микросреда опухолей (ТМЭ) состоит из нераковых клеточных и структурных компонентов, формирующих рост опухоли и иммунный ответ, включая аферо-афрофильные фибробласты, инфильтрирующие иммунные клетки, сосудистые компоненты и внеклеточную^{матрицу 4}. В последнее время стало очевидно, что состав и организация ТМЭ сильно влияют на то, являются ли опухоли проницательными или устойчивыми к иммунной инфильтрации, что является одним из основных факторов, определяющих реакцию на^{иммунотерапию 5}. Во многих видах рака фенотип «иммунной пустыни», характеризующийся низким количеством Т-клеток и наличием высокоиммуносупрессивных миелоидных популяций, коррелирует с плохой реакцией на терапию блокадных точек^6,7. Сигнализация хемокина регулирует многие из этих динамик набора. Например, CXCL1 и CCL2 привлекают иммуносупрессивные миелоидные клетки, тогда как ось CXCR3-CXCL9/CXCl10 привлекает как цитотоксичные, так и регуляторные Т-клетки в^{опухоль 8}. В результате специфическая нишевая сигнальная среда может существенно влиять на фенотип и функцию клеток. Например, у пациентов с колоректальным раком ось CCL5-CCR5 контролирует подавляющую функцию макрофагов, связанных с опухолями (TAM), и блокировка этого сигнала смещает TAM в сторону антиопухологенного фенотипа и коррелирует с улучшением клинических^{ответов 9}. Кроме того, прямое взаимодействие между иммунными клетками, афрофилированными фибробластами и/или опухолевыми клетками через ICAM и PDL-1 может вызывать истощение иммунитета и ослаблять противоопухолевой^{иммунитет 10}. Вместе эти результаты подчёркивают важность пространственно разрешённых анализов для понимания того, как TME влияет на терапевтическую эффективность.

Иммунофлуоресцентная (ИФ) визуализация остаётся основополагающим подходом к визуализации экспрессии белков и взаимодействия между клетками в тканях. Эта область продвинулась от традиционных 3-4 цветных IF к высококонтентным процессам изображений, основанным на итеративном окрашивании и визуализации. В этих методах большие наборы данных генерируются посредством повторяющихся циклов маркировки антител, визуализации и инактивации или удаления флуорофоров, чтобы можно было окрашить и сфотографировать дополнительные^{маркеры 11}. Итеративное отбеливание расширяет мультиплексность (IBEX) недавно была представлена как удобная и экономичная итеративная платформа для визуализации¹². Совместимый с использованием коммерческих антител и традиционных микроскопов, IBEX использует литий-боргидрид (_{LiBH 4}) для подавления флуоресценции наиболее часто используемых красителей без повреждения эпитопов тканей, что позволяет получить до 75 параметров для одной^{ткани 13}. Изображения, полученные циклическим окрашиванием, выравниваются с помощью открытого программного обеспечения SimpleITK для создания составных наборов данных, подходящих для пространственного анализа с высокой размерностью.

Дополняя белоковое фенотипирование, пространственные транскриптомные методы могут предоставить ценную информацию о транскрипционном состоянии клеток в их естественной среде. Примечательно, что гибридизация in situ (ISH) — популярный метод идентификации локализации последовательностей ДНК или РНК в определённой^{ткани 11}. RNAscope — это хорошо зарекомендовавший себя подход ISH, который использует зонды с уникальной Z-химией для специфической амплификации транскриптов РНК с одномолекулярным разрешением и совместим со многими различными типами^{образцов 14}. Как широко принятая и коммерчески доступная платформа через Advanced Cell Diagnostics (ACD), RNAscope предлагает проверенные зонды для широкого спектра целей, упрощая проектирование экспериментов для различных применений.

Более полное представление о идентичности и функциях клеток можно получить, объединив обнаружение белков и РНК в одной ткани. Кратковременные секретируемые белки, такие как цитокины и хемокины, традиционно не подвергаются надёжному окрашиванию антител с помощью IHC, но информацию об их экспрессии можно получить с помощью количественной оценки их мРНК-транскриптов. Предыдущие попытки совместного обнаружения РНК и белка, такие как обычные хромогенные IHC или TSA-OPAL, были ограничены нелинейным усилением сигнала и трудоёмкими протоколами получения^{антигена 15}. По сравнению с этими подходами, метод Bex-Plex позволяет одновременно обнаруживать высокоплексные белки и РНК, сохраняя пространственный контекст и ядерную морфологию для точной регистрации изображений.

Здесь мы представляем «Bex-Plex» — протокол, который интегрирует платформы IBEX и RNAscope для одновременной, количественной характеристики транскрипционных и трансляционных состояний клеток внутри их нативных тканей. В Bex-Plex ткани с фиксированным ОКТ проходят стандартный протокол IBEX, за которым следует слегка модифицированный рабочий процесс RNAscope HiPlex, при котором получение цели проводится при 60°C при инкубации 1 час, по сравнению с первоначальной инкубацией при 99°C в течение 5 минут. Это сохраняет архитектуру ядер, позволяя точно выравнивать фидуциальные маркеры при регистрации отдельных изображений из циклов IF и ISH в одно. Этот протокол лучше всего подходит для исследований, требующих одновременного пространственного анализа экспрессии белков и РНК в целостных тканях, особенно когда доступность тканей ограничена или при критически важном сохранении пространственной архитектуры, например, при анализе микросреды опухолей или иммунном профилировании.

