Характеристика атаксии, вызванной опухолью, в модели мышей вестибулярной шванномы

Краткое содержание

Мы разработали панель поведенческих тестов для изучения опухолевой атаксии и оценки терапии, сохраняющих неврологическую функцию в мышиной модели вестибулярной шванномы.

Аннотация

Связанный с NF2 шванноматоз (NF2-SWN) — это аутосомно-доминантный синдром предрасположенности к опухоли, вызванный мутациями зародышевой линии в гене-супрессоре опухоли NF2 . Заболевание характеризуется развитием двусторонних вестибулярных шванном (ВС), которые постепенно увеличиваются и приводят к потере слуха, дисбалансу и симптомам атаксии, серьёзно влияющим на качество жизни пациентов. В настоящее время не существует одобренных FDA фармакологических методов лечения. Среди неврологических дефицитов атаксия остаётся особенно изнуряющим, но недостаточно изученным проявлением, во многом из-за отсутствия надёжных доклинических моделей для её оценки. В этом исследовании мы разработали набор поведенческих тестов для систематической оценки опухолевой атаксии в ортотопической мышиной модели потери слуха и атаксии, ассоциированной с VS. Эти тесты позволяют количественно измерить нарушения равновесия и моторной координации, возникающие из-за опухолевой нагрузки. Эта экспериментальная платформа позволяет механистически изучать дисфункцию мозжечка, вызванной опухолями, и предоставляет ценный инструмент для доклинической оценки терапевтических стратегий. Интегрируя поведенческие оценки с биологией опухолей и тестами слуха, этот подход облегчает характеристику как подавляющих опухоли, так и нейропротективных эффектов лечения. В конечном итоге эти анализы предлагают универсальную структуру, которую можно применить и к другим неврологическим заболеваниям, характеризующимся атаксией, расширяя их полезность за пределы NF2-SWN.

Введение

Связанный с NF2 шванноматоз (NF2-SWN) — это редкий, преимущественно наследственный синдром предрасположенности к опухоли, вызванный мутациями в гене-супрессоре опухоли NF2, который кодирует цитоскелетный белок^{Merlin 1}. Потеря функции Мерлина нарушает сигнальные пути, регулирующие пролиферацию, адгезию и выживаемость клеток, предрасполагая поражённых людей к развитию множественных доброкачественных опухолей нервной системы. Отличительной чертой NF2-SWN является образование двусторонних вестибулярных шванномов (VS) — незлокачественных опухолей, производящихся от клеток Шванна, возникающих вдоль вестибулокохлеарных нервов. Эти опухоли постепенно увеличиваются, сдавливая соседние нервные структуры и приводя к сенсоневральной потере слуха, тиннитусу и дисфункции лицевых^{нервов 2}.

Пациенты с двусторонними ВС часто страдают прогрессирующей травмой вестибулярного нерва и вестибулярного аппарата внутреннего уха, что приводит к изнуряющей вестибулярной дисфункции, проявляющейся в виде хронического дисбаланса, атаксии и нестабильности походки, что серьёзно ухудшает подвижность и качество^{жизни 3}. Степень вестибулярной дисфункции часто коррелирует с опухолевой нагрузкой и воздействием нервов. Эти симптомы часто сохраняются даже после контроля опухолей или усилий по сохранению слуха, что указывает на сложные нейробиологические механизмы, выходящие за рамки механической^{компрессии 4,5}. Хотя клинические инструменты, такие как инвентаризация инвалидности при головокружении, анализ походки, тестирование вестибуло-глазного рефлекса (VOR) и постурография, используются для количественной оценки вестибулярных нарушений, основные механизмы опухолевой атаксии остаются слабо^{изучены.} Несмотря на достижения в молекулярном понимании и внедрение таргетных методов терапии, таких как бевацизумаб, до сих пор не существует одобренного FDA лечения, которое надежно сохраняло бы слух и функцию равновесия у пациентов с NF2-SWN. Управление вестибулярными симптомами остаётся в основном поддерживающим, что подчёркивает серьёзную неудовлетворённую клиническую потребность.

Одним из основных препятствий для улучшения клинического лечения атаксии, ассоциированной с VS, является отсутствие доклинических моделей, которые точно воспроизводят наблюдаемые у пациентов нарушения вестибулярной и моторной координации. Большинство существующих моделей VS на животных сосредоточены на росте опухоли или потере слуха, не повторяя характерные нарушения баланса и координации. Кроме того, стандартизированные поведенческие анализы для объективной оценки атаксии и вестибулярной дисфункции в доклинических условиях недостаточно доказаны. Этот разрыв затрудняет механистические исследования и ограничивает оценку кандидатов терапии, направленных на сохранение вестибулярной функции.

Здесь мы сообщаем о разработке модели мышей VS, демонстрирующей измеримые фенотипы атаксии, а также о панели поведенческих анализов, специально разработанных для количественной оценки атаксии, вызванной опухолью. Эта модель предоставляет столь необходимую платформу для изучения механизмов, лежащих в основе ВС-ассоциированной вестибулярной дисфункции, а также для оценки эффективности терапевтических вмешательств, направленных на восстановление баланса, координации и общей неврологической функции у пациентов с NF2-SWN.

Протокол

Эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколом, утверждённым Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Массачусетской больницы генерала Бригама (MGB).

1. Животная модель

1. Инокулировать клетки Nf2^-/- (мышиные ^Nf2-/- клетки Шванна, экспрессирующие репортёрный ген Gaussia luciferaza, Gluc) в иммунокомпетентных мышей C57/FVB. Используя стереотаксическое устройство для инъекций (рисунок 1A), каждой мыши введите 1 мкл 2 500 опухолевых клеток в область CPA^{правого полушария 4,6}.
2. Используйте как самцов, так и самок мышей (соотношение 1:1) в возрасте 8–12 недель, чтобы обеспечить достаточную статистическую эффективность и изучить возможные различия в полу. Домашних мышей собирают группами по 4 в клетке в 12-часовом цикле свет/темнота, при этом корм и вода доступны по свободе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая, что шванномы развиваются в вестибулярных нервах пациентов, мы применили модель угла мозжечка (CPA). Модель CPA повторяет внутричерепную микросреду ВС.
3. Группа Шам: Для оценки влияния операции на животных и имплантации опухолевых клеток на атаксию включите группу фиктивной хирургии, в которой мыши проходили фиктивную операцию и вводили физиологический раствор в область CPA.
4. Включите в качестве контроля группу мышей без опухоли.
5. Для мониторинга прогрессирования опухоли используйте клетки Nf2^-/ -, экспрессирующие репортёрный ген Gaussia luciferaza (Gluc), и измеряйте плазменный Gluc каждые 3 дня после имплантации.
6. Кратко, соберите 13 мкл крови в ЭДТ-трубки, чтобы предотвратить свертываемость. Перенесите образец крови в пластину с 96 лунками и измерьте активность Gluc как описано^ранее: 6,7,8,9.

2. Тесты на атаксию

1. Проведите четыре поведенческих анализа в фиксированной последовательности, чтобы минимизировать вариабельность между животными. Проводите тесты в следующем порядке: (1) тест на захват задних конечностей, (2) тест на выступ, (3) оценка походки и (4) оценка кифоза. Оставьте минимальный интервал отдыха между тестами, возвращая мышь в домашнюю клетку. Следите за животным в периоды отдыха и переходите к следующему тесту только после возвращения обычного исследовательского поведения. Прекратите тестирование, если наблюдаются признаки чрезмерного стресса или усталости. Завершите полный набор из четырёх тестов атаксии для когорты из 10 мышей примерно за 45-60 минут, включая интервалы отдыха между тестами.
2. Тест на захват задней конечности
   ПРИМЕЧАНИЕ: Тест на захват задних конечностей оценивает нейромышечную координацию, моторный тонус и контроль осанки у мышей. У мышей с атаксией наблюдается втягивание или сцепление задних конечностей к животу, что отражает нарушенную моторную координацию и регуляцию мышечного^{тонуса 5}.
   1. Аккуратно держите мышь за основание хвоста, обеспечивая надёжный, но лёгкий захват, чтобы избежать дискомфорта. Поддержите животное на крышке или руке клетки перед подъёмом, чтобы уменьшить реакцию на испуг.
   2. Поднимите мышь медленно, чтобы она была подвешена в воздухе с полностью вытянутым телом и без препятствий. Держите мышь не менее чем на 10 см над клеткой или тестовой поверхностью.
   3. Сохраняйте подвешенное положение примерно 10 секунд и наблюдайте положение задних конечностей и хвоста, не вращая и не раскачивая животное.
   4. Оцените осанку задних конечностей, как описано ниже.
      1. Определите нормальную осанку, когда обе задние конечности вытянуты наружу и прочь от живота.
      2. Определите аномальную осанку, когда одна или обе конечности отступают к брюшной полости или перекрываются, что указывает на сцепление задних конечностей, связанное с атаксией или неврологическими нарушениями.
   5. Записывайте поведение с помощью заранее определённой системы оценки или запишите короткое видео для слепого пост-хок анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ограничите каждый тест ≤10 секундами, чтобы минимизировать стресс.
3. Тест на уступ
   ПРИМЕЧАНИЕ: Тест на выступе оценивает баланс, координацию и мелкую моторику у мышей. Он измеряет способность животного ходить по узкому уступу и безопасно спускаться в домашнюю клетку, не теряя равновесия. Мыши с дисфункцией мозжечка или вестибулярной атаксией обычно проявляют скальзывания, падения или нестабильную осанку во время этой^{задачи 5}.
   1. Разместите клетку на стабильной, ровной поверхности на уровне скамейки (~1 м).
   2. Соедините один конец тестовой клетки (рисунок 1C) с корпусом (рисунок 1D), убедившись, что между клетками нет вертикального зазора или препятствий, чтобы мышь могла плавно и естественно спускаться в свою домашнюю клетку (рисунок 1B) без прыжков и падения.
   3. Разместите видеокамеру на штативе лицом к выступу под углом 30°–45°, чтобы запечатлеть как боковое движение, так и снижение.
   4. Настройте освещение, чтобы минимизировать блики и обеспечить чёткую видимость конечностей и хвоста мыши.
   5. Аккуратно поднимите мышь за основание хвоста и поддерживайте её тело другой рукой. Положите мышь в центр выступа так, чтобы все четыре лапы были на поверхности. Отпускайте хвост только тогда, когда мышь выглядит сбалансированной и настороженной.
   6. Позвольте мыши свободно ходить по выступу без внешних подсказок. Записывайте мышь не менее 10 секунд или пока она не опустится в клетку.
   7. Наблюдайте за его способностью балансировать на карнизе, не поскальзываясь, и идти вдоль края к клетке или платформе.
   8. Проведите три независимых испытания на мышь с интервалом отдыха ~2 минуты между попытками. Очистите поверхность уступа между животными с помощью 70% этанола, чтобы удалить запахи.
   9. Проводите все тесты в тихой обстановке с равномерным освещением и минимальным фоновым шумом или вибрацией. Избегайте чрезмерного повторения теста в один и тот же день, так как усталость и влияