Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Измерение образования оксида азота в культурах трахеальных эпителиальных клеток мышей, дифференцированных на границе воздуха и жидкости

130 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70311

⸱

3 июля 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Maryland School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Maryland School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает метод количественной оценки образования оксида азота (NO) в эпителиальных культурах дыхательных путей, дифференцированных на границе воздух–жидкость (ALI), путем измерения нитритов в апикальных секретах с помощью хемилюминесцентного анализа на основе трийодида.

Аннотация

Эпителиальные культуры дыхательных путей, дифференцированные на границе воздух–жидкость (ALI), предоставляют физиологически значимую модель для изучения сигнализации оксида азота (NO) в ресничных клетках. Здесь мы описываем протокол для количественного определения образования NO путём измерения нитрита (NO₂⁻), стабильного продукта окисления NO, в образцах, взятых из ALI-дифференцированных трахеальных эпителиальных клеток мышей. Апикальные промывки, базальные среды и клеточные лизаты собираются и анализируются с помощью трииодидного хемилюминесцентного анализа, связанного с анализатором оксида азота (NOA). При впрыске в реакционный сосуд нитрит химически восстанавливается до NO, который обнаруживается озоновой хемилюминесценцией. Интенсивность сигнала количественно измеряется и преобразуется в пикомоли нитритов с помощью стандартной калибровочной кривой, а значения нормализуются до общего содержания белка в клеток. Результаты анализов проверяются с помощью фармакологической модуляции уровней NO. При лечении донором NO диэтилентриамина NONOate (DETA-NONOate) и ингибитором NO-синтазы N(ω)-нитро-L-аргинин-метилэфиром (L-NAME) мы наблюдаем значительные различия в уровнях нитритов в разных состояниях. Самый прочный и воспроизводимый сигнал наблюдается в апикальных потоках, соответствующих объёму NO, выделяемому из эпителия дыхательных путей. Этот метод надёжно обнаруживает NO в образцах эпителей дыхательных путей, дифференцированных ALI, предоставляя точную in vitro платформу для количественного определения производства NO и моделирования заболеваний, связанных с нарушением метаболизма NO.

Введение

Отличительной чертой ряда заболеваний дыхательных путей, включая астму, хроническую обструктивную болезнь лёгких (ХОБЛ), муковисцидоз (ХОБЛ) и первичную ресничную дискинезию (ПКД), является изменённый гомеостаз оксида азота (NO), измеримый как изменение уровня NO при выдыхании, который может значительно варьироваться при этих заболеваниях, повышаясь при ХОБЛ иастме 1,2, а при CF иPCD 3 значительно снижается. 4. Эти заболевания обычно проявляют аномалии в эпителиальных ресничках дыхательных путей — ключевых эффекторах мукоцилиарногоклиренса 5. Поскольку NO и его нижние сигнальные пути являются критически решающими регуляторами подвижности ресничков, понимание того, как изменяется производство и сигнализация NO в этих контекстах, крайне важно для выяснения механизмов мукоцилиарной дисфункции. Соответственно, метод, позволяющий точно обнаруживать выработку и выделение NO в эпителии дыхательных путей, является ценным инструментом для анализа регуляции и физиологической роли этой сигнальной молекулы. Такие подходы особенно полезны в экспериментальных условиях, где прямое измерение NO сложно из-за его короткого периода полураспада и быстрой реактивности.

NO регулирует биогенез и функцию ресничок дыхательных путей, влияя на полярность ресничных клеток и скоординированное биение подвижныхресничок 6,7,8. Однако механизмы, поддерживающие ОТСУТСТВИЕ гомеостаза в дыхательных путях, остаются неполностью изучены. Эпителиальные культуры дыхательных путей, дифференцированные на границе воздух–жидкость (ALI), предоставляют ценную систему in vitro для изучения этих механизмов. В настоящее время эта модель широко используется для изучения влияния воздействия окружающей среды на эпителий дыхательныхпутей 9,10,11 и для разъяснения патофизиологии заболеванийдыхательных путей 12. По сравнению с обычными подводнымикультурами 13,14, дифференцированные ALI эпителии более точно воспроизводят архитектуру и функции естественных дыхательных путей, включая поляризацию эпителия, мукоцилиарную дифференциацию и реалистичный газо-жидкий обмен, что делает их особенно подходящими для изучения апикального выделения NO, сигнализации и связанной функции ресничков. Поэтому эта система хорошо подходит для экспериментов, направленных на количественное определение метаболитов, полученных из NO, выделяемых в просвет дыхательных путей, особенно при условиях эпителиальной дифференцировки или фармакологической манипуляции.