Используя широко доступные реагенты и совместимые с большинством платформ визуализации, Bex-Plex может выполняться любым технически подготовленным научным сотрудником, знакомым с флуоресцентной съёмкой и имеющим доступ к обычному микроскопу. Протокол, представленный здесь, оптимизирован для фиксированных замороженных образцов. В настоящее время протокол был проверен в фиксированных замороженных тканях, и может потребоваться дальнейшая оптимизация для применения к другим типам образцов, таким как FFPE или клинические образцы на людях.

Этот рабочий процесс будет бесценен в любых условиях, где ткани ограничены или ценны, например, биопсии тканей или эксперименты на животных с ограниченным размером выборки, а также для фенотипирования клеток, которые могут быть трудно извлечены с помощью диссоциативных методов. Bex-Plex предоставляет одновременную, количественно измеримую информацию о транскрипционных и трансляционных профилях отдельных клеток, сохраняя при этом их пространственный контекст — данные, которые уникально способны ответить на вопросы о взаимоотношениях и перекрёстном взаимодействии между клетками в их исходной среде.

Protocol

Процедуры, изложенные в этом протоколе, были утверждены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Калифорнийского университета в Сан-Диего (протокол номер S24049). Для этих экспериментов использовались самцы и самки мышей в возрасте 7–12 недель с генетическим фоном C57BL/6 и содержащиеся в специфических условиях, свободных от патогенов.

1. Подготовка тканей

1. Эвтаназия экспериментальных мышей с помощью утверждённых первичных и вторичных мер (например, эвтаназия с_CO2 и вывих шейки матки) и сбор интересующих тканей в дополненную среду.
2. Приготовьте свежий запас фиксирующего ткани, разбавляя 4% раствор параформальдегида (PFA) до 0,5% или 1% PFA в 1X PBS. Используйте 0,5% PFA для тканей с меньшим объёмом, таких как лимфатические узлы, и 1% PFA для тканей с большим объёмом, таких как опухоли...
   ВНИМАНИЕ: Параформальдегид горючий и токсичен при проглатывании или проглатении. Обращайтесь с подходящими средствами индивидуальной защиты и избегайте контакта с кожей или глазами.
3. Перенесите ткани в пластину на 24 лунки с фиксативом 2 мл на каждую скважину и инкубируемые на ночь при 4°C.
   Примечание: Время инкубации более 16 часов может привести к проблемам с перефиксацией.
4. Заполните колодцы новой пластины с 24 лунками 1X PBS и перенесите ткани с фиксирующей пластины.
   Точка паузы: При необходимости ткани можно хранить в 1X PBS при 4°C до 7 дней.
5. Убирайте лишний жир и остатки тканей по одному с помощью дискоскопа и инструментов. Добавьте небольшой объём 1X PBS непосредственно к ткани, чтобы предотвратить обезвоживание тканей во время стрижки.
6. Приготовьте 30% раствора сахарозы, разбавляя порошковый сахарозный бульон в 1X PBS.
7. Переместите ткани в пластину на 24 лунки с 2 мл сахарозы 30% в каждую скважину и инкубируем ночью при 4°C для обезвоживания. Ткани достаточно обезвожены, когда опускаются на дно колодцев.
8. Заполните маркированные криомолды ОКТ и помещайте ткани по одной в формы. Ориентация ткани зависит от происхождения, но наша стандартная рекомендация — чтобы самая большая площадь поверхности была параллельна дну криомолда. Убедитесь, что ткани полностью погружены в ОКТ.
9. Поставьте на сухой лёд на 10 минут для заморозки и храните при -80°C.

2. Сечение тканей

Примечание: Все реагенты и лабораторные материалы, используемые для этого протокола, должны быть без РНазы. Следите за предотвращением загрязнения при работе с горками.

1. Покрытие микроскопов без РНазы 15 мкл хромированного квасца и инкубировать в духовке 1 час при 60°C. Стекли с хромированным алюмом можно хранить при RT (комнатной температуре) до месяца до использования.
2. Достаньте ткани, вложенные в ОКТ, из морозильника при -80°C и поместите в криостат/криотом при -20°C для балансирования минимум на 20 минут.
3. Сечение тканей на хромированные квасцевые стекли толщиной 10–15 мкм.
4. Храните стекли с вырезанными участками при 4°C или, если окрашиваете в тот же день, дайте стеклам уравновесить до RT. Секционные стекли можно хранить при 4°C до 5 дней перед использованием.

