Рабочий процесс визуализации конформационной динамики белков на основе крио-ЭМ-карт с использованием человеческой аспарагин-синтетазы

Summary

Этот протокол описывает, как выполнять анализ 3D-изменчивости (3DVA) в CryoSPARC и уточнение вариабельности в Phenix для анализа конформационной гетерогенности в крио-ЭМ-данных. На примере человеческой аспарагин-синтетазы объясняется, как генерировать карты изменчивости, визуализировать основные компоненты и уточнять соответствующие атомные модели.

Abstract

В этой статье представлен комплексный рабочий процесс анализа конформационной гетерогенности в данных одночасточной криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) с использованием 3D-анализа изменчивости (3DVA) в CryoSPARC и уточнения вариабельности в Phenix. Протокол описывает, как вычислять отображения изменчивости по основным компонентам, полученным из изображений частиц, визуализировать основные режимы структурных вариаций и уточнять соответствующие ансамбли атомарных моделей против отдельных кадров изменчивости. Полученные выходы включают серию 3D-карт изменчивости, усовершенствованные многомодельные атомарные структуры, представляющие дискретные конформационные состояния, и визуализационные файлы, подходящие для сравнительного структурного анализа и создания фильмов. Этот рабочий процесс широко применим к реконструкциям крио-ЭМ в диапазоне разрешения (обычно ~2.0-6.0 Å), где конформационная гетерогенность может быть осмысленно интерпретирована на уровне магистрали и сайдчейна. Он особенно подходит для фиксации непрерывных движений в области области, движений с изгибом шарниров и скоординированных локальных перестановок, которые сложно разрешить только дискретной классификацией. Совместное использование карт изменчивости и усовершенствованных ансамблей моделей позволяет напрямую сравнивать конформационные экстремумы, поддерживает количественный анализ, такой как вычисления флуктуаций по среднеквадратичному корню (RMSF), и предоставляет основу для связи динамических структурных особенностей с биохимическими или функциональными гипотезами. Человеческая аспарагиновая синтезаза (ASNS) используется в качестве примера для демонстрации практической реализации этого рабочего процесса.

Introduction

Характеристика конформационной гетерогенности макромолекулярных структур становится всё более важным аспектом анализа криоэлектронной микроскопии с использованием одной частицы (крио-ЭМ). Цель этого протокола — предоставить практический рабочий процесс для извлечения, визуализации и уточнения доминирующих режимов структурной вариабельности непосредственно из наборов крио-ЭМ с использованием трёхмерного анализа вариабельности (3DVA) в^{CryoSPARC 1} в сочетании с уточнением вариабельности в^{Phenix 2}. Эта статья предназначена для того, чтобы помочь читателям определить, подходит ли такой вычислительный подход для их данных, а также понять типы выходных данных, генерируемых рабочим процессом.

Традиционные экспериментальные методы (например, обмен водородом и дейтерием, ЯМР-спектроскопия, масс-спектрометрия) предоставляют ценную информацию о движениях ^{белков 3,4,5}, но часто ограничены молекулярным размером, требованиями к образцам или сложностью экспериментов. Достижения в области крио-ЭМ позволили определить структуру с высоким разрешением для крупных и гетерогенных систем, что позволило анализировать вариабельность конформаций внутри популяций частиц. 3D-анализ вариабельности (3DVA), реализованный в^{CryoSPARC 1}, разбивает наборы данных крио-ЭМ частиц на основные компоненты, описывающие доминирующие непрерывные режимы структурных вариаций. В сочетании с уточнением вариабельности в^{Phenix 2} этот подход создаёт атомарные модели, соответствующие дискретным позициям вдоль каждого главного компонента, что позволяет визуализировать и сравнивать альтернативные конформации, полученные на основе экспериментальных данных.

Этот протокол лучше всего подходит для наборов данных крио-ЭМ, реконструированных с почти атомарным или промежуточным разрешением (обычно ~2-6 Å). При более высоких разрешениях рабочий процесс может фиксировать перестановки магистрали и ограниченную вариабельность^{сайдчейна 6}, тогда как при более низких разрешениях он более подходит для выявления движений на уровне доменных или вторичных структур ^2,7. Метод подходит для фиксации доминирующих непрерывных режимов движения, которые широко заселены в наборе данных, таких как движения шарниров, доменное дыхание или скоординированные перестановки между доменами или субъединицами. Достаточное количество частиц и угловое покрытие крайне важны, а интерпретация может быть ограничена в гибких или слабо разрешенных областях, где позиции боковых цепей остаются неоднозначными. По сравнению с стратегиями сфокусированной^{классификации 8} или расширенными подклассификациями, рабочий процесс уточнения 3D-вариабельности представляет конформационную гетерогенность как непрерывные траектории, а не дискретные классы. Это делает метод особенно полезным для исследовательского анализа ферментов, молекулярных машин и многодоменных комплексов, которые, как ожидается, будут отражать несколько конформаций.