Точное измерение концентрации NO крайне важно, так как как избыточные, так и недостаточные уровни NO могут нарушать функцию ресничков. В настоящее время методы на основе флуоресцентных зондов (например, диаминофлуоресцеины, DAF), доступные для обнаружения NO, являются лишь полуколичественными и ограничены чувствительностью к pH, зависимостью к кислороду и отсутствием специфичности, поскольку они могут реагировать с клеточными окислителями и антиоксидантами, что приводит к полуколичественнымизмерениям 15. Кроме того, электрохимические сенсоры (например, амперометрические электроды, чувствительные к NO) позволяют обнаруживатьNO16 в реальном времени, но их сложно реализовать в сложных биологических системах из-за короткого периода полураспада NO, помех из-за биоокислительно-активного загрязнения поверхности электрода и трудностей с поддержанием стабильнойкалибровки 17. Альтернативные методы на основе хемилюминесценции, включая прямое обнаружение NO в газовой фазе и редуктивные анализы, направленные на различные виды оксидов азота, также были описаны, но их применение в эпителиальных культурах дыхательных путей остаётся неизученным. Эти ограничения подчёркивают необходимость чувствительных количественных методов, которые могут надёжно обнаруживать низкие уровни видов, производных из NO, в небольших биологических образцах. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы разработали протокол количественного определения NO в апикальных выделениях, собранных из дифференцированного ALI-дифференцированного эпителия дыхательных путей, с помощью анализатора оксида азота (NOA). NOA — это высокочувствительный детектор на основе хемилюминесценции, традиционно используемый для измерения метаболитов NO в химических образцах, а в последнее время адаптированный для анализа биологических образцов, включая кровь, гомогенаты тканей и супернатанты клеточнойкультуры 7,18,19. NO — это высокореактивная сигнальная молекула, быстро окисляющаяся до нитрита в тканях при нормальном уровне кислорода с исключительно коротким периодом полураспада. Таким образом, нитрит как конечный продукт NO окисления служит индикатором общего образования NO в биологическихсистемах 20,21,22. Этот чувствительный и воспроизводимый метод хемилюминесценции позволяет обнаруживать нитрит/NO на уровняхпикомолярных 23,24, что делает его идеальным для измерения небольших изменений в биологических образцах малого объёма, таких как те, что получены из культур MTEC ALI. Однако этот подход лучше всего подходит для условий, когда накопление нитритов отражает недавнее ОТСУТСТВИЕ производства и может зависеть от таких факторов, как обработка образцов, фоновая нитритная контаминация и состояние дифференцировки эпителия. Поэтому для точной интерпретации результатов необходимы соответствующие контроли и тщательное проектирование экспериментов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры с животными были рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Университета Мэриленда (Протокол # AUP–00004632).

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол требует примерно 2 дня для выделения клеток трахеи (MTEC), затем 7–10 дней для расширения, 5–6 дней для пролиферации в прозрачных вставках, 21 день на дифференцировку (время для получения достаточного количества многоресничных клеток), 24 часа лекарственного лечения и ещё один день для сбора образца, калибровки NOA, инъекции и сбор данных.

1. Подготовка материалов и решений

ПРИМЕЧАНИЕ: См. таблицу 1 для получения информации о ингредиентах медиа.

  1. Медиа F–12 Хэма
    1. Приготовьте раствор внутри стерильной ламинарной вытяжки. Добавьте 5 мл 100× пенициллина/стрептомициновых антибиотиков и 0,5 мл амфотерецина B (Fungizone) на 500 мл среды F12 от Хэма в стерильной бутылке.
    2. Перемешивайте, аккуратно переворачивая бутылку 5–10 раз, чтобы обеспечить полное перемешивание. Раствор стерилизуйте фильтром с помощью фильтра 0,22 мкм в стерильных условиях и храните при 4 °C.
      ВНИМАНИЕ: Пенициллин/стрептомицин и амфотерицин B — это антимикробные средства, которые могут вызывать раздражение или аллергические реакции. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты, включая перчатки и лабораторный халат.
  2. Решение Проназа
    1. Добавьте 15 мг проназы к 10 мл стерильной среды Ham's F12 в стерильной трубке, чтобы получить раствор проназы 0,15%. Смешивайте, аккуратно переворачивая или протягивая трубку вверх и вниз, пока проназа полностью не растворится. Готовьте свежим сразу перед использованием.
  3. Раствор DNase I
    1. Добавьте 5 мг сырой поджелудочной ДНКазы I в 9 мл среды F12 Хэма и 1 мл раствора сыворотки бычьей сыворотки альбумина (BSA) 10 мг/мл в стерильной трубке, чтобы получить раствор ДНКазы I с концентрацией 0,5 мг/мл.
    2. Аккуратно перемешивайте, пипетируя вверх и вниз, пока ДНКаза I полностью не растворится, избегая образования пузырей. После полного растворения раствор аликвотируйте в стерильные микроцентрифугные трубки объёмом 1 мл и храните при -20 °C.
  4. Медиа F12 от Хэма с сывороткой для плода бычьего скота (FBS)
    1. Приготовьте раствор при комнатной температуре внутри стерильной ламинарной вытяжки. Добавьте 10 мл плодовой сыворотки (FBS) к 40 мл среды F12 Хэма с антибиотиками в стерильной конической трубке, чтобы получить 20% FBS в среде F12.
    2. Аккуратно перемешивайте, переворачивая трубку 5–10 раз, пока раствор не станет однородным. Раствор стерилизуйте фильтром с помощью фильтра 0,22 мкм в стерильных условиях и храните при 4 °C.
  5. Медиа расширения MTEC
    1. Подготовьте расширительный материал MTEC при комнатной температуре внутри стерильной ламинарной вытяжки, объединив компоненты, указанные в таблице 1 , в стерильной бутылке.
    2. Тщательно перемешайте, аккуратно перевертая или перевертая контейнер, пока все компоненты не будут полностью смешаны. Раствор стерилизуйте фильтром с помощью фильтра 0,22 мкм в стерильных условиях.
    3. Добавьте ингибитор ROCK Y–27632 (стандартный раствор 5 мм) в итоговую концентрацию 10 мкм и Notch γ–секретазный ингибитор DAPT (10 мМ стандартного раствора) до окончательной концентрации 5 мкм непосредственно перед использованием и аккуратно перемешайте инверсией.
  6. Медиа распространения MTEC
    1. Подготовьте среду для пролиферации MTEC при комнатной температуре внутри стерильного ламинарного вытяжки, объединив компоненты, перечисленные в таблице 1.
    2. Тщательно перемешивайте, аккуратно инверсируя или перемешивайте, пока все компоненты полностью не соединятся. Стерилизуйте среду фильтром с помощью фильтра 0,22 мкм в стерильных условиях.
    3. Непосредственно перед применением добавьте ингибитор ROCK Y–27632 (стандартный раствор объёмом 5 мм) к конечной концентрации 10 мкм и ретиноевую кислоту (стандартный раствор 5 мкм) до конечной концентрации 0,05 мкм. Аккуратно перемешайте инверсией перед использованием.
  7. Дифференциационные среды MTEC
    1. Подготовьте среду для дифференцировки MTEC при комнатной температуре внутри стерильной ламинарной вытяжки, объединив компоненты, перечисленные в таблице 1 , в стерильном контейнере.
    2. Тщательно перемешивайте, аккуратно инверсируя или перемешивайте, пока все компоненты полностью не соединятся. Стерилизуйте среду фильтром с помощью фильтра 0,22 мкм в стерильных условиях.
    3. Непосредственно перед использованием добавьте ретиноевую кислоту до конечной концентрации 0,05 мкм и аккуратно перемешайте инверсией.