3. Белковое окрашивание

1. В танке для макка замочите стекло для окрашивания в 1X PBS без РНазы на 5 минут, чтобы удалить избыток ОКТ из тканей.
2. Используйте гидрофобную барьерную ручку, чтобы нарисовать коробки вокруг тканей на затворе и дать высохнуть 2 минуты.
3. Приготовьте блокирующий раствор 10 мкг·мл⁻¹ противомышиного блока FC-рецептора в 1X PBS без РНаз. Добавьте блокирующий буфер к образцам на слайде, используя достаточное количество для создания пузыря, полностью покрывающего ткань (100–150 мкл·^{сечение-1}).
   Примечание: иногда требуется добавление FBS или BSA (обычно 1–2%) в блокирующий буфер для сложных тканей и/или маркеров.
4. Инкубировать стекли на RT в влажном контейнере для окрашивания 1 час, затем полностью погрузить их в бак с РНаз-безсодержащим 1X PBS на 5 минут.
5. Приготовьте раствор для окрашивания первичных антител в 1X PBS без РНаз, планируя 100-200 мкл на срез ткани. Стандартные разбавления антител варьируются от 1:50 до 1:200, но рекомендуется проводить однократные титрации для определения оптимального фактора разбавления для конкретного антитела и/или типа ткани. Вихрь и импульс вращают антитела перед пипетированием, чтобы предотвратить появление флуоресцентных агрегатов.
6. Снимите стекла из стирки и аккуратно отведите лишнюю жидкость из угла коробок с образцами с помощью впитывающей салфетки, чтобы не разбавлять раствор антител.
7. Наносите раствор антител так же, как и блокирующий, создавая пузырь на ткани.
8. Поставьте слайды горизонтально в духовку при 37°C и инкубуйте 1 час. В качестве альтернативы используйте слайды Incubate на RT 3–4 часа в влажном контейнере. Могут использоваться стандартные ИФ-протоколы, уже оптимизированные для желаемой ткани. Во время инкубации держите слайды во влажной среде, чтобы предотвратить обезвоживание. (например, используйте влажное бумажное полотенце на дне лотка для окропления).
9. Помойте стеклы, погрузив их в 1X PBS без РНазы на 2 минуты. Повторите дважды, всего три раза. При необходимости для панели для окрашивания подготовьте вторичный раствор для окрашивания антител в 1X PBS без РНазы в этот период. Стандартные разбавления антител варьируются от 1:500 до 1:1000, однако рекомендуется проводить однократное титрование для определения оптимального фактора разбавления для конкретного типа антитела и/или ткани.
10. Отведите лишние PBS с стекло с помощью абсорбирающей салфетки и добавьте 100–200 мкл вторичного раствора для окрашивания антител в каждый участок ткани. Поставьте слайды горизонтально в духовку при температуре 37°C и инкубуйте 30 минут. В качестве альтернативы стекли могут быть окрашены на RT в течение 1–2 часов в влажной коробке.
11. Помойте слайды, погрузив в 1X RNase-free PBS на 2 минуты. Повторите дважды, всего три раза.
12. Разведите ядерный краситель DAPI до конечной концентрации 0,2 мкг·мл⁻¹ в 1X PBS без РНазы и добавьте 100–200 мкл в каждый участок ткани.
13. Инкубируйте слайды в течение 10 минут на RT в влажном контейнере, затем один раз помойте, погрузив в 1X PBS без РНазы и ненадолго окунув вверх и вниз.
14. Отведите лишнюю жидкость с затворов впитывающей салфеткой и добавьте 20–30 мкл водного основания антифейдного крепления в каждую секцию. Аккуратно положите накладку на затвор, минимизируя пузырьки, и дайте монтажному материалу затвердеть 15–30 минут.
15. Представьте запятнанные слайды. Для более подробного объяснения аспектов конструкции панелей и получения изображений для IBEX см. оригинальные опубликованные протоколы^{IBEX 12,13}.
    Точка паузы: храните стекли в темноте при 4°C до 3 дней, однако рекомендуем действовать немедленно, чтобы минимизировать разрушение РНК.

4. Отбеливание флуорофором и итеративное окрашивание белков

1. Погрузите затворы в 1X PBS без РНазы, пока крышка не скользит легко без применения силы. В зависимости от того, как долго установлена накладка, это может занять до 16 часов.
2. Пока стекли замачиваются, приготовьте раствор LiBH₄ объемом 1 мг·^мл⁻1 в DI H₂O, аккуратно перемешивая до полного растворения и ждите 10 минут до активации. Активация происходит, когда в растворе присутствуют пузырьки, а активность длится до 4 часов.
   Внимание:_{LiBH 4} реактивен на воду, избегайте чрезмерного воздействия порошкового бульона влаги и правильно утилизируйте отходы.
3. Промыйте стекли один раз в течение 2 минут в 1X PBS без РНаз, чтобы удалить остатки монтажной среды, затем нанесите пипетку 100–150 мкл раствора_{LiBH 4} на каждую ткань. Инкубировать в влажной коробке 15 минут.
   Примечание: в зависимости от используемых флуорофоров для окрашивания, это время инкубации может потребовать увеличения (подробно обсуждается в статьях по методам IBEX)^12,13.
4. Помойте слайды один раз, погрузив их в 1X PBS без РНазы и ненадолго окунув вверх и вниз.
5. Переходите к окрашиванию слайдов дополнительными белковыми маркерами, следуя шагам 3.5-3.15. Не обязательно повторно окрашивать ядерный краситель, так как он не отбеливает_{LiBH 4}. При необходимости повторяйте белоковое окрашивание.
   Точка паузы: Установленные стекли можно хранить при 4°C на ночь перед отбелением последнего цикла белка/IBEX и переходом к РНК.
6. Немедленно переходите к RNAscope HiPlex после отбеливания флуорофоров из последнего цикла. Хотя было проведено до шести циклов стандартного IBEX без потери тканей или эпитопов, мы не рекомендуем превышать три цикла окрашивания белками для этого протокола из-за вероятности снижения качества транскрипта РНК за более длительный период.

