Методическая статья

Модель травмы гипоксии и реоксигенации в самособирающихся кардиоидах человека

DOI:

10.3791/70310

⸱

17 марта 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, Duke University School of Medicine, 2Department of Pathology, Duke University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Самособирающиеся сердечно-сосудистые органоиды человека (hCO) — это новая система моделирования развития сердца и заболеваний человека. Здесь приведена методология генерации и повреждения HCO с гипоксиано-реоксигенацией, а также детали ожидаемых гистологических и функциональных исходов после травмы.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Без быстрой реваскуляризации ишемическая болезнь сердца приводит к необратимой потере кардиомиоцитов, образованию рубцов и снижению сердечной функции. Возможность моделировать травмы гипоксии и реоксигенационные повреждения и оценивать возможные терапевтические вмешательства в человеческих тканях остаётся неудовлетворённой потребностью. Человеческие кардиорганоиды (hCO) — это новая модельная система, но начинать работу с hCOs может быть сложно из-за их небольших размеров, требований к суспензионной культуре и вариативности эффективности дифференцировки. Этот протокол предлагает удобное руководство по созданию и обслуживанию самособирающихся hCO, основанных на iPSC; методы обработки и гистологического анализа HCO; а также подход к повреждению hCOs с помощью гипоксии-реоксигенации, имитирующий фиброз и апоптоз, наблюдаемые при ишемии/реперфузии человека. Этот протокол предоставляет рекомендации по использованию hCOs в качестве дополнения к животным моделям ишемии-реперфузионного повреждения и может использоваться для выявления и тестирования факторов, способных ускорить восстановление миокарда человека.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ишемическая болезнь сердца является одной из ведущих причин заболеваемости и смертности во всём мире, затрагивая не менее 20,5 миллионов человек только вСоединённых Штатах 1,2,3. Без адекватной перфузии продолжительная гипоксия приводит к гибели кардиомиоцитов (КМ) и дисфункции миокарда. Ишемия миокарда в основном лечится реваскуляризацией с помощью чресутанного вмешательства, тромболитической терапии или коронарного шунтирования артерии. Однако реваскуляризация — это палка о двух концах, которая может вызвать дополнительные повреждения за счёт высвобождения реактивного кислорода 4,5. Хотя стратегии реперфузии оказались чрезвычайно успешными, методы ограничения потери КМ при ишемических повреждениях или после реперфузии оказались менее уловимыми. Хотя многие попытки спасти инфарктную ткань оказались эффективными на животных моделях ишемии-реперфузии, эти же методы в значительной степени не дали значительной пользы в испытаниях на людях, что вызвало необходимость в людских моделях для оценки терапии, сохраняющих или восполняющих CM6,7,8,9,10,11,12.

Человеческие платформы, используемые для моделирования сердечных повреждений, включают первичные ткани и системы, основанные на индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) 13,14. Поскольку первичные ткани ограничены доступностью образцов, системы hiPSC стали доминирующей человеческой платформой для моделирования сердечных заболеваний, с явными преимуществами генетически управляемой имасштабируемой 15,16,17,18,19. Традиционные 2D культуры кардиомиоцитов, полученных из hiPSC (hiPSC-CM), ограничены незрелостью полученных КМ, отсутствием сложной тканевой архитектуры и неспособностью воспроизводить полное клеточное разнообразие, присутствующее в человеческомсердце 15,20. Для устранения этих недостатков всё чаще применяются инженерные 3D-сердечные ткани (EHT) 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26. Методы EHT включают смешивание предварительно дифференцированных сердечных клеток всфероиды 24 или посев дифференцированных сердечных клеток в каркасы илиформы 21,22,27. Хотя EHT лучше моделируют гетеротипические клеточные взаимодействия и обладают относительно большей зрелостью, чем двумерные культуры, требования к индивидуальным каркасам или биореакторам для создания и обслуживания EHT в настоящее время ограничивают ихмасштабируемость 21,27,28.

Самособирающиеся сердечно-сосудистые органоиды (hCOs), или кардиоиды, — это новая и мощная модель человека in vitro 20,25,26,29. HCO имеют несколько преимуществ. Во-первых, они могут включать несколько типов клеток, включая эндотелиальные клетки, фибробласты и эпикардиальные клетки, без необходимости использования нескольких специализированных протоколов дифференцировки26, 29 и 30. Во-вторых, большая часть их дифференцировки происходит в 3D-суспензионной культуре, что исключает требования к специализированным формам или тканевымматриксам 25,26,29,30. Наконец, hCo имеют стереотипную сферическую морфологию с центральной полостью, что позволяет проводить морфологический анализ. Таким образом, HCO имеют масштабируемость, аналогичную двумерным системам культуры, при этом сохраняя часть тканевой сложности EHT. hCOs применялись для тестирования на токсичность лекарств, моделирования специфических заболеваний для пациентов и моделирования аспектов развитиясердца 20,26,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39 . Хотя это многое обещает, HCO имеют ряд ограничений по сравнению с EHT, включая невозможность непосредственно измерять силу. Кроме того, в описанных моделях hCO отсутствует нативная популяция иммунных клеток, хотя возможно заселить hCOs макрофагами. Тем не менее, hCOs — это развивающаяся и быстро развивающаяся человеческая модельнаясистема 20, 26, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39.

На сегодняшний день моделирование сердечно-сосудистых повреждений с помощью hCOs было ограниченным. Была описана модель криотравмы, но травмы сильно варьируются, и необходимость индивидуальных повреждений hCOs ограничиваетмасштабируемость до 29. В этой рукописи описывается удобный протокол для создания и повреждения самособирающихся hCOs с гипоксией-реоксигенационным (H/R). По сравнению с другими протоколами генерации hCO, этот протокол использует упрощённую среду дифференцирования и включает стратегию дифференцировки 2D-3D мезодермы, описанную Хофбауэром и др.29. Протокол при повреждении H/R можно проводить в любое время после начала биения hCO, что обычно происходит примерно на день дифференцировки 8 (D8) на D11. Длительность СМ можно титровать от 6 до 24 часов для достижения желаемого уровня травмы — от минимальной до почти полной потери СМ. Кроме того, у HCO стереотипно формируется коллагеновое ядро с клетками Vimentin+ , после травмы H/R, что также масштабируется по тяжести с длительностью H/R. Эта высокопроизводительная, масштабируемая модель hCO травм потенциально решает необходимость человеческих моделей для разработки и тестирования новых терапевтических направлений для стимулирования восстановления или регенерации КМ после травмы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры обращения с человеческими клетовыми линиями должны соответствовать местным протоколам биобезопасности. Все эксперименты проводились с использованием линии клеток iPSC DU11, которая получается из здоровых новорождённых мужских фибробластов основным центром iPSC в Университете Дьюка.