Человеческая аспарагин-синтетаза (ASNS) используется в качестве иллюстративного примера реализации протокола. ASNS — это глутамин-зависимая амидотрансфераза, состоящая из двух функциональных доменов, соединённых внутримолекулярным аммиачным^{туннелем 9,10}. Предыдущие исследования предполагали, что конформационные изменения с такими остатками, как Arg-142, способствуют модуляции этого^{туннеля 6}. В этой статье ASNS служит исключительно представительной системой для демонстрации того, как 3DVA и уточнение вариабельности генерируют карты изменчивости, усовершенствованные ансамбли атомных моделей и визуализации. Детальная механистическая интерпретация отложена в разделах «Результаты» и «Обсуждение». Хотя молекулярно-динамические симуляции (МД) часто используются как дополнительный подход для исследования конформационных^{ландшафтов 11,12}, МД для этого протокола не требуется. Сравнения с моделированием MD могут выполняться в качестве дополнительного анализа, но описанный здесь рабочий процесс (рисунок 1) сосредоточен исключительно на извлечении и визуализации конформационной гетерогенности из крио-ЭМ-данных.

Рисунок 1. Обзор рабочего процесса. Консенсусная карта крио-ЭМ восстанавливается из данных отдельных частиц и подвергается трёхмерному анализу изменчивости (3DVA) для создания карт изменчивости вдоль основных компонентов. Уточнение вариабельности (Phenix.varref) использует консенсусную атомарную модель для генерации соответствующих атомных моделей для визуализации и сравнения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Protocol

1. Подготовка данных

1. Генерация консенсусной электромагнитной карты
   1. Используйте одночасточную криоэлектронную микроскопию (крио-ЭМ) для определения консенсусной трёхмерной структуры макромолекулярного комплекса.
   2. Витрифицируйте образцы на криосетках и снимайте с помощью высоковольтного пропускающего электронного микроскопа, оснащённого детектором прямых электронов.
   3. Обработайте собранные фильмы для коррекции движения, вызванного пучком, оцените параметры изображения и выберите изображения частиц.
   4. Выполнить итеративную классификацию и уточнение частиц для создания консенсусной электромагнитной карты.
   5. Выполняйте обработку данных с помощью CryoSPARC (v4 или выше)¹³, поскольку будет реализован 3D-анализ вариабельности (3DVA).
2. Сгенерировать консенсусную модель
   1. Постройте атомарную модель и доработайте её в соответствии с консенсусной картой. Валидация качества усовершенствованной модели с использованием стандартных критериев
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для ASNS структура определялась с помощью шаблонной стратегии отбора частиц. Шаблон, полученный из рентгеновской структуры DON-модифицированного человеческого ASNS (PDB 6GQ3)⁹, использовался для эффективного отбора высококачественных частиц в CryoSPARC¹³. Эти частицы прошли итеративные циклы двумерной классификации, реконструкции Ab initio и гетерогенной и неоднородной доработки с наложенной C2-симметрией, что дало консенсусное отображение 3,5 Å. Атомная модель была создана путём использования кристаллической^{структуры 9} в EM-карте, затем уточнения в реальном пространстве в^{Phenix 14,15} и ручной корректировки в Coot¹⁶, что дало итоговую консенсусную структуру ASNS,^{описанную 6}.

2. Проведение 3D-анализа вариабельности (3DVA)

1. Используйте стек частиц и маску (не окончательное уточнённое отображение) для окончательного уточнения
   ПРИМЕЧАНИЕ: Часто результаты неоднородной доработки используются для 3DVA.
2. Создайте задание 3D-вариабельности в CryoSPARC. Ввод стека частиц и маска из задачи неравномерной очистки.
3. Установите количество режимов для решения: число основных компонентов (PC) на 5.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку макромолекулярные структуры существуют в трёхмерном пространстве, обычно требуется как минимум три ПК для описания их основных пространственных режимов движения. Чтобы не упускать из виду дополнительные, потенциально более мелкие, но функционально значимые вариации конформаций, были включены ещё два ПК.
4. Установите разрешение фильтра на 4.0 Å, а высокочастотное — на 20. Оставьте все остальные параметры по умолчанию. Начинай работу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: «Разрешение фильтра» 4.0 Å было настроено так, чтобы соответствовать общему качеству набора данных, при этом избегая перенасадки из-за шума на высоких частотах. Поскольку окончательная консенсусная карта была определена с разрешением 3,5 Å, применение немного более низкого разрешения фильтра (4,0 Å) обеспечило фокус анализа вариабельности на реальных структурных движениях, а не на шуме рядом с пределом разрешения.
5. Получите набор объемов изменчивости в качестве выхода (рисунок 2A)