5. Подготовка слайдов для RNAscope HiPlex

1. Полностью погружайте стекли в 1X PBS без РНазы, пока накладка легко не соскользнёт без применения силы. В зависимости от того, как долго установлена накладка, это может занять до 16 часов. Постирайте один раз в течение 2 минут в 1X PBS без РНазы, чтобы удалить остатки монтажной среды.
2. Приготовьте 200 мл этанола 50%, 200 мл этанола 70% и 400 мл этанола 100%.
3. Включите духовку для гибридизации и установите температуру на 60°C. Разведите реагент Target Retrieval Reagent 10X до рабочего запаса 1X в DI H_2Oбез РНазы и предварительно разогрейте, поместив его в духовку до шага 5.8.
   Примечание: Несоблюдение предварительного нагрева реагента для получения мишени до 60°C повлияет на последующей регистрации изображений из отдельных циклов. Целевой реагент для извлечения должен оставаться при температуре 60°C на протяжении всего этапа забора.
4. Окуните затворы в 50% этанола. Инкубировать 5 минут на RT.
5. Снимите стекла с 50% этанола и погрузите их в 70% этанола. Инкубировать 5 минут на RT.
6. Снимите стекли с 70% этанола и погрузите его в 100% этанол. Инкубировать 5 минут при RT и повторить с новым 100% этанолом.
7. Снимите затворы из 100% этанола и дайте высохнуть на RT 5 минут.
8. Добавьте 100–150 мкл 60°C 1X Target Retrieval Reagent в каждую тканевую секцию и поместите стекла в гибридизационную печь. Инкубировать при 60°C в течение 1 часа.
9. Снимите стекли и прополосните, погрузив их в DI H2O без РНазы на 15 секунд. В этот момент измените установленную температуру духовки на 40°C.
10. Переведите стекли на 100% этанол и инкубуйте 5 минут, затем высохите на RT минимум 5 минут.
11. Нанесите Протеазу III на стеклы, по 1–2 капли на секцию ткани. Поставьте слайды в духовку для гибридизации и инкубуйте при 40°C в течение 30 минут.
12. Погрузите слайды в DI_{H 2}O без РНазы и промыйте, ненадолго окунув вверх и вниз. Повторяйте это со свежей дистиллированной водой — всего 2 промывки.

6. Подготовка реагентов РНКскопа и гибридизация зонда

1. Подготовьте приклады для зонда RNAscope HiPlex и разбавитель HiPlex, нагрев их до 40°C в течение 10 минут в духовке или водяной бане.
2. Кратковременно опустите все акции 50X зондовой системы. Подготовьте рабочую смесь для зонда, разбавляя каждый уникальный целевой зонд до 1X с помощью разбавления РНК-скопа. Планируйте использовать 50–100 мкл зондовой смеси на одну ткань и хорошо перемешать её путём вихря перед использованием. Протокол RNAscope HiPlex, способный поддерживать до 3 циклов по 4 зондов (всего 12 зондов, обозначенных как T1-12). Для получения рекомендаций по проектированию зонда обратитесь к оригинальному опубликованному протоколу^{RNAscope 14}.
3. Разместите реагенты RNAscope HiPlex Amp 1–3 и HiPlex Fluoro T1-T4 в RT для уравновесия.
4. Возьмите обработанные препараты Protease III и пипетку 50–100 мкл смеси зонда на каждый участок ткани. Поставьте горизонтально в гибридизационную печь и инкубируем 2 часа при 40°C.
5. Промывайте стекла, полностью погрузив их в буфер 1X Wash на 2 минуты. Повторяйте с новым буфером — всего 2 промывания.
   Точка паузы: Слайды могут храниться в 5X SSC-буфере на RT ночью, как описано в протоколе RNAscope от ACD. Если эта точка паузы используется, обратите внимание, что на следующее утро потребуется два мойки по 2 минуты в буфере 1X.

7. Усиление зонда

Примечание: убедитесь, что все реагенты уравновешены RT перед применением на слайды.

1. Добавьте 1–2 капли реагента HiPlex Amp1 в затворы и инкубуйте в печи для гибридизации при 40°C в течение 30 минут. Промывайте стеклы, полностью погрузив их в буфер 1X Wash на 2 минуты. Повторяйте — всего два раза.
2. Добавьте 1–2 капли реагента HiPlex Amp2 в затворы и инкубируйте в гибридизационной печи при 40°C в течение 30 минут. Промывайте стеклы, полностью погрузив их в буфер 1X Wash на 2 минуты. Повторяйте — всего два раза.
3. Добавьте 1–2 капли реагента HiPlex Amp3 в затворы и инкубуйте в печи для гибридизации при 40°C в течение 30 минут. Промывайте стеклы, полностью погрузив их в буфер 1X Wash на 2 минуты. Повторяйте — всего два раза.
4. Добавьте 1–2 капли реагента HiPlex Fluoro T1-T4 в затворы и инкубируете в печи для гибридизации при 40°C в течение 15 минут. Промывайте стеклы, полностью погрузив их в буфер 1X Wash на 2 минуты. Повторяйте — всего два раза.
5. Добавьте 3–4 капли реагента HiPlex DAPI в каждый участок ткани и инкубировать в течение 1 минуты при RT.
6. Удалите DAPI, отведя жидкость от затворов с помощью впитывающей салфетки. Немедленно добавьте 100 мкл водного основания антифейдного монтажного материала (может быть таким же, как при этапе окрашивания IBEX) в каждую секцию. Аккуратно положите на затвор, минимизируя пузырьки, и дайте монтажному среде высохнуть 15–30 минут.
7. Переходите к визуализации.
   Точка паузы: Установленные слайды можно хранить в темноте при 4°C до 3 дней, однако мы рекомендуем действовать быстро, чтобы минимизировать разрушение РНК.