1. Генерация HCO

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается стандартный протокол генерации hCOs из iPSC (рисунок 1). Все этапы, описанные в этом протоколе, должны выполняться в ламинарной вытяжке для обеспечения стерильности. См. Таблицу 1 для рецептов дифференциационных сред.

ДеньКонцентрация запасовРабочая специализацияКоэффициент разбавленияБазовые медиа
D010 мМ CHIR9902110 мкм CHIR990211:1000RPMI-1640, 2% B27 минус инсулин
100 мг/мл аскорбиновой кислоты50 мкг/мл аскорбиновая кислота1:2000
10 мг/мл Activin A60 нг/мл Activin A1:167
D15 мМ IWP25 мкм IWP21:1000RPMI-1640, 2% B27 минус инсулин
100 мг/мл аскорбиновой кислоты50 мкг/мл аскорбиновая кислота1:2000
D25 мМ IWP25 мкм IWP21:1000RPMI-1640, 2% B27 минус инсулин
100 мг/мл аскорбиновой кислоты50 мкг/мл аскорбиновая кислота1:2000
10 мМ Тиазовивин2 мкм Тиазовивин1:5000
D35 мМ IWP25 мкм IWP21:1000RPMI-1640, 2% B27 минус инсулин
100 мг/мл аскорбиновой кислоты50 мкг/мл аскорбиновая кислота1:2000
D45mM IWP25 мкм IWP21:1000RPMI-1640, 2% B27 минус инсулин
D6+Н/ДН/ДRPMI-1640, 2% B27 плюс инсулин

Таблица 1: Таблица дифференциационных сред . Концентрации запасов, рабочие концентрации и коэффициент разбавления для каждого фактора дифференцировки через дифференциационные дни 0-6. Готовьте все рабочие растворы свежими к моменту кормления.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Схема дифференциации hCO. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