3. Выполнение 3D-отображения вариабельности

1. Создайте задание 3D-отображения вариабельности в CryoSPARC, чтобы визуализировать непрерывные изменения конформаций, выявленные 3DVA.
2. Введите стек частиц и объемы вариабельности, полученные из задания 3DVA.
3. Выберите Simple как выходной режим (см. ниже).
4. Установите разрешение фильтра на 4.0, а высокочастотное — на 20. Оставьте все остальные параметры на их значениях по умолчанию. Начинай работу.
5. Получите 20 отображений изменчивости в качестве результата (кадры от 0 до 19), соответствующих 5 главным компонентам (PC) от 0 до 4 (рисунок 2B)
   ПРИМЕЧАНИЕ: «Простой режим» в программе 3D-отображения вариабельности обеспечивает простую визуализацию изменений конформаций по каждому основному компоненту. Этот режим генерирует линейные траектории между экстремальными состояниями, определёнными 3DVA, что позволяет чётко и прямо интерпретировать движения внутри популяции частиц.

4. Подготовка данных для фильмов и уточнение переменных Phenix 3D

1. Скачайте карты вариабельности 3DVA: скачайте zip-файлы с картами вариабельности для ПК 0-4 (всего пять архивов) с CryoSPARC.
2. Организовать каталоги: создать родительскую папку (например, 3DVA/). Внутри создайте по одной подпапке для каждого главного компонента (comp0, comp1, comp2, comp3, comp4).
3. Переместите каждый zip в соответствующую папку и распакайте содержимое.
4. Убедитесь, что каждая папка содержит 20 карт вариабельности (кадры 0-19), и повторите для comp1-comp4.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте отдельные папки для каждого основного компонента, чтобы предотвратить смешивание кадров между ПК.

5. Подготовьте быстрые фильмы в UCSF Chimera (по желанию) ¹⁷

1. Откройте инструмент Volume Series: запустите Chimera, затем перейдите в раздел Tools → Volume Data → Volume Series. Откроется новое окно серии томов .
2. Загрузите карты: нажмите «Открыть» и выберите 20 отображений, соответствующих одному основному компоненту (например, comp0).
3. Настройте параметры визуализации: откройте Volume Viewer, установите подходящий порог плотности и назначьте цвет карте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом примере использовался небесно-голубой (рисунок 3).
4. Движение предварительного просмотра: в окне Volume Series установите направление воспроизведения на Осцилляцию, затем нажмите Воспроизведение, чтобы показать непрерывный переход от кадра 0 → 19 → 0.
5. Повторяйте для дополнительных компонентов: повторяйте шаги 5.2–5.4 для других основных компонентов по необходимости.
6. Сгенерируйте файл фильма с помощью командного входа: экспортируйте фильм, открыв командную строку Chimera и запустив Supplementary Coding File 1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Серия MRC из 20 кадров на компонент (например, compX_frame000-019.mrc) — это входные данные для уточнения 3D-переменных Phenix. Держите папки компонентов отдельно (comp0-comp4), чтобы избежать смешивания кадров между ПК.

6. Генерация модели путём уточнения вариабельности в фениксе

ПРИМЕЧАНИЕ: Phenix.varref можно выполнять из любой папки, если указаны полные пути к входным картам и модели. Однако для ясности организации рекомендуется выполнять доработку в отдельной подкаталоге для каждого ПК.

1. Скопируйте окончательный усовершенствованный файл консенсусной модели в подкаталог, соответствующий каждому ПК.
2. Из каждого подкаталога запускайте Phenix.varref из командной строки, используя следующий синтаксис:
   phenix.varref consensus_model.pdb *frame_*.mrc resolution=4 nproc=20 models_per_map=50
3. Установите разрешение на 4.0 Å, чтобы соответствовать эффективному разрешению карт 3DVA
4. Установите nproc на количество доступных процессоров (20 в этом примере, но это может варьироваться в зависимости от доступных вычислительных ресурсов)
5. Установите models_per_map на 50 моделей (по умолчанию).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой карты генерируется 50 моделей с ограничениями, отрегулированными под разрешение данных 3DVA. Наиболее подходящая модель для каждой карты сохраняется автоматически. Полученный выходной файл содержит 20 усовершенствованных моделей, соответствующих 20 картам вариабельности. Выход состоит из PDB-пакета, содержащего 20 доработанных моделей и отдельные файлы карт.
6. Не применяйте дополнительную резкость карты во время уточнения вариабельности. Используйте карты изменчивости, сгенерированные CryoSPARC (отфильтрованными по 4.0 Å), напрямую в phenix.varref.

7. Визуализация

1. Откройте PDB-набор в^{ChimeraX 18} , чтобы одновременно загрузить все 20 усовершенствованных моделей.
2. Используйте панель «Модели» для выборочного отображения отдельных кадров или конкретных моделей, представляющих интерес, для сравнения и анализа (рисунок 4). В качестве альтернативы каждую усовершенствованную модель можно открыть отдельно в ChimeraX или Chimera.

8. Подготовка данных к анализу

ПРИМЕЧАНИЕ: Запуск вышеуказанного синтаксиса генерирует PDB-набор, содержащий 20 переменных моделей и каждую отдельную карту. Для большинства анализов требуется только две модели — соответствующие кадру 0 и кадру 19, так как они представляют два экстремальных конформационных состояния вдоль выбранного главного компонента (PC).

1. Откройте набор PDB в ChimeraX, выберите модель 1.1 (кадр 0) и модель 1.20 (кадр 19), и сохраните каждую модель как отдельный PDB-файл (рисунок 4).
2. Отредактируйте полученные PDB-файлы, чтобы выделить интересующие остатки. Это можно сделать вручную или с помощью Phenix.pdb.tools.
3. Сравните два модифицированных PDB-файла, чтобы выявить конформационные изменения в магистрали или боковых цепях.
4. Для сравнения двух PDB-моделей наложите модифицированные структуры с помощью функции MatchMaker в Chimera.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для надёжного выравнивания MatchMaker обычно требует не менее 10-15 перекрывающихся остатков. В нашем случае было проанализировано только 6 остатков; однако успешная суперпозиция была достигнута благодаря использованию гомодимерной природы ASNS — в цепи A осталось всего 6 остатков, а цепь B осталась целой и служила эталоном для выравнивания.

Results

В этом разделе представлены репрезентативные результаты, полученные в результате 3D-анализа изменчивости (3DVA) и рабочего процесса уточнения вариабельности, а также предоставляются рекомендации по их интерпретации. Человеческая аспарагиновая синтетаза (ASNS) используется как иллюстративный набор данных для демонстрации успешных результатов, распространённых артефактов и сравнительных анализов, обеспечиваемых протоколом. Полный набор карт изменчивости, полученных на основе 3DVA, и соответствующие уточнённые модели, созда...

Discussion

Ключевые шаги протокола и точки принятия решений
Эффективное использование этого протокола зависит от нескольких ключевых этапов рабочего процесса. Качество стека частиц и маски, используемых для окончательной доработки крио-ЭМ, имеет решающее значение, поскольку анализ 3D-изменчивости (3DVA) работает непосредственно на этих входах, а не на постобработанной карте. Выбор числа основных компонентов (PC) должен отражать размер набора данных и ожидаемую сложность; Слишком...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CryoSPARC v4.4+	Структурная биотехнология	https://cryosparc.com	Программное обеспечение для обработки крио-ЭМ
Phenix v1.24+	Консорциум Phenix	https://phenix-online.org	Программное обеспечение для уточнения вариабельности
UCSF Химера	Ресурс по биокомпьютерам, визуализации и информатике, UCSF	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/	Программное обеспечение для молекулярной визуализации
UCSF ChimeraX	Ресурс по биокомпьютерам, визуализации и информатике, UCSF	https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/	Программное обеспечение для молекулярной визуализации
CPPTRAJ	Программный комплекс молекулярной динамики AMBER	https://amberhub.chpc.utah.edu/cpptraj/	Инструменты Python для вычисления RMSF
Linux Workstation (собственная система на базе GPU)
Корпус рабочей станции	Supermicro	https://www.supermicro.com	Корпус рабочей станции: Supermicro CSE-743TQ-1200B-SQ 1200W 4U Server Super Chassis
CPU	Intel	https://www.intel.com	Процессор: XEON E5-2690V3 x2
Материнская доска	Supermicro	https://www.supermicro.com	Материнская плата: Supermicro Extended ATX DDR4 LGA 2011 Motherboard X10DAI-O
Память	Крайне важно	https://www.crucial.com	Память: Critical 64GB Kit (16GBx4) DDR4 2133 (PC4-2133) DR x4 ECC зарегистрирован. 288-контактная серверная память CT4K16G4RFD4213 / CT4C16G4RFD4213 x2
Жёсткий диск	Western Digital	https://www.westerndigital.com	HDD: WD RE 4TB Enterprise Жёсткий диск
КОНТРОЛЛЕР RAID	LSI Logic	https://www.broadcom.com	RAID-КОНТРОЛЛЕР: LSI LOGIC Комплект MegaRAID SAS 9271-8i
GPU	NVIDIA	https://www.nvidia.com	Видеокарта Quadro M6000 с 24 ГБ памяти GDDR5