8. Расщепление флуорофоров и итеративная гибридизация РНК

1. Чтобы снять скользящие слои с затворов, замочите в буфере 4X SSC минимум на 30 минут в RT. Промыйте один раз, полностью погрузив затворы в свежий буфер 4X SSC и ненадолго окунув вверх и вниз.
2. Откройте свежий ампулу раствора для расщепления и сделайте 10% рабочий бульон, разбавляя его 4X SSC-буфером.
3. Поместите стекли в влажный ящик и добавьте 3–4 капли 10% раствора для разреза. Инкубировать на RT 15 минут, затем промой стекли, полностью погрузив в 0,5% PBST на 2 минуты. Повторяйте с свежим PBST — всего 2 промывки.
4. Для прохождения второго цикла визуализации панели РНКскопа необходимо уравновесить реагент HiPlex Fluoro T5-T8 с RT.
5. Включите духовку для гибридизации и установите температуру на 40°C.
6. Добавьте реагент HiPlex Fluoro T5-T8 в затворы и инкубируете в печи для гибридизации при 40°C в течение 15 минут. Промывайте стеклы, полностью погрузив их в буфер 1X Wash на 2 минуты. Повторяйте — всего два раза.
7. Аккуратно отведите лишнюю жидкость из затворов. Немедленно добавьте 100 мкл монтажного материала в каждую секцию и аккуратно наместите на затвор. Дайте монтажному материалу высохнуть на 15–30 минут и переходите к визуализации.
8. Повторите шаги 8.1–8.7 с реагентом HiPlex Fluoro T9-T12, если это уместно, всего 3 цикла РНК-скопа. Обратите внимание, что хотя с протоколом RNAscope HiPlex, возможно 3 цикла, дополнительное время, необходимое для окрашивания белков с этим протоколом, может повлиять на качество РНК. Поэтому 3 цикла могут быть не всегда возможны в зависимости от конкретных расшифровок, которые выбираются.

9. Обработка изображений

1. Индивидуально обрабатывайте исходные файлы каждого раунда и выполняйте обработку изображений с использованием последовательных параметров, включая настройки фонового вычитания, фильтры сглаживания и тип трансформации регистрации... Каналы должны называться с единым разделительным символом (например, Цикл 1: CD45 AF532, где «:» различает цикл и маркер/флюор).
2. Запустите программное обеспечение SimpleITK (https://github.com/niaid/sitk-ibex) и нажмите на расширения Imaris > SimpleITK > аффинную регистрацию z-стека через общий канал.
3. Загрузите по одному файлу изображения из каждого цикла мультиплекса и введите символ разделителя для всех названных каналов (например, ":").
4. Выберите канал для регистрации изображения и фиксированное изображение, к которому будут выровнены все остальные изображения. Рекомендуется использовать DAPI в качестве фидуциального маркера, хотя можно использовать любой общий именованный канал между всеми циклами.
5. Нажмите «Зарегистрироваться», затем «Пересэмплировать и сохранить комбинированное изображение».
6. Переходите к следующему анализу с выбранным вами программным обеспечением. Для получения дополнительной информации о обработке и регистрации изображений обратитесь к оригинальному протоколу IBEX^12,13.

Results

Рисунок 1 : Обзор рабочего процесса Bex-Plex.
Фиксированные замороженные ткани, нанесённые на хромированные квасцевые стекли, проходят до 3 циклов стандартного IBEX, после чего до трёх циклов RNAScope HiPlex, при этом начальный этап получения цели выполняется при 60°C в течение 1 часа. Изображения из отдельных циклов затем регистрируются и выравниваются с помощью фидуциального маркера (например, DAPI) для создания мультиплексного набора данных для дальнейшего анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Мы использовали описанный выше протокол для профилирования микросреды опухоли (ТМЭ) модели мышиной протоковой аденокарциномы (PDAC) (Рисунок 1). Линия опухоли, выделенная из Kras^LSL-G12D/+; Trp53^L/+; Pdx1-Cre; Мыши Rosa26^YFP/YFP (KPCY), которые спонтанно развивают рак поджелудочной железы и повторяют многие ключевые признаки человеческого PDAC, были подкожно введены в бок мышей C57BL/^{6 7}. Мыши с опухолями затем лечились комбинированной иммунотерапией, состоящей из ^{анти-ПД-1} (например, 200 мкг•^мышь-1, RMP1-14) и анти-CTLA-4 (i.p., 200 мкг•^мыши-1, 9H10), введённой на 10-й день после имплантации и продолжающейся каждые 3 дня до окончания эксперимента. Агонистический анти-CD40 (i.p., 100 мкг•^мышь-1, FGK45) был введён в виде единичной дозы на 13-й день после имплантации. Вместе мы называем это «FPC», как было опубликовано ранее7,16. Три опухоли в каждой экспериментальной группе были собраны через 16 дней после имплантации, а фиксированные замороженные срезы были установлены на капсулы с хромированным покрытием квасцов для Bex-Plex.

Рисунок 2: Результаты репрезентативного анализа IBEX + RNAscope (Bex-Plex).
(A) Комбинированное окрашивание IBEX и РНКскопом в срезах опухоли при протоках аденокарциномы поджелудочной железы (PDAC ) демонстрирует совместное обнаружение белковых и РНК-мишень, а также выравнивание флуоресцентных каналов. Шкала 10 мкм. (B) Количественная оценка иммунных компартментов Т-клеток (CD3+ CD11b-), макрофагов (CD11b+ CD68+) и миелоидных (CD11b+ CD68- Ly6G +/-) на основе интенсивности каналов белковых маркеров. Графики показывают среднюю плотность клеток для каждого типа клеток по группе лечения, n=3 опухоли. (C) Количественная оценка клеток, экспрессирующих трансскрипт Pdl1 и Il10 , в ранее идентифицированных белком иммунных компартментах. Графики показывают среднюю плотность клеток по группе лечения, n=3 опухоли. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Один цикл окрашивания белков был проведён на трёх опухолях, обработанных FPC, и трёх изотипных опухолях, чтобы оценить влияние на клетки миелоидной линии между группами лечения. Было получено семь параметров, хотя здесь мы сосредоточены на трёх интересных маркерах: CD11b, Ly6G и CD68 (рисунок 2A). После получения изображения флуорофоры от белкового окрашивания были отбелены, и один раунд РНКскопа был проведён с помощью зондов против Il10 и Pdl1 (рисунок 2A). Отдельные изображения затем выравнивались с помощью DAPI в качестве фидуциального (рисунок 2A). Количественная средняя интенсивность флуоресценции CD11b, CD68, Ly6G и CD3 выявила тенденцию к уменьшению числа макрофагов и миелоидных клеток у опухолей, леченных FPC, по сравнению с контролем (рисунок 2B). Количественные сравнения были проведены по всем выборкам, и данные представлены в виде средних значений. Кроме того, количество клеток, экспрессирующих Pdl1, Il10 или комбинацию обоих транскриптов как в макрофагном, так и в миелоидном компартментах показало снижение при лечении FPC по сравнению с контролем (рисунок 2C). Эти результаты указывают на потенциальное снижение иммуносупрессивных популяций клеток после лечения, что соответствует ожидаемым биологическим реакциям.