  1. Обслуживание iPSC
    1. Полностью закройте дно каждой скважины пластины с 12 лунками матрицей базальных мембран в соотношении 1:100, разбавленной в холодных средах DMEM/F12. Инкубировать обработанные пластины при 37 °C в течение 1 часа для полимеризации. Если не использовать сразу, пластины можно запечатать пленкой, хранить при 4 °C до 2 недель и инкубировать не менее 60 минут при 37 °C перед использованием.
  2. День дифференцировки -3 (D-3): покрытие iPSC для последующего дифференцирования
    1. Подготовьте пластины с матричным покрытием базальной мембраны, как описано в шаге 1.1.1.
    2. Аспирируйте поддерживающую среду из культуры iPSC и добавьте достаточно раствора для отслоения клеток, чтобы полностью покрыть клетки (~500 мкл на каждую яме пластины с 12 лунками или 1 мл на каждую яме пластины с 6 луцами). Инкубировать при 37 °C в течение 5 минут.
    3. Добавьте в каждую скважину одинаковый объём среды iPSC и аккуратно постукуйте по пластине, чтобы помочь отделить ячейки. Наклоните пластину к себе и аккуратно пипетируйте вверх и вниз по дну колодца, чтобы дополнительно отсоединить прилипшие элементы, не более трёх раз. Используйте пипетку, чтобы переместить подвеску ячейки в коническую трубку объёмом 15 мл.
    4. Пеллетные ячейки центрифугированием при 300 x g в течение 3 минут при комнатной температуре в качающейся ведрообразной центрифуге. Аспирируйте и аккуратно суспендуйте клетки в 1 мл поддерживающей среды iPSC.
    5. Переместите 10 мкл суспензии ячейки в новую микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл. Добавьте 10 мкл Trypan blue и пипетку для смешивания. Добавьте 10 мкл смеси iPSC/Trypan blue в гемоцитометр и подсчитайте живые клетки.
    6. Разбавить суспензию клетки до конечной концентрации 100 000–200 000 клеток/мл в среде поддержания iPSC с помощью ингибитора ROCK (ROCKi). Добавьте 1 мл/скважину суспензии ячейки в каждую яму, покрытую 12-лунной пластиной, покрытой матрицей базальной мембраны.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность покрытия до дифференцировки зависит от скорости роста заданной клеточной линии. Плотность покрытия может потребовать корректировки для каждой линии iPSC. Концентрацию ROCKi может потребовать титрировать в зависимости от используемой марки или формулы.
  3. Дифференциация D-2: Обмен средой для удаления ROCKi
    1. Обменять носители на 1 мл свежего iPSC для обслуживания без ROCKi. Клетки должны начать формировать небольшие колонии. Колонии должны выглядеть плоскими (рисунок 2A). Если клетки выглядят как булыжники, тонкие или удлинённые, это признак спонтанной дифференцировки, и эффективность дифференцировки может быть снижена.
  4. Дифференцировка D-1: Продолжать инкубировать клетки без лечения.
  5. Дифференцировка D0: начало дифференцировки и индукции мезодермы
    1. С помощью микроскопа проверьте плотность клеток, чтобы обеспечить 70%-90% слияния (рисунок 2B) во время дифференцировки. Если субслияние, кормите клетки поддерживающей средой iPSC и ждите 24 часа. Если клетки слишком слияются, разделите их, как в шаге 1.2
    2. Подготовьте 12 мл на 12-луночную пластину индукционной среды D0 мезодермы (10 мкм CHIR99021, 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты, 60 нг/мл Активина А в RPMI-1640 с добавлением 2% витамина B27 минус инсулина (RB-)).
    3. Удалите существующие материалы и замените на 1 мл/скважину индукционного медиа D0 мезодермы. Обратите внимание на время обмена медиа.
  6. Дифференцировка D1: спецификация сердечной мезодермы
    1. Ровно через 24 часа после добавления индукционной среды D0 мезодермы обменивайте среду на среду спецификации сердечной мезодермы D1 (5 мкм IWP2, 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты в RB).
  7. Дифференцировка D2: образование hCO
    1. Добавьте достаточно реагента для диссоциации клеток, чтобы покрыть клетки, и инкубировать при 37 °C в течение 5 минут (рисунок 2C). Добавьте равный объём сердечной мезодермической среды D2 в каждую скважину и аккуратно пипетируйте вверх и вниз, чтобы освободить приклеенные клетки. Перенесите подвеску ячейки в коническую трубку объёмом 15 мл.
    2. Гранулированные элементы центрифугой при 300 х г в течение 3 минут при комнатной температуре. Ресуспендирование в 1 мл среды спецификации сердечной мезодермы D2 (5 мкм IWP2, 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты в RB-).
    3. Возьмите 10 мкл суспензии элемента и добавьте к ней 10 мкл синего трипана. Считайте ячейки любым предпочтительным способом. Разбавить клетки до концентрации 100 000 клеток/мл в среде специфического сердечного мезодерма D2 с 2 мкм тиазовивина. Используйте 10 мл суспензии ячейки на 96-луночную ультра-низко-крепкую пластину.
    4. Переместите суспензию ячейки в соответствующий реагентный резервуар и используйте многоканальную пипетку для передачи по 100 мкл в каждую скважину ультранизкой прикреплённой пластины с 96 лунками, что обеспечивает итоговую концентрацию 10 000 элементов на скважину.
    5. Для индуцирования образования hCO в суспензионной культуре центрифугные пластины при 500 x g в течение 5 минут при комнатной температуре. После центрифугирования образуется большая гранула клеток (рисунок 2D) — если эта гранула не ограничена, центрифугирование повторяется.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не все клетки будут инкорпорироваться в hCO, который будет выглядеть как ограниченная клеточная гранула, при этом отдельные клетки будут видны на микроскопии яркого поля. Некоторые одиночные обломки в плите вокруг hCO — это нормально.
  8. Дифференциация D3: добавление среды для разведения ROCKi
    1. Подготовьте 10 мл среды D3 (5 мкм IWP2, 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты в RB-) на одну пластину. Используя многоканальную пипетку, добавьте 100 мкл среды D3 в каждую яму, не удаляя носителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе HCO конденсируются в тёмную, чётко очерченную сфероидную форму. Отдельные ячейки не будут видны (рисунок 2E).
  9. Дифференцировка D4: Обмен на носители D4
    1. Удалите 100 мкл среды D3 и замените на 100 мкл среды D4 (5 мкм IWP2 в RB-). Чтобы снизить риск аспирации, наклоните пластину к себе примерно под углом 45° и держите многоканальную пипетку под углом примерно 90° относительно боковой стенки пластины. Разместите многоканальную пипетку плотно на боковой стенке скважины и медленно аспирируйте 100 мкл среды, периодически проверяя кончики пипетки на наличие атмосферных hCO.
      ПРИМЕЧАНИЕ: hCo находятся в суспензионной культуре, и аспирирование hCOs при удалении среды — обычное явление. Чтобы снизить риск аспирации, наклоните пластину к себе примерно под углом 45° и держите многоканальную пипетку под углом примерно 90° относительно боковой стенки пластины. Разместите многоканальную пипетку плотно на боковой стенке скважины и медленно аспирируйте 100 мкл среды, периодически проверяя кончики пипетки на наличие атмосферных hCO.
    2. Замените на 100 мкл носителя D4.
  10. Дифференциация D6: среда обслуживания hCO
    1. Удалите 100 мкл среды D4 и замените на 100 мкл среды D6+ (RPMI-1640 с 2% B27 Supplement (RB+)).
  11. Дифференцировка D8
    1. Продолжайте обмениваться носителями каждые 2 дня, удаляя 100 мкл и заменяя на 100 мкл свежего носителя D6+. hCOs должны увеличиваться, сохранять гладкие края и начинать биться примерно на D6-11, если их успешно дифференцировать (рисунок 2F). hCOs по-прежнему будут выглядеть как тёмные, хорошо очерченные сфероиды, и отдельные клетки не будут видны.

figure-protocol-2
Рисунок 2: Хронология дифференцировки hCO. Хронология дифференцировки органоидов. (A) колонии iPSC за 1 день до начала дифференцировки (D-1). Обратите внимание на отчетливые, плоские колонии. (B) iPSC в день начала дифференцировки (D0) при ~90% совпадении. (C) Органоид при дифференцировке D2 сразу после формирования органоидов в 96-колодной ультранизкой пластине прикрепления. Стрелка обозначает пример игольчатых кристаллов IWP2. (D) Органоиды на дифференцировке D3. Обратите внимание на значительное уплотнение органоидов из-за образования клеточно-клеточного соединения; На этом этапе нормально происходит неотключённый элементарный мусор. (E) Органоиды при дифференциации D10. (F) Стрелка указывает на колонию iPSC с вытянутыми, тонкими клетками с булыжной формой, что указывает на возможную спонтанную дифференцировку. Шкала = 1000 мкм для панелей A-E, шкала = 400 мкм для панели F. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

2. Сбор и фиксация hCOs для иммунного окрашивания

  1. Используя пипетку объемом 1000 мкл с отрезанным кончиком, передаёте hCOs в микроцентрифугную трубку объемом 1,7 мл. После того как все hCOs будут перенесёны, дождитесь, пока hCOs опустятся на дно трубки, и аккуратно удалите лишние слои. Промой hCOs 1 раз PBS, подождите несколько секунд, пока hCOs опустятся на дно трубки, и аккуратно удалите лишки PBS.
  2. Фиксируйте hCOs 4% PFA на 30 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые антитела могут требовать фиксации ацетона или метанола для оптимальной эффективности. Обратитесь к правилам производителя.

3. Иммунокрашивание с цельным креплением

  1. Перенесите необходимое количество фиксированных HCO в микроцентрифугную трубку объёмом 1,7 мл. Удалите фиксирующий раствор и промывайте PBS с содержанием 0,1% Tween-20 (PBS-T).
    1. Чтобы мыть hCO, удалите как можно больше излишков фиксативного средства. Будьте осторожны, чтобы не потревожить hCOs на дне трубки. Добавьте ~1 мл PBS-T и подождите несколько секунд, пока hCOs опустятся на дно трубки, прежде чем перейти к следующему этапу.
  2. Разбавить первичное антитело до нужной концентрации в растворе для окрашивания (10% сыворотки новорождённого телячьего телля, 1% DMSO в 0,1% PBS-T). Добавьте 50-100 мкл раствора первичных антител в пробирку микроцентрифуги (или достаточно объёма, чтобы покрыть все hCOs в каждой пробирке).
  3. Инкубировать 24 часа при 4 °C на шейкере/рокере. Удалите избыточное первичное антитело, а затем проведите три промывки в PBS-T при комнатной температуре. Проведите финальную промывку ночью в PBS-T при 4 °C, чтобы убедиться, что избыток антител удален.
  4. Разведите вторичные антитела до нужной концентрации в растворе для окрашивания и добавьте 50-100 мкл раствора антител в каждую пробирку микроцентрифуги (или достаточно объёма, чтобы покрыть все hCOs в каждой пробирке).
  5. Инкубировать hCOs с вторичным антителом в течение 24 часов при 4 °C на дрожащей платформе. Удалите избыток вторичных антител и затем проведите три промывания в PBS-T при комнатной температуре. Проведите финальную промывку на ночь в PBS-T при 4 °C, чтобы убедиться, что все избыточные антитела удалены.
  6. Для полноценной монтажной обработки переносите HCO с помощью пипетки объемом 1000 мкл, с отрезанным кончиком, на положительно заряженный стеклянный затвор. Удалите лишний PBS-T и добавьте несколько капель монтажного материала, чтобы покрыть hCO. Аккуратно разместите крышку, чтобы выровнять водонагреватели.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы сохранить 3D-архитектуру hCO, используйте резиновую прокладку или двустороннюю ленту по краям затвора, чтобы поднять высоту скольжения крышки. Использование монтажного средства для прочистки может помочь улучшить изображение через HCO, особенно если hCOs не сплющены.

4. Секционирование и вложение

  1. После фиксации накройте hCOs сахарозой 30% на ночь при 4 °C для криозащиты. Используя пипетку объёмом 1000 мкл с отрезанным кончиком, переложите нужное количество hCOs в пластиковую форму размером 12 мм x 12 мм. Аккуратно удаляйте лишний раствор сахарозы, стараясь не аспирировать hCO.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полезно пипетить 30% сахарозы вверх и вниз в кончике пипетки перед перемещением, чтобы предотвратить прилипывание hCOs к боковой стороне наконечника.
  2. Добавьте небольшую каплю OCT, ровно столько, чтобы покрыть HCO. Используя тонкий пинцет или наконечник пипетки, аккуратно переместите hCOs в OCT так, чтобы hCOs не слипали друг с другом и не было hCOs у краёв формы. Убедитесь, что все hCOs расположены как можно ближе к дну формы, чтобы максимизировать количество hCO, обнаруженных в одной криосекции.
  3. Заморозьте этот первый слой ОКТ, поместив форму в пенопластовый охладитель с слоем сухого льда внизу. Подождите несколько минут, пока OCT затвердеет, а затем перенесите форму с сухого льда на стол. Добавляйте дополнительный ОКТ, пока форма не заполнится. Дождитесь, пока первый слой ОКТ полностью растает, прежде чем возвращаться к сухому льду.
  4. Храните замороженные, встроенные HCO при -80 °C до готовности к криосецированию.
  5. Когда будете готовы к секции, максимально выровняйте блок hCO и начните обрезать блок. Периодически размещайте секцию на заряженном стекле и визуально осматривайте каждую секцию на наличие hCO. При визуализации hCO, переходите на сечения размером 6 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость потери hCo при вложении и сечении составляет не менее 10%. Планируйте соответственно.

5. TUNEL и иммунокрашивающие срезы тканей

  1. Используйте пап-ручку, чтобы нарисовать гидрофобную рамку вокруг участков тканей, которые нужно окрашивать. Промывайте слайды один раз в PBS 0,1% Tween (PBS-T) для растворения OCT.
  2. Добавьте блокирующий буфер (10% сыворотки для новорождённых, 1% DMSO, в PBS-T) на 1 час при комнатной температуре.
  3. Приготовьте первичный раствор антител. Начните с рекомендованной производителем концентрации для иммунофлуоресценции, но концентрацию, возможно, потребуется эмпирически титрировать.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, окрашивание TUNEL может проводиться в это время согласно протоколу производителя.
  4. Уберите блокирующий буфер с затвора. Добавьте достаточное количество раствора первичных антител, чтобы покрыть срезы hCO. Инкубировать первичные антитела за ночь при 4 °C или 3 часа при 37 °C. Стирите слайды три раза по 5 минут в банке Coplin, наполненной PBS-T комнатной температуры.
  5. Приготовьте вторичный раствор для окрашивания антител в блокирующем буфере, включая DAPI или другой панядерный маркер. Добавьте достаточно вторичного раствора для окрашивания антител, чтобы покрыть срезы hCO. Инкубировать защиту от света в течение 1 часа при комнатной температуре.
  6. Промывайте слайды три раза в течение 5 минут в банке Coplin, наполненной PBS-T комнатной температуры. Крепите с помощью накладки с нужным монтажным материалом.

6. Количественная оценка колокализации ядра с помощью CardioCount

ПРИМЕЧАНИЕ: CardioCount — это метод глубокого обучения для оценки ядер CM помикроскопическим изображениям 40. Изначально разработанный для оценки циклирования КМ, CardioCount хорошо работает при нескольких ядерных окрасках, включаяTUNEL 40.

  1. Чтобы использовать CardioCount, скачайте пакет CardioCount с GitHub или импортируйте его в Google Colab (https://github.com/karraresearchgroup/CardioCount.git, https://drive.google.com/file/d/13iwp9JoHPhs2ONSFkZTGxbEXCGwBFVYx/, https://drive.google.com/drive/folders/1-f9h7MvCBsiCngJnV8-f_lplAJpUeeE3). CardioCount Version 1 работает на среде Python 3.
  2. Экспортировать изображения для количественной оценки в виде отдельных файлов .tif размером 512 x 512 пикселей с объединёнными красными, синими и зелёными каналами, где красный канал — это CM-ядерный маркер, синий — общий ядерный маркер, а зелёный — цикличный ядерный маркер (например, Ki67) или апоптотический маркер (TUNEL). Создайте родительскую папку в Google Drive для этого эксперимента и загрузите объединённые tiff-файлы как подпапку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: CardioCount был обучен на ядерных пятнах, заполняющих ядро. Более точные циклические маркеры, такие как Aurora B или PH3, могут быть несовместимы с CardioCount.
  3. Откройте CardioCount Notebook в Google CoLab. Запустите ячейку 1.1, чтобы проверить доступ к графическому процессору (GPU). Запустите Cell 1.2, чтобы подключить CoLab Notebook к Google Drive.
  4. Запустите Cell 1.3, чтобы загрузить CardioCount и зависимости в Google Colab. Отредактируйте kfile, чтобы прочитать название пути до места, где была сохранена папка PRODUCTION_LVADMLPaper_Colab_Libraries при скачивании.
  5. В ячейке 2.0 редактировать base_folder, чтобы прочитать название пути в родительскую папку, содержащую подпапку с изображениями для анализа. Запустите Cell 2.0, чтобы связать эту папку с CoLab.
  6. В ячейке 2.1.1 редактировать orig_image_folder, чтобы совпадать с именем папки с изображениями для анализа. Отредактировать channel_to_remove для чтения зелёного и отредактировать new_image_folder, чтобы назвать подпапку под base_folder, где будут сохранены все изображения с удаленным зелёным каналом (красный/синий). Повторите этот шаг, чтобы удалить красный канал, обязательно отредактируя new_image_folder, чтобы отличить подпапку с изображениями с удаленным красным каналом (зелёный/синий).
  7. В ячейке 2.1.2 обрезайте изображения до 512 x 512 для красно-синих изображений. Убедитесь, что uncropped_image_folder совпадает с именем new_image_folder, созданным в шаге 6.6. для красно-синих изображений. Имя destination_image_folder, чтобы обозначить подпапку, где будут сохранены красные/синие изображения. Повторите этот шаг, чтобы обрезать зелёные/синие изображения. Наконец, повторите этот шаг, чтобы обрезать оригинальные 3-канальные объединённые фразы, которые были в base_folder.
  8. Запустите ячейку 2.2 для генерации вероятностных отображений. Название data_specific_folder названием красных/синих и зелёно-синих изображений, сгенерированных в destination_image_folder из Cell 2.1.2. Для model_dir введите путь файла в папку, содержащую модели сегментации. Для сегментации красных ядер используйте модель erg_rb_opt и вход 200 для эпохи. Переименуйте probmap_directory_name, чтобы обозначить папку, где будут сохраняться карты вероятностей красных/синих. Повторите этот шаг для зелёных/синих изображений. Для сегментации зелёных ядер используйте модель edu_mouse_bg_opt и введите 100 для эпохи.
  9. В ячейке 2.3.1 будут созданы отображения объектов на основе вероятностных отображений, сгенерированных на шаге 6.8. input_folder будет назван в честь destination_image_folder из ячейки 2.1.2, содержащего изображения вероятностей красного и синего формата, сгенерированные в ячейке 2.1.2. Назовите output_folder, где будут храниться пороговые красные и синие изображения. Установите порог уровня доверия для ядерной сегментации (диапазон 0,0-1,0). Запусти ячейку 2.3.1. Повторите этот шаг для зелёных/синих изображений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пороги для уровня доверия к ядрам зависят от набора данных. Начинайте с порога 0,9 и корректируйте выше, если слишком мягко, и ниже, если слишком строго, исходя из случайного анализа вероятностных карт.
  10. В ячейке 2.3.2 количество ячеек в объектных картах, сгенерированных на шаге 6.10, будет подсчитано и экспортировано в .csv файл. count_folder будет назван в честь output_folder из Cell 2.3.1, где сохраняются пороговые изображения красного и синего. Чтобы исключить объекты, касающиеся границы изображения, убедитесь, что ignore_border_cells читается как True. Переименуйте csv_path в название пути base_folder, где хранятся все подпапки. Отредактируйте название csv, чтобы отражать количество красных/синих объектов. Повторите этот шаг для синих/зелёных изображений.
  11. В ячейке 2.4 будут подсчитаны зелёные/красные двойные положительные ядра. Переименуйте img_folder в название подпапки, сгенерированной на шаге 6.8, содержащей обрезанные изображения с тремя каналами. Переименовать childcell_folder в output_folder из ячейки 2.3.1, где сохраняются пороговые красные и синие изображения. Переименовать parentcell_folder в output_folder из ячейки 2.3.1, где сохраняются пороговые зелёно-синие изображения. Переименовать dest_folder, чтобы обозначить папку, где будут сохраняться двойные положительные объектные карты. Переименуйте csv_path, чтобы назначить имя пути и файла base_folder, где хранятся все подпапки, и отредактировать имя csv, чтобы отразить количество объектов с двойной положительностью.
  12. Проверьте точную сегментацию, сравнив количество красных, зелёных и двойных положительных результатов, полученных на каждом изображении, с исходным изображением.
    1. Если CardioCount стабильно завышает количество ядер на изображении относительно того, что подсчитал бы ослеплённый рецензент, повторите шаг 6.9 с более высоким порогом доверия и повторите шаги 6.10–6.11. Если CardioCount недооценивает количество ядер на изображении относительно того, что учёт слепой рецензент, повторите шаг 6.9 с более низким порогом доверия и повторите шаги 6.10–6.11.
  13. Суммируем все подсчета для каждого hCO для красных ядер, зелёных ядер и двойных положительных ядер. Вычислите % циклических ядер как (двойное положительное количество ядер / всего красных CM ядер) x 100 для каждого органоида.

7. Гипоксия-реоксигенационное повреждение

  1. Подготовьте гипоксийную среду (119 мМ NaCl, 12 мМ KCl, 1,2 мМ2PO4, 1,3 мМ MgSO4, 0,5 мМ MgCl2, 0,9 мМ CaCl2, 20 мМ лактата натрия и 5 мМ HEPES, pH = 6,4)5.
  2. В колбу для клеточной культуры перенесите 5 мл гипоксийной среды на 96-колодную hCO пластину. Поместите колбу для клеточной культуры в камеру гипоксии и промывайте аноксическим газом (5%CO2, 95% N2) в течение 3 минут. Инкубировать при 37 °C не менее 1 часа перед началом гипоксии.
  3. Удалите все медиа из HCO. Начните с удаления ~150 мкл многоканальной пипеткой из всех колодц. Затем используйте пипетку объёмом 200 мкл, чтобы аккуратно удалять оставшиеся материалы из отдельных скважин, не нарушая hCO.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление всех сред из всех скважин критически важно для достижения воспроизводимых повреждений.
  4. Добавьте в каждую скважину по 50 мкл среды гипоксии. Поместите пластину hCO в камеру гипоксии и промите аноксический газ (5% CO2, 95% N2) в течение 3 минут. Поместите камеру гипоксии в инкубатор при 37 °C на 6 часов.
  5. Для начала реоксигенации удалите hCOs из камеры гипоксии и подайте 150 мкл предварительно нагретой среды RB+. Дайте минимум 3 часа реоксигенации при 37 °C перед проведением анализов по следующему потоку.

8. Анализ на высвобождение лактатдегидрогеназы

  1. Собрать 20 мкл материала из скважин повреждённых и нездоровых HCO в нужное время после начала реперфузии. Разбавить 1:10 в 180 мкл буфера хранения LDH (200 мМ Tris-HCl (pH 7,3), 10% глицерола, 1% BSA). Храните при -20 °C до готовности к анализу. Несколько раз поднимайте и опускайте пипеты, чтобы смешивать материалы перед сбором
  2. Разморозить замороженные носители. Добавьте 45 мкл буфера LDH в одну из пластин с чёрной стенкой, прозрачной нижней пластиной на 96 лунок для каждого образца среды, который будет анализироваться. Добавьте 5 мкл разбавленной среды 1:10 в каждую скважину для окончательного разведения 1:100. Подготовьте реагент для обнаружения ЛНГ, смешивая 50 мкл смеси ферментов для обнаружения ЛНГ и 0,25 мкл субстрата редуктазы для каждого образца, который будет анализироваться.
  3. Добавьте 50 мкл реагента для обнаружения LDH в каждую скважину с разбавленной средой 1:100. Инкубировать при комнатной температуре, защищённой от света, в течение 60 минут. Анализ биолюминесцентного сигнала на совместимом считывателе пластин.

9. Кальциевая визуализация

  1. Приготовьте раствор для окрашивания с кальциевым красителем с фенолом без красного RPMI-1640, 0,04% плюрона, и 5 мкм Cal520-AM. Защищайте образцы от света.
  2. Извлеките 100 мкл среды из каждой скважины, предназначенной для кальциевой визуализации. Добавьте 100 мкл раствора для окрашивания кальция и инкубуйте при 37 °C, защищённых от света, в течение 30 минут.
  3. Удалите из каждой скважины 100 мкл среды кальциевым красителем и замените на 100 мкл фенол-красного RPMI-1640. Инкубировать 30 минут — 1 час при 37 °C, чтобы дать вымыванию краски.
  4. С помощью микроскопа с возможностью непрерывной съёмки и потоковой передачи установите 96-колодную сверхнизкой крепленную пластину в рабочее положение. С объективом 10x определите основание hCO и следите за временными изменениями Cal520.
  5. Зафиксировать 30-секундные записи кальциевых транзиентов при комнатной температуре. При использовании конфокального микроскопа невозможно сделать изображение через весь HCO. Выберите фокальную плоскость у основания hCO, где очертания клеток видны во время кальциевых переходов.

10. Анализ кальциевых транзиентов (рисунок 3)

  1. Анализ кальциевых транзиентов может проводиться с помощью различных программ для анализа пиков. Ниже приведены инструкции по анализу с использованием плагина Spiky ImageJ41 (https://pccv.univ-tours.fr/ImageJ/Spiky/).
  2. Добавьте пять областей интереса (ROI) размером 2 x 2 пикселя в Менеджер ROI по видимым ячейкам в каждом hCO. Будьте осторожны, чтобы не перекрывать ROI с ядрами клеток или границами клеток, так как движение hCO может повлиять на временный анализ.
  3. В разделе «Анализ > измерения множества» выберите «Средняя интенсивность серого». В ROI Manager выберите Multi-Measure , чтобы фиксировать среднюю серую интенсивность при всех ROI и всех кадрах записи.
  4. Сохраняйте .csv-файл с Средней серой интенсивностью для всех ROI. Сохраняйте все позиции ROI для каждого изображения для последующего использования.
  5. В новой таблице добавьте столбец для времени(ов). Вычислите время в каждом кадре, разделив 30 с на общее количество кадров, а затем умножьте на номер кадров. Сохраните это как отредактированный .csv.
  6. Откройте отредактированный .csv файл на Фиджи и откройте плагин Spiky. В разделе «Параметры анализа» выберите желаемые параметры анализа.
  7. График времени по оси X и средней серой интенсивности для ROI #1 по оси Y. Выберите «Анализировать пики» и подтвердите правильную аннотацию исходной линии, начала/конца пика и амплитуды пика. Если обнаружено неправильное количество пиков, измените параметры в параметрах анализа, включая минимальную амплитуду пика от исходной линии, и начинайте пиковый порог до успешной идентификации пика.
  8. Сохраняйте все промежуточные файлы. Удары в минуту (bpm) можно вычислить, деля 60 на среднее значение интервала от пика до пика для каждого ROI.
  9. Повторите вышеуказанный анализ для всех ROI на hCO.

figure-protocol-3
Рисунок 3: Анализ кальциевых транзиентов. (A) Красное окно указывает кнопку, открывающую выпадающее меню для выбора параметров анализа. (B) Красное поле указывает кнопку для отметки времени (или серых) и средней серой интенсивности по ROI в репрезентативном неповреждённом hCO. (C) Красное поле указывает кнопку для выбора анализа пиков. (D) Репрезентативный анализ кальциевых транзиентных следов и пиков от неповреждённого HCO. Красные треугольники обозначают максимальный пик, розовые квадраты — максимальный наклон для максимального штриха вверх и вниз, зелёный — начало пика, а синий — базовую линию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Следуя вышеуказанному протоколу, хорошо сформированные hCO, начинающие биться между днём дифференцировки с 7 по 12 (D7-12). По мере созревания hCOs после 25-го дня спонтанные сокращения могут перестать быть заметны без электрической стимуляции. H/R травмы можно проводить в любое время после того, как HCO начинают биться — обычно мы проводим травмы у 15-дневных (D15) hCOs или позже.

Подтверждение травмы
Как и инфаркт миокарда человека, повре...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь представлен пошаговый протокол для генерации и повреждения самособирающихся hCOs с помощью H/R. Ишемические заболевания сердца характеризуются патофизиологическим ремоделированием, включая гибель кардиомиоцитов, фиброзную ремоделирование, электрическую дисфункцию и функциональное снижение. Эти нарушения наблюдаются в системе моделей hCO, включая увеличение TUNEL+ CM, увеличение высвобождения LDH, увеличение площади тканей Vimentin+ , а также изменения в обрабо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа поддерживается R01 HL157277 (RK), AHA 24PRE1186062 (LP), F30 HL175908-01 (LP) и программой подготовки медицинских ученых Университета Дьюка T32 5T32GM145449-03 (LP).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Раствор аккутазыСигма-ОлдричA6964-500ML
Антисердечные антитела к тропонину ТAbcamEPR20266
Добавка B-27 (50 раз), без сывороткиGibco17504044
Добавка B-27, без инсулинаGibcoA1895602
Считыватель пластин BioTek Synergy Neo2BioTek
Cal-520, AMAAT Bioquest21131
CardioCount V1Karra LabПМИД: 38984052
Клеточная линия (Homo sapiens, самец) — линия iPSC DU11Ядро стволовых клеток Университета Дьюка
Заряженные микроскопические стекла, белое стеклоVWR89500-496
CHIR 99021Токрис4423
CloneRТехнологии STEMCELL5888
Микропластины Corning с 96 скважинами с прозрачным ультранизким креплениемФишер7007
Одноразовые пипетные резервуарыVWR89094-678
DMEM/F-12, HEPESGibco11330057
Флуоресцентный микроскоп EVOSEVOS
Матрица базальных мембран с пониженным фактором роста Geltrex, не содержит LDEV, квалифицирована как стволовые клеткиGibcoA1413302
Рекомбинантный белок человека АктивинPEPROTECH INC/Life Technologies120-14E-50UG
IWP-2Технологии STEMCELL72124
L-аскорбиновая кислота (кристаллический/сертифицированный ACS)Fisher ScientificA61-100
Мышиный анти-виментинDSHBAMF-17b
mTeSR PlusТехнологии STEMCELL100-0276
Многоколодящие клеточные культивные пластины и панели; 12 КолодецVWR10062-894
Pluronic F-127Сигма-ОлдричP2443
ReLeSRТехнологии STEMCELL100-0483
RPMI 1640 MediumGibco11875119
RPMI 1640 Medium, без фенол-красногоGibco11835-030
ТиазовивинТехнологии STEMCELL72254
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSAKURA FINETEK USA INC (VWR)25608-930
Вращающийся дисковый конфокальный микроскоп ZeissZeiss

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bozkurt, B., et al. Heart failure epidemiology and outcomes statistics: A report of the Heart Failure Society of America. J Card Fail. 29 (10), 1412-1451 (2023).
  2. Groenewegen, A., Rutten, F. H., Mosterd, A., Hoes, A. W. Epidemiology of heart failure. Eur J Heart Fail. 22 (8), 1342-1356 (2020).
  3. Ss, M., et al. 2025 heart disease and stroke statistics: A report of us and global data from the american heart association. Circulation. 151 (8), e41-e660 (2025).
  4. Sebastião, M. J., et al. Bioreactor-based 3d human myocardial ischemia/reperfusion in vitro model: A novel tool to unveil key paracrine factors upon acute myocardial infarction. Transl Res. 215, 57-74 (2020).
  5. Chen, T., Vunjak-Novakovic, G. Human tissue-engineered model of myocardial ischemia-reperfusion injury. Tissue Eng Part A. 25 (9-10), 711-724 (2019).
  6. Frangogiannis, N. G. Why animal model studies are lost in translation. J Cardiovasc Aging. 2 (2), 22(2022).
  7. Forrest, M. J., et al. Torcetrapib-induced blood pressure elevation is independent of cetp inhibition and is accompanied by increased circulating levels of aldosterone. Br J Pharmacol. 154 (7), 1465-1473 (2008).
  8. Barter, P. J., et al. Effects of torcetrapib in patients at high risk for coronary events. New Engl J Med. 357 (21), 2109-2122 (2007).
  9. Wilensky, R. L., et al. Inhibition of lipoprotein-associated phospholipase a2 reduces complex coronary atherosclerotic plaque development. Nat Med. 14 (10), 1059-1066 (2008).
  10. Investigators, T. S. Darapladib for preventing ischemic events in stable coronary heart disease. New Engl J Med. 370 (18), 1702-1711 (2014).
  11. Debenedittis, P., et al. Coupled myovascular expansion directs cardiac growth and regeneration. Development. 149 (18), dev200654(2022).
  12. Hojo, Y., et al. Expression of vascular endothelial growth factor in patients with acute myocardial infarction. J Am College Cardiol. 35 (4), 968-973 (2000).
  13. Lodrini, A. M., et al. Modeling cardiac injury using human cardiac slices to test therapeutic approaches for cardiac regeneration and repair. Eur Heart J. 44 (Supplement_2), ehad655.730(2023).
  14. Arstall, M. A., et al. Human ventricular myocytes in vitro exhibit both early and delayed preconditioning responses to simulated ischemia. J Mol Cell Cardiol. 30 (5), 1019-1025 (1998).
  15. Chen, I. Y., Matsa, E., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells: At the heart of cardiovascular precision medicine. Nat Rev. Cardiol. 13 (6), 333-349 (2016).
  16. Narsinh, N., Narsinh, K. H., Wu, J. C. Derivation of human induced pluripotent stem cells for cardiovascular disease modeling. Circ Res. 108 (9), 1146-1156 (2011).
  17. Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 22 (14), 1991-2002 (2013).
  18. Lyra-Leite, D. M., Fonoudi, H., Gharib, M., Burridge, P. W. An updated protocol for the cost-effective and weekend-free culture of human induced pluripotent stem cells. STAR Protoc. 2 (1), 100213(2021).
  19. Lyra-Leite, D. M., et al. A review of protocols for human ipsc culture, cardiac differentiation, subtype-specification, maturation, and direct reprogramming. STAR Protoc. 3 (3), 101560(2022).
  20. Hofbauer, P., Jahnel, S. M., Mendjan, S. In vitro models of the human heart. Development. 148 (16), dev199672(2021).
  21. Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nat Commun. 8 (1), 1825(2017).
  22. Baar, K., et al. Self-organization of rat cardiac cells into contractile 3-d cardiac tissue. Faseb J. 19 (2), 275-277 (2005).
  23. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  24. Kahn-Krell, A., et al. A three-dimensional culture system for generating cardiac spheroids composed of cardiomyocytes, endothelial cells, smooth-muscle cells, and cardiac fibroblasts derived from human induced-pluripotent stem cells. Front Bioeng Biotechnol. 10, 908848(2022).
  25. Lewis-Israeli, Y. R., Volmert, B. D., Gabalski, M. A., Huang, A. R., Aguirre, A. Generating self-assembling human heart organoids derived from pluripotent stem cells. J Vis Exp. (175), e63097(2021).
  26. Lewis-Israeli, Y. R., et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nat Commun. 12 (1), 5142(2021).
  27. Jackman, C. P., et al. Engineered cardiac tissue patch maintains structural and electrical properties after epicardial implantation. Biomaterials. 159, 48-58 (2018).
  28. Deluca, S., et al. Engineered cardiac tissues as a platform for crispr-based mitogen discovery. Adv Healthc Mater. 14 (1), e2402201(2025).
  29. Hofbauer, P., et al. Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis. Cell. 184 (12), 3299-3317.e22 (2021).
  30. Schmidt, C., et al. Multi-chamber cardioids unravel human heart development and cardiac defects. Biorxiv. , (2022).
  31. Hoang, P., et al. Engineering spatial-organized cardiac organoids for developmental toxicity testing. Stem Cell Rep. 16 (5), 1228-1244 (2021).
  32. Richards, D. J., et al. Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity. Nat Biomed Eng. 4 (4), 446-462 (2020).
  33. Abdallah, H., Toomey, K., O'riordan, A. C., Davidson, A., Marks, L. A. Familial occurrence of discrete subaortic membrane. Pediatr Cardiol. 15 (4), 198-200 (1994).
  34. Lin, H., McBride, K. L., Garg, V., Zhao, M. T. Decoding genetics of congenital heart disease using patient-derived induced pluripotent stem cells (iPSCs). Front Cell Dev Biol. 9, 630069(2021).
  35. Keung, W., et al. Human cardiac ventricular-like organoid chambers and tissue strips from pluripotent stem cells as a two-tiered assay for inotropic responses. Clin Pharmacol Ther. 106 (2), 402-414 (2019).
  36. Kupfer, M. E., et al. In situ expansion, differentiation, and electromechanical coupling of human cardiac muscle in a 3d bioprinted, chambered organoid. Circ Res. 127 (2), 207-224 (2020).
  37. Marini, V., et al. Long-term culture of patient-derived cardiac organoids recapitulated duchenne muscular dystrophy cardiomyopathy and disease progression. Front Cell Dev Biol. 10, 878311(2022).
  38. Mills, R. J., et al. Drug screening in human psc-cardiac organoids identifies pro-proliferative compounds acting via the mevalonate pathway. Cell Stem Cell. 24 (6), 895-907.e6 (2019).
  39. Mills, R. J., et al. Functional screening in human cardiac organoids reveals a metabolic mechanism for cardiomyocyte cell cycle arrest. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (40), E8372-E8381 (2017).
  40. Karpurapu, A., et al. Deep learning resolves myocardial dynamics in the failing human heart. JACC Basic Transl Sci. 9 (5), 674-686 (2024).
  41. Pasqualin, C., et al. Spiky: An imagej plugin for data analysis of functional cardiac and cardiomyocyte studies. J Imaging. 8 (4), 95(2022).
  42. Kuppe, C., et al. Spatial multi-omic map of human myocardial infarction. Nature. 608, 7924(2022).
  43. Karra, R., et al. Vegfaa instructs cardiac muscle hyperplasia in adult zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (35), 8805-8810 (2018).
  44. Ab, A., et al. Macrophages are required for neonatal heart regeneration. J CliniInvest. 124 (3), 1382-1392 (2014).
  45. Lai, S. L., et al. Reciprocal analyses in zebrafish and medaka reveal that harnessing the immune response promotes cardiac regeneration. Elife. 6, e25605(2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Hypoxia ReoxygenationCardiac OrganoidsHuman CardioidsIschemia ReperfusioniPSC Derived OrganoidsSuspension CultureCryosectioningFluorescence MicroscopyScar FormationCardiomyocyte Apoptosis

Похожие статьи