2. Изоляция эпителиальных клеток трахеи мышей (MTEC)

  1. Эвтаназия трёх взрослых мышей (8–20 недель) вдохнутой углекислого газа (CO2) в утверждённой камере эвтаназии согласно институциональным рекомендациям IACUC. Подтвердите смерть до сбора тканей.
  2. Поместите животное дорсально (грудь вверх) на асептическую поверхность. С помощью чистых щипцов аккуратно поднимите кожу и разрежьте её хирургическими ножницами от нижней губы до брюшной полости, чтобы обнажить трахею.
  3. Уберите слюнные железы в сторону и удалите соединительную ткань и мышцу трахеалиса, чтобы обнажить хрящевые кольца. Разрезать всю длину трахеи и поместить её в чашку Петри с стерильным медиумом F12 от Ham. Смешайте три трахеи в одной тарелке.
  4. Переложите блюдо в ламинарный капюшок и положите трахеи в другое блюдо с медиумом Fresh Ham's F12. Удалите всю экстрахеальную ткань и разрежьте трахею продольно через просвет.
  5. Переместите все трахеи в коническую трубку объёмом 50 мл с винтовой крышкой, содержащую стерильный раствор проназы 10 мл 0,15%. Инкубировать при 4 °C в течение 16–18 часов.

3. Изоляция клетки и начальное расширение

  1. На следующий день перевернуть трубку с тканями 10–15 раз, чтобы вытеснить эпителиальные клетки и инкубировать при 4 °C в течение 45 минут. Остановите реакцию проназы, добавив 10 мл медиа Ham с 20% FBS и смешав 10–15 раз.
  2. Добавьте 10 мл медиума F12 от Хэма с FBS в три трубки по 15 мл. С помощью пипетки Пастера последовательно переносите трахеальную ткань из трубки объёмом 50 мл в первую, вторую и третью трубку объемом 15 мл и инвертируйте каждую трубку 10–15 раз, чтобы сместить эпителиальные клетки трахеи. После окончательного переноса ткани выбросить.
  3. Объедините всю среду из трёх конических трубок по 15 мл с средой из трубки на 50 мл. Центрифуга при 360 × г в течение 10 минут при 4 °C. Аккуратно удалите супернатант и добавьте 0,5 мл раствора ДНКазы I с концентрацией 0,5 мг/мл. Инкубировать на льду 5 минут.
  4. Центрифуга при 360 × г в течение 5 минут при 4 °C. Аккуратно сбросьте супернатант и снова суспензуйте клеточную гранулу в 7–10 мл среды расширения MTEC.

4. Расширение и дифференциация MTEC

  1. Подготовьте коллагеновую коллажную колбасу с культурой T75 с использованием 10 мл коллагена I (крысиного хвоста) при 50 мкг/мл и инкубировать при 37 °C в течение 16–18 часов. Аспирируйте раствор коллагена из колбы T75 и трижды промывайте колбу с помощью PBS (1×). Дайте фляжке полностью высохнуть.
  2. Засеять клеточную суспензию, состоящую из 7–10 мл среды расширения MTEC, содержащей клетки, в коллагеновую колбу с покрытием. Поместите флягу в инкубатор при 37 °C и 5%CO2. Меняйте среду расширения каждые 2-3 дня и следите за количеством ячеек до 70% совпадения.
  3. При совпадении 70% добавьте 1 мл раствора аккутазы и инкубируем 10–15 минут при 37 °C, чтобы отделить монослой клетки. Суспензировать клетки в 10 мл среды пролиферации MTEC. Центрифуга при 1057 × г в течение 5 минут при комнатной температуре.
  4. Отбросьте супернатант, снова подвесьте клетки в среде пролиферации и посчитайте клетки.
  5. Семя 2 × 105 клеток в объёме 0,5 мл на одну вставку для трансвелла (диаметр мембраны 12 мм, пор мембраны 0,4 мкм), предварительно покрытое коллагеном. Добавьте 1,5 мл среды в базальную камеру каждого инсерта и поместите трансвелл в инкубатор при температуре 37 °C.
  6. Меняйте среду в апикальной и базальной камерах на третий день и позволяйте клеткам достичь 100% слияния, обычно к 5-му или 6-му дню. Включите одну вставку без ячеек в качестве контроля.
  7. После слияния промывайте клетки апикально 0,5 мл среды дифференцировки MTEC. Инициируйте интерфейс воздух-жидкость (ALI), добавив 0,75 мл дифференциационной среды только в базальную камеру, оставляя клетки в апикальной камере открытыми для воздействия воздуха.
  8. Каждые 2–3 дня промывайте клетки на апикальной поверхности дифференциационной средой и заменяйте базальную среду. Дайте клеткам дифференцироваться при ALI в течение 21 дня.

5. Иммуномаркировка и визуализация ресничных эпителиальных клеток

  1. На ALI на 7, 14 и 21 день фиксируйте клетки 4% параформальдегида (PFA).
  2. Провести иммуномаркировку клеток антителами анти-FoxJ1 для обнаружения FoxJ1 — транскрипционного фактора, необходимого для подвижного цилиогенеза25,26, а также антиацетилированного антитела α-тубулина для обнаружения ацетилированного α-тубулина, структурного маркера подвижных реснички, согласно опубликованнымпротоколам 27, 28, 29.
    ВНИМАНИЕ: PFA — опасное химическое вещество, поэтому при ремонте клеток используйте соответствующие средства индивидуальной защиты (минимум нитриловые перчатки и лабораторный халат).
  3. Получите изображения иммуномаркированных клеток с помощью конфокальной микроскопии с помощью объектива 40× или 60×. Собирайте Z-стеки глубиной 10 мкм с размером каждого шага 0,5 мкм.
  4. Устанавливайте мощность лазера, усиление и экспозицию детектора, чтобы избежать насыщения сигнала и поддерживать сопоставимые параметры захвата между образцами.
  5. Количественно определите FoxJ1–положительные или ацетилированные тубулин–положительные клетки в процентах от общего числа клеток (DAPI–положительный) на интересующую область (ROI) с помощью плагина счётчика клеток в программном обеспечении для визуализации FIJI.
  6. В программном обеспечении GraphPad Prism (версия 10.0) генерирует графики и проводит статистический анализ с помощью двухстороннего t-теста Студента после оценки распределения данных на нормальность с помощью теста Шапиро-Вилка.

6. Медикаментозное лечение дифференцированного эпителия дыхательных путей

  1. На 21-й день ALI подготовьте дифференциационную среду (3 мл для клеток в трёх вставках) в стерильной трубке при комнатной температуре.
  2. Добавьте 7,5 мкл диэтилентриамина–NONOate или DETA/NO из 100 мМ стандартного раствора (приготовленного в 10 мМ NaOH) в среду дифференцировки, чтобы достичь конечной концентрации 250 мкм в 3 мл. Аккуратно перемешайте инверсией и используйте сразу.
  3. Добавьте 750 мкл итогового раствора в каждую из трёх базальных камер дифференцированных клеток и инкубируемые в течение 24 часов при 37 °C.
  4. Приготовьте 1 мМ Nω-нитро-L-аргинин-метилэфира (L–NAME), добавив 30 мкл из раствора L-NAME объемом 100 мм (подготовленного в DMSO) в среду MTEC для дифференцировки для общего объёма 3 мл.
  5. Добавьте 750 мкл окончательного раствора в каждую из трёх базальных камер и инкубируемые в течение 24 часов при 37 °C.
  6. Добавьте 30 мкл диметилсульфоксида (DMSO) (необработанную группу) к 3 мл базальных сред (1% v/v).
  7. Добавьте 750 мкл окончательного раствора в базальную камеру трёх вставок (без обработки).

7. Сбор образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа NOA необходимо объединить среду, апикальный промыв и образцы лизата клеток из трёх вставок.

  1. На 22-й день ALI возьмите образцы из дифференцирующего эпителия дыхательных путей, начиная с 750 мкл базальных сред из каждой из трёх вставок в каждой экспериментальной группе.
  2. Собирайте базальные среды, инкубированные в вставках без клеток, чтобы использовать их в качестве контроля, учитывая возможное внешнее загрязнение нитритами.
  3. Сводите базальные среды из трёх вставок и храните сразу при -20 °C до введения в NOA.
  4. Чтобы собрать нитрит/NO, присутствующий в апикальной слизи эпителия, добавьте 50 мкл предварительно нагретого буфера PBS (1×) (стерильного, алицитированного и замороженного) поверх клеток в каждой вставке и инкубировать 30 минут при 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время 30-минутной инкубации клеток с PBS для сбора апикального раствора PBS также можно добавить в базальную камеру для поддержания гидратации с обеих сторон клеток.
  5. Соберите PBS, содержащий слизь, покрывающую эпителий.
  6. Объедините промывки PBS из трёх вставок, чтобы получить около 150 мкл апикальной слизи/PBS из каждого экспериментального состояния, чего хватит для двух инъекций NOA.
  7. Апикальные образцы промывки храните при -20 °C до дальнейшего использования.
  8. Также храните буфер для промывки PBS для использования в качестве элемента блока во время инъекций NOA.
  9. Промыйте апикальные и базальные стороны клеток в трёх вставках с 500 мкл предварительно подогреного PBS дважды.
  10. Добавьте 500 мкл раствора аккутазы апикально и инкубуйте 15–20 минут, пока клетки полностью не отделятся от мембран.
  11. После полного отсоединения добавьте в клетки безсывороточную среду RPMI-1640 (в соотношении среды к аккутазе 3:1).
  12. Объедините отдельные элементы от трёх вставок в одну трубку.
  13. Вращайте клетки при 3000 × г в течение 5 минут при 4 °C.
  14. Ресуспензировать клеточную гранулу в 50 мкл раствора лизиса (буфер RIPA + коктейль ингибитора протеазы Halt 1× и инкубировать на льду в течение 45 минут.
  15. Открутите лизат при 14 800 × г в течение 20 минут при 4 °C и соберите супернатант.
  16. Используйте 3 мкл цельноклеточного лизата для определения концентрации белка с помощью анализа на бицинхониновую кислоту (BCA).
  17. Разведите оставшийся раствор лизата в буфере 1:1 в буфере RIPA, чтобы получить достаточный объём для двух инъекций по 50 мкл NOA.
  18. Сохраняйте лизаты при -80 °C до инъекции в NOA при -20 °C.
  19. Храните буфер RIPA, используемый для повторного суспензирования ячеточной гранулы, при -20 °C для использования в качестве заготовки и контроля загрязнения образцов лисата.

8. Калибровка NOA и инъекции образцов

  1. Приготовьте трииодидный реагент, растворив 400 мг йодида калия и 250 мг йода в 28 мл ледниковой уксусной кислоты и 8 мл ультрачистой воды.
  2. Проведите приготовление трииодидного реагента в вытяжной вытяжке с химическим паром с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты (лабораторный халат, перчатки и защита глаз).
    ВНИМАНИЕ: Йод и ледниковая уксусная кислота опасны и могут вызывать раздражение и коррозию кожи и глаз.
  3. Храните при комнатной температуре и используйте в течение 2 недель после подготовки.
  4. Приготовьте 1 мМ бульонного раствора нитрита натрия в воде без нитритов.
  5. Храните бульонный раствор при -20 °C до использования.
  6. Подготовьте свежие рабочие стандарты (0,125–4,0 мкм) в PBS непосредственно перед инъекциями.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для калибровки NOA используйте стерильный, плотно закрытый PBS, чтобы минимизировать загрязнение нитритами.
  7. Включите носитель азота (N 2) и запустите поток газа по системе.
  8. Соберите стеклянную продувку и добавьте в неё 4 мл трийодидного реагента с 20 мкл противопенопласта, разбавленной в соотношении 1:10.
  9. Надёжно закройте его перегородкой, закреплённой крышкой винта, чтобы обеспечить герметичность.
  10. Залить 10 мл гидроксида натрия (NaOH) в сифон NaOH.
  11. На экране прибора NOA (nCLD 88) выберите Измерение, Газ и Диапазон.
  12. Установите прибор на MR2:50.00, что соответствует диапазону измерений от 0 до 50 частей на миллиард NO, и выберите Fast для настройки фильтра.
  13. Регулировать давление газового азота до стабилизации давления реактора в диапазоне 27–29 psi (186–200 кПа).
  14. Откройте программное обеспечение eDAQ на компьютере, подключённом к NOA.
  15. Установите диапазон захвата на 10/с, а напряжение — на 10 В.
  16. Перейдите в Настройка > Настройки канала, выберите Канал 1.
  17. Установите масштаб дисплея на 2:1 в программном обеспечении NOA.
  18. Начните сбор данных на приборе NOA и в программном обеспечении.
  19. Следите за базовым уровнем до стабилизации.
  20. Введите 10 мкл PBS через носовую перегородку в прочисточный сосуд с помощью шприца Гамильтона для подтверждения базовой стабильности.
  21. Записывайте хемилюминесцентный сигнал для каждой инъекции.
  22. Введите 10 мкл стандарта нитритов с концентрацией 0,125 мкм в прочисточный сосуд.
  23. Повторяйте дважды для каждого стандарта нитритов, чтобы получить дублирующиеся измерения, которые впоследствии будут усреднены.
  24. Аннотировать каждую инъекцию во вкладке «Комментарий » (например, 10 мкл 0,5 мкм нитрита).
  25. Протрите шприц по салфетке без ворса и прополосните 3–4 раза стерильной водой без нитритов, чтобы удалить избыток трииодида.
  26. Повторяйте этот этап очистки после каждой инъекции.
  27. Дайте сигналу вернуться к базовому уровню между инъекциями (20–30 секунд).
  28. Откройте окно анализа потоков .
  29. Проверьте значения пиковой высоты и времени для каждой инъекции в таблице анализа.
  30. Выделите каждую вершину и скорректируйте выбор, чтобы вычислить площадь под кривой (AUC).
  31. Переключите дисплей с S на C , чтобы включить режим калибровки.
  32. Введите известные количества нитритов для каждого стандарта в столбце Amount .
  33. Нажмите кнопку «Кривую калибровки», чтобы сгенерировать стандартную кривую.
  34. Проверьте, что кривая калибровки соответствует критериям принятия (R2 ≥ 0,99).
  35. Оттаять биологические образцы, ранее собранные из культур ALI на льду.
  36. Введите 50 мкл свободной среды из пустых клеток в продувочный сосуд.
  37. Введите по 50 мкл каждого образца базального среды в продувательный контейнер.
  38. Записывайте сигнал хемилюминесценции для каждой инъекции.
  39. Выполните дублирующие инъекции (по 50 мкл каждая) для каждого образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекции 50 мкл часто приводят к образованию пузырей. Чтобы ограничить эту проблему, регулярно заменяйте трииодидный реагент на противопенопласт в продувном сосуде.
  40. Аннотируете каждый образец во вкладке «Комментарии » перед введением.
  41. Введите 50 мкл свободного PBS (апикального бланка) в прочисточный сосуд.
  42. Вводите апикальные промывки (две инъекции по 50 мкл на образец) и фиксируйте соответствующие пики сигнала.
  43. Вводите буфер RIPA дважды, затем образцы лизата (две инъекции по 50 мкл на образец) и записывайте соответствующие пики сигнала.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда позволяйте химилюминесцентному следу возвращаться к базовой линии и стабилизироваться. Подождите 20–30 секунд, затем введите следующий образец.
  44. В конце инъекций образцов откройте окно анализа потока .
  45. Выделите каждый пик выборки, чтобы вычислить площадь под кривой (AUC).
  46. Определите концентрацию нитритов для каждого образца с помощью калибровочной кривой, полученной из стандартных растворов.

9. Сбор, нормализация и анализ данных

  1. Экспортировать данные, включая пиковую высоту (V), область под кривой (V.s) и среднюю площадь под кривой из функции анализа потока в программном обеспечении eDAQ, в файл Excel. Экспортированный файл будет отображать высоту (V) и время (s) сигнальных следов для всего эксперимента NOA.
  2. Определите количество пикомолей (пмоль) нитрита, вводящихся в NOA, умножая концентрацию нитритов (μM) на объём инъекции (μL).
  3. Среднее количество пикомолей (pmol) нитрита, измеряемых в контролях (безклеточные среды, буфер промывки PBS или буфер RIPA).
  4. Вычитаем соответствующие контрольные значения из pmol, измеряемого при каждой инъекции образца 50 мкл.
  5. Определите общее количество пикомолей (pmol) нитритов в каждом образце, умножив pmol, измеренный в инъекционной части образца, на точный общий объём взятого образца. Используйте 750 мкл для среды, 150 мкл для апикального промыва и около 90–100 мкл для лизата.
  6. Кроме того, только для лизатов умножьте общий нитрит пмоль на 2, чтобы учесть коэффициент разбавления.
  7. Нормализуйте pmol нитрита, полученный для каждого образца, разделив эти значения на общее количество белка (мкг), присутствующее в лисате соответствующего образца, ранее полученное с помощью BCA-анализа.
  8. Усредняйте уровни нитритов (pmol/μg) при дублирующих инъекциях для каждого образца.
  9. График нормализованных уровней нитритов (пмоль/мкг общего белка) для каждого образца с помощью программного обеспечения GraphPad Prism.
  10. Оценить распределение данных на нормальность с помощью теста Шапиро-Уилка.
  11. Проведите статистический анализ с помощью двухстороннего t-теста для студентов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Общая цель этой процедуры — количественно определить уровень оксида азота (NO) в культурах трахеальных эпителиальных клеток (MTEC) у мышей, дифференцированных на интерфейсе воздух–жидкость (ALI). Первичные клетки изолируются и дифференцируются согласно установленнымпротоколам 27,28. В течение 21 дня при ALI клетки дифференцируются в псевдостратифицированный эпителий дыхательных путей, содержащийресниччатые клетк...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Многоресничные клетки внутри эпителия дыхательных путей критически важны для синтеза и сигнализации NO, что, в свою очередь, необходимо для регулирования биения ресничков, клиренса слизистой и гомеостаза дыхательныхпутей 6,7,8. NO — это высокореактивная молекула, и даже небольшие изменения уровня NO связаны с заболеваниями дыхательныхпутей

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конфликтах интересов.

Благодарности

Мы благодарим доктора Марка Т. Гладвина (декана и профессора Медицинской школы Университета Мэриленда) за рекомендации по проектированию исследований. Мы также благодарим Конфокальное микроскопическое ядро Медицинской школы Мэриленда (Балтимор, Мэриленд) за доступ к ресурсам конфокальной микроскопии. Эта работа была поддержана грантом Национального института здоровья (NIH) 5R01HL168775 для доктора Паолы Корти.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
4′,6-Диамидино-2-фенилиндол (DAPI)ThermoFisher Scientific62248разбавленный 1:2000 для иммуногистахимии
50 мл центрифужные пробирки с фильтром (0,22 &микро;м)CellTreat229710Для приготовления стерильных растворов
500 мл Фильтровальные устройстваThermoFisher Scientific566-0020Для приготовления стерильной среды
AccutaseSigmaA6964
Амфотерицин ВThermoFisher Scientific15290026
Экстракт гипофиза быкаThermoFisher Scientific13028014
Белок сыворотки быкаSigmaA7906
Токсин холерыSigmaC8052
Коллаген IThermoFisher ScientificA1048301
Конфокальный микроскопNikonW1 Spinning disk Ti2 инвертированный микроскоп с камерой Hamamatsu sCMOS
Corning Transwell вставкиSigmaCLS3460
Диетилентриамин NONOate (DETA-NONOate)Cayman Chemical82120
DMEM/F-12 средаThermoFisher Scientific11330032
ДНКаза ISigmaDN25
Фета́льная сыворотка быкаSigmaF4135
Halt 1X коктейль ингибиторов протеазThermoFisher Scientific1860932
Питательная смесь Ham's F1-12ThermoFisher Scientific11765054
Инсулиновая смесьSigmaI0516
Изопротеренол гидрохлоридSigmaI6504
Кератиноцитарная бессеровая средаThermoFisher Scientific17005042
Муриный фактор роста эпидермисаSigmaE4127
N(G)-Нитро-L-аргинин метил эфир (L-NAME)SigmaN5751
NuSerumCorning355100
Пенициллин-стрептомицинSigmaP4333
Фосфатный буферный раствор (PBS)ThermoFisher Scientific10010023
Комплект для определения белка Pierce BCAThermoFisher Scientific23227
ПроназаSigma10165921001
Ретиноевая кислотаSigmaR2625
Ингибитор ро-киназы (Y-27632 гидрохлорид)Cayman ChemicalTOM-C837Z37
RIPA буферSigmaR0278
Среда RPMI-1640ThermoFisher Scientific11875093
Нитрит натрия SigmaS2252
ТрансферринSigmaT8158
α-Ацетилированный тубулин антитело (мышь)SigmaT6793разбавленный 1:200 для иммуногистахимии
α-FoxJ1 антитело (мышь)ThermoFisher Scientific14-9965-80разбавленный 1:200 для иммуногистахимии
α-мышиныйCy3 вторичный антителоThermoFisher ScientificA10521разбавленный 1:1000 для иммуногистахимии
γ-секретаза ингибитор IX (DAPT)SigmaD5942

Ссылки

  1. Alcázar–Navarrete, B., Ruiz Rodríguez, O., Conde Baena, P, Romero Palacios, P. J., Agusti, A. Persistently elevated exhaled nitric oxide fraction is associated with increased risk of exacerbation in COPD. Eur Respir J. 2018;51(1):1701457.
  2. Krantz, C., Janson, C., Alving, K., Malinovschi, A. Nasal nitric oxide in relation to asthma characteristics in a longitudinal asthma cohort study. Nitric Oxide 2021;106:1–8.
  3. Thomas, S. R., Kharitonov, S. A., Scott, S. F., Hodson, M. E., Barnes, P. J. Nasal and exhaled nitric oxide is reduced in adult patients with cystic fibrosis and does not correlate with cystic fibrosis genotype. Chest 2000;117(4):1085–9.
  4. Shapiro, A. J. et al. Nasal nitric oxide measurement in primary ciliary dyskinesia. A technical paper on standardized testing protocols. Ann Am Thorac Soc. 2020;17(2):e1–e12 .
  5. Legendre, M., Zaragosi, L. E., Mitchison, H. M. Motile cilia and airway disease. Semin Cell Dev Biol. 2021;110:19–33.
  6. Li, D., Shirakami, G., Zhan, X., Johns, R. A. Regulation of ciliary beat frequency by the nitric oxide–cyclic guanosine monophosphate signaling pathway in rat airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 2000;23(2):175–81.
  7. Rochon, E. R. et al. Cytoglobin regulates NO-dependent cilia motility and organ laterality during development. Nat Commun. 2023;14(1): 8333.
  8. Mikhailik, A. et al. nNOS regulates ciliated cell polarity, ciliary beat frequency, and directional flow in mouse trachea. Life Sci Alliance 2021;4(5):e202000981.
  9. Schamberger, A. C., Staab–Weijnitz, C. A., Mise–Racek, N., Eickelberg, O. Cigarette smoke alters primary human bronchial epithelial cell differentiation at the air–liquid interface. Sci Rep. 2015;5:8163.
  10. Gindele, J. A. et al. Intermittent exposure to whole cigarette smoke alters the differentiation of primary small airway epithelial cells in the air–liquid interface culture. Sci Rep. 2020;10(1):6257.
  11. Ghosh, B. et al. Effect of sub-chronic exposure to cigarette smoke, electronic cigarette and waterpipe on human lung epithelial barrier function. BMC Pulm Med. 2020;20(1):216.
  12. Baldassi, D., Gabold, B., Merkel, O. Air-liquid interface cultures of the healthy and diseased human respiratory tract: promises, challenges and future directions. Adv Nanobiomed Res. 2021;1(6):2000111.
  13. Bessa, M. J. et al. In vitro toxicity of industrially relevant engineered nanoparticles in human alveolar epithelial cells: Air-liquid interface versus submerged cultures. Nanomaterials (Basel) 2021;11(12):3225.
  14. Allouche, Y. et al. Comparison of submerged and air liquid interface exposure: limitations and differences in the toxicological effects evaluated in bronchial epithelial cells. Environ Res. 2025;279(Pt 2):121856.
  15. Li, J., LoBue, A., Heuser, S. K., Leo, F., Cortese-Krott, M. M. Using diaminofluoresceins (DAFs) in nitric oxide research. Nitric Oxide. 2021;115:44–54.
  16. Jiang S. et al. Real–time electrical detection of nitric oxide in biological systems with sub–nanomolar sensitivity. Nat Commun. 2013;4:2225. 
  17. Brown M. D, Schoenfisch M. H. Electrochemical nitric oxide sensors: Principles of design and characterization. Chem Rev. 2019;119(22):11551–75.
  18. Corti, P. et al. Globin X is a six-coordinate globin that reduces nitrite to nitric oxide in fish red blood cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2016;113(30):8538–43.
  19. Zhao, X. J. et al. Mechanisms for cellular NO oxidation and nitrite formation in lung epithelial cells. Free Radic Biol Med. 2013;61:428–37.
  20. Lundberg, J. O. Weitzberg E, Gladwin MT. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 2008;7(2):156–67.
  21. Rochon, E. R., Corti, P. Globins and nitric oxide homeostasis in fish embryonic development. Mar Genomics 2020;49:100721.
  22. Giordano, D., Verde, C., Corti, P. Nitric oxide production and regulation in the teleost cardiovascular system. Antioxidants (Basel) 2022;11(5):957.
  23. MacArthur, P. H., Shiva, S., Gladwin, M. T. Measurement of circulating nitrite and S–nitrosothiols by reductive chemiluminescence. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2007;851(1–2):93–105.
  24. Basu, S., Ricart, K., Gladwin, M. T., Patel, R. P, Kim-Shapiro, D. B. Tri-iodide and vanadium chloride based chemiluminescent methods for quantification of nitrogen oxides. Nitric Oxide 2022;121: 11–19.
  25. Brody, S. L., Yan, X. H., Wuerffel, M. K., Song, S. K., Shapiro, S. D. Ciliogenesis and left-right axis defects in forkhead factor HFH-4-null mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 2000;23(1): 45–51.
  26. Jain, R. et al. Temporal relationship between primary and motile ciliogenesis in airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 2010;43(6): 731–9.
  27. Eenjes, E. et al. A novel method for expansion and differentiation of mouse tracheal epithelial cells in culture. Sci Rep. 2018;8(1): 7349.
  28. You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2002;283(6): L1315–21.
  29. Pfeiffer, S., Leopold, E., Schmidt, K., Brunner, F., Mayer, B. Inhibition of nitric oxide synthesis by NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME): requirement for bioactivation to the free acid, NG-nitro-L-arginine. Br J Pharmacol 1996;118(6):1433–40. 
  30. Rochon, E. R., Corti, P., Gladwin, M. T. Hemoglobin α in Pulmonary Endothelium: Ironing Out Nitric Oxide Signaling. Am J Respir Cell Mol Biol. 2017;57(6):639–41.
  31. van Faassen, E. E. et al. Nitrite as regulator of hypoxic signaling in mammalian physiology. Med Res Rev. 2009;29(5):683–741. 

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

233233
Измерение образования оксида азота в культурах трахеальных эпителиальных клеток мышей, дифференцированных на границе воздуха и жидкости
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.