Рисунок 3: Оптимизация условий поиска целей для ядерного сохранения.
(A) Репрезентативное изображение ткани после удаления RT-мишени с отёком ядра и неясной морфологией. Примеры ядерных размеров обозначены жёлтыми контурами. Шкала, 40 мкм. (B) Репрезентативное изображение ткани после модифицированного извлечения мишени, показывающее улучшенную морфологию ядра при скорректированных температурных условиях. Примеры размера ядра обозначены жёлтыми контурами. Шкала, 40 мкм . (C) Средний объём ядер, определяемый сегментацией на основе DAPI на тканях, которые прошли RT-таргетическую экстракцию (не предварительно нагреваемые), при предварительном нагрете при 60°C или при стандартных IF условиях без забора. Полоски графа показывают среднее значение, а индикаторы ошибки — стандартное отклонение. P < 0,0001 по обычной односторонней ANOVA (звёздочки обозначают порог статистической значимости); n= 1639 ячеек на каждое условие. (D) Тепловые карты, представляющие корреляционные показатели между тремя изображениями до и после выравнивания изображения. Корреляционные баллы показываются для успешной регистрации и регистрации, которая не совпала из-за различий на ядерном уровне.

Важно отметить, что при проведении Bex-Plex без описанной модифицированной мишени ядра выглядели увеличенными с неясными краями по сравнению с ядрами ткани, где модифицированное извлечение мишени было проведено правильно (рисунок 3A и B). Использование регента для извлечения мишени при комнатной температуре привело к увеличению среднего объёма ядра на 33% на основе окрашивания DAPI по сравнению с извлеканием мишени с использованием реагента, предварительно нагретого до 60° C (см. рисунок 3C). Измерения ядерного объёма были получены из репрезентативных полей по образцам с использованием сегментации на основе DAPI. Кроме того, при выполнении этого этапа при 60°C с использованием предварительно нагретого реагента для извлечения, средний объём ядра не отличался существенно от среднего ядерного объёма после стандартного IF окрашивания (рисунок 3C). Поскольку DAPI является самым эффективным параметром для выравнивания изображения, это сравнение (рисунок 3) подчёркивает критическую важность модифицированных параметров поиска для сохранения ядерной морфологии. Правильная регистрация изображения обозначается показателем корреляции выравнивания, близким к 1, что указывает на сходство изображений разных циклов (рисунок 3D, до успеха и успешного).

Успешная реализация протокола подтверждается сохранением морфологии ядер, сильным и специфическим РНК-сигналом, а также точным выравниванием белковых и РНК-каналов. В отличие от этого, неоптимальные исходы могут включать искажение ядерного ядра, слабый или диффузный сигнал РНК, а также несогласованность между циклами визуализации (рисунок 3D, до и до отказа). Как показано на рисунке 3C, ядерная морфология должна сохраняться на протяжении всего протокола и быть как качественно, так и количественно заметной. До внедрения Bex-Plex пользователям следует определить истинность своих тканей с помощью отдельного белкового и РНК-окрашивания. Это не только обеспечивает оптимизированное окрашивание белков и РНК для целевых тканей, но и создаёт соответствующие пространственные паттерны, которые должны сохраняться при комбинировании для Bex-Plex. Например, CD11b колокализируется как с CD68, так и с Ly6G и демонстрирует окрашивание, локализованное мембраной клетки (рисунок 2A). Это ожидаемо, поскольку CD11b — это пан-миелоидный клеточный маркер, а CD68 и Ly6G — маркеры для макрофагов и нейтрофильных миелоидных подмножеств. Успешное обнаружение РНК характеризуется чёткими пунктатными сигналами, локализованными в отдельных клетках, тогда как неоптимальные результаты могут проявляться как слабое или диффузное окрашивание. Сигнал РНК-зонда должен локализироваться внутри и вокруг ядра в зависимости от функции транскрипта. Структурные белковые маркеры, такие как виментин, могут быть включены для улучшения клеточной разрешения локализации транскрипта путём выявления клеточных мембран в сложных тканях. Отрицательные или контрольные образцы должны показывать минимальное фоновое окрашивание и отсутствие неспецифического сигнала зонда, что подтверждает специфичность обнаружения как белков, так и РНК.

Discussion

Рабочий процесс Bex-Plex интегрирует итеративную платформу окрашивания белков IBEX с гибридизацией RNAscope in situ , что позволяет одновременно обнаруживать белки и транскрипты РНК с разрешением одной клетки. Основная цель этого протокола — предоставить воспроизводимый метод интегрированного пространственного анализа экспрессии белков и РНК внутри целостных тканей. Возможность измерять экспрессию белков и РНК в одной ткани ранее представляла технические сложности: высокие затраты, сложные этапы извлечения антигенов, ограниченную вместимость мультиплексов, ограничения разрешения (не одна клетка), нелинейное усиление сигнала и обширные биоинформатические конвейеры для дальнейшей ^{обработки 17,18,19}. По сравнению с существующими подходами, такими как мультиплексная иммунофлуоресценция, окрашивание OPAL/TSA и платформы пространственной транскриптомики, Bex-Plex обеспечивает воспроизводимое, количественное и высоко-плексное одновременное обнаружение, сохраняя пространственный контекст и ядерную морфологию для точного выравнивания изображения. Кроме того, Bex-Plex может выполняться в стандартной лабораторной среде и генерирует данные с разрешением одной ячейки, что легко обработать. Использование этого протокола для всестороннего понимания взаимодействий между клетками и клетками в различных тканевых контекстах, например, в микросреде опухоли, будет необходимым для разработки более эффективных иммунотерапий и улучшения исходов для пациентов в разных состояниях заболевания.

Наш метод проводится на фиксированных тканях, встроенных в ОКТ, и следует стандартному рабочему процессу IBEX без изменений, за которым следует немного изменённый протокол RNAscope HiPlex. Ключевым отличием является этап поиска цели в начале процесса гибридизации РНК: вместо производительных 99°C в течение 5 минут извлечение проводится при 60°C в течение 1 часа. Эта корректировка сохраняет ядерную архитектуру, что крайне важно для точного выравнивания изображений между белковыми и РНК-циклами. Ключевые этапы этого протокола включают поддержание стабильной температуры получения целевых целей, эффективное отбеливание флуорофора с помощью LiBH₄ и минимизацию деградации РНК за счёт быстрой обработки и использования реагентов без РНаз. Особенно важно обеспечить использование предварительно нагретых реагентов для извлечения мишени при 60°C; Несоблюдение этого может привести к ядерному отёку даже при изменённом этапе инкубации.

Хотя было показано, что 15 минут инкубации с_{LiBH 4} достаточно для инактивации многих широко используемых флуорофоров, рекомендуется индивидуально проверять этот процесс для каждого белкового цикла перед запуском всего протокола Bex-Plex. В первых публикациях по IBEX хорошо описано, что не все совместимые с IBEX флуорофоры одинаково поддаются^{отбеливанию 12}. Кроме того, наша лаборатория заметила, что некоторые структурные маркеры с высоким содержанием, такие как виментин, могут требовать более длительного времени отбеливания. Подтверждение того, что используемые комбинации флуорофора и маркеров адекватно отбеливают, должно предотвратить перелив остаточного сигнала в последующие белковые и РНК-циклы. Страница сообщества IBEX содержит отличные ресурсы по дизайну панелей, совместимых с IBEX, и специально предназначена для снижения нагрузки на новых пользователей, указывая эффективность антител и отбеливание фторофора в²⁰ раз. Кроме того, итеративное окрашивание и отбеливание не должны влиять на качество транскрипта РНК, однако важно как можно быстрее завершать белковые циклы и использовать реагенты без РНК для минимизации деградации РНК со временем. Невыполнение этого повлияет на гибридизацию зонда и приведёт к снижению сигнала в любых циклах РНКскопов, особенно для транскриптов с низким количеством. Распространённые проблемы, встречающиеся в процессе протокола, включают слабый сигнал РНК, неполное отбеливание флюорофоров и неправильное выравнивание между циклами визуализации, что можно смягчить за счёт оптимизации условий окрашивания и параметров визуализации.

Крайне важно ограничить время между окрашиванием белков и гибридизацией РНК-зонда менее чем 5 днями. При проведении Bex-Plex на нескольких слайдах настоятельно рекомендуется обрабатывать по одному слайду за раз, чтобы снизить вариабельность деградации РНК. Аналогично, ограничите время между гибридизацией зонда и визуализацией. Хотя мы успешно снимали изображения до 3 дней после усиления, длительное хранение не рекомендуется. Если после нескольких циклов окрашивания или гибридизации сигнал снижается, может потребоваться увеличение скорости на протяжении всего протокола. В идеале мы рекомендуем работать как можно быстрее, так как задержки снижают целостность РНК и могут уменьшить амплификацию. Другие подходы включают сокращение количества белковых циклов, чтобы легче вписываться в временные ограничения протокола, или изменение конструкции панели РНК-зонда с целью с более высоким содержанием. Перед объединением IBEX и RNAscope проверьте антитела и зондовые панели для каждого цикла отдельно, чтобы определить ожидаемое качество сигнала для каждого цикла. В случае ядерного набухания после получения цели возможно, что реагент для получения цели был предварительно нагрет неправильно. Убедитесь, что реагент для извлечения не остывает после разбавления и предварительного нагрева до 60^°C, и чтобы температура оставалась постоянной во время 1 часа инкубации на слайде. Наконец, если регистрация и выравнивание изображения не выполняются при отсутствии ядерного вздутия, это означает, что имели несоответствие параметров получения изображения, таких как глубина бита, размер вокселей или положение Z по циклам. В случае таких ошибок может потребоваться повторить протокол с корректировками этих настроек для их согласованности. Эти стратегии устранения неполадок необходимы для обеспечения воспроизводимости и согласованности во всех экспериментах.

Данные, полученные Bex-Plex, позволяют получить глубокое представление о пространственном ландшафте тканей на ранее недостижимом уровне. Однако основным ограничением этого протокола является то, что общее количество итеративных белковых циклов меньше, чем только при IBEX, из-за постепенной деградации РНК со временем. Хотя было проведено до 6 циклов стандартного IBEX, мы не рекомендуем превышать 3 цикла белкового окрашивания для Bex-Plex. Тем не менее, протокол поддерживает максимальное количество циклов RNAscope, и такой уровень глубины мультиплекса достаточен для большинства приложений.

Дополнительные ограничения включают вариабельность между типами тканей и возможные артефакты автофлуоресценции или окрашивания, которые могут влиять на интерпретацию сигналов. Более хрупкие ткани могут выдерживать меньше циклов, а разные типы тканей могут обладать уникальными характеристиками, влияющими на окрашивание. Эти ограничения можно оценить с помощью одноцикловых окрашиваний белка или РНК и устранить до запуска Bex-Plex. Секционирование на хромированные квасцевые стекли значительно улучшит прицепление тканей и структурную целостность, но автофлуоресценция является важным фактором для всех иммунофлуоресцентных методов. Кроме того, в настоящее время протокол не был проверен на клинических образцах FFPE или на людях и потребует дальнейшей оптимизации для таких приложений. Однако, учитывая, что IBEX и RNAscope преимущественно проводятся на формалин-фиксированных парафиновых (FFPE) тканях, возможно, что Bex-Plex может расшириться на эти типы образцов. Успешная реализация потребует дальнейшей оптимизации поиска антигена и, возможно, целевых этапов извлечения для сохранения качества РНК.

В целом, Bex-Plex предлагает простой, экономичный и широко доступный метод пространственного анализа высокого уровня. Этот метод особенно подходит для таких применений, как анализ микросреды опухоли, профилирование иммунных клеток и пространственное картирование сигнальных взаимодействий. Такой интегрированный подход расширяет возможности исследовать механизмы иммунной регуляции, гетерогенность опухолей и терапевтическую реакцию на широком спектре экспериментальных моделей. Bex-Plex будет бесценен в тех случаях, когда необходимо изучать перекрёстные помехи между клетками целостных тканей, например, в микроокружении опухоли или в других тканях во время воспаления и гомеостаза. В частности, возможность разрешать пространственную динамику цитокиновой сигнализации путём поиска транскриптов кратковременных молекул в сочетании с фенотипическими белковыми маркерами позволит более глубоко понять клеточные взаимодействия между заболеваниями. Будущие улучшения могут включать увеличение вместимости мультиплексов, интеграцию с автоматизированными конвейерами анализа изображений и адаптацию клинических образцов биопсий, расширяя рабочий процесс с добавлением тканей FFPE.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 мл микроцентрифужные пробирки	Biopioneer	MCNT-1.5F
200 доказательств EtOH	Fisher Scientific	BP28184
20X SSC буфер	Invitrogen	AM9765
24-лунковые пластинки
Alexa Fluor 488 анти-мышиный CD11b антиген	Biolegend	101217
Alexa Fluor 523 анти-мышиный CD3e антиген	Invitrogen	58-0032-82
Alexa Fluor 647 анти-мышиный Ly6G антиген	Biolegend	127610
Alexa Fluor 700 анти-мышиный CD68 антиген	Biolegend	137025
BD Cytofix/Cytoperm фиксация и пермеабилизирующий раствор	BD	554722
Chrome alum желатин	Fisher	NC1692262
Конфокальный микроскоп (напр. Leica Stellaris)
Криостат	VWR	25608-922
Криостат (напр. CryoStar NX50 Cryostat)	Thermofisher Scientific	957100
Лезвия криостата (напр. Leica Low Profile Disposable Blades DB80LX)	Leica Biosystems	14035843496
DAPI	Thermofisher Scientific	62248
Диссекционный микроскоп (напр. Zeiss SteREO Discovery.V8)
Инструменты для диссекции
Сухой лед
Емкость для окраски слайдов (напр. Simport Scientific EasyDip Slide Staining Jars)	Fisher Scientific	22-038-489
Fluoromount-G	Fisher	OB10001
Нагреваемая водяная баня
Гистологические щетки (напр. Ted Pella Camel Hair Brushes)	Fisher Scientific	NC2023341
Гибридизационная печь (напр. HybEZ II Hybridization System)	ACD	321710
Программное обеспечение для анализа изображений по выбору
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen	Vector Laboratories	H-4000
Kimwipes	VWR	21905-026
Борогидрид лития	STREM Chemicals	93-0397
Микропипетки (P-10, P-20, P-200, P-1000)
Микроцентрифуга (напр. Corning LSE Mini Microcentrifuge)	Corning	6770
Mouse BD Fc Block	BD	553142
Крышки для слайдов № 1.5	VWR	48393-241
Наконечники для пипеточек (P-10, P-20, P-200, P-1000)
RNAscope HiPlex Probe, mm-CD274-T7	ACD	420501-T7
RNAscope HiPlex Probe, mm-IL-10-T6	ACD	317261-T6
RNAscope HiPlex12 Reagents Kit v2 (включает набор для обнаружения, раствор для расщепления, протеазные реагенты, реагенты для извлечения целевых веществ и буфер для промывания)	ACD	324409
RNAscope Protease III	ACD	322337
RNase ZAP	Millipore Sigma	R2020-250
Simple ITK software: https://github.com/niaid/sitk-ibex
Лоток для окраски слайдов/камера влажности
Sucrose Bioxtra	Sigma	S7903-1KG
Superfrost Plus микроскопические слайды	VWR	48311-703
Tissue-Tek OCT	VWR	25608-930
Tween-20, молекулярно-биологического сорта	Promega	H5152
UltraPure DNase/RNase свободная вода	Fisher Scientific	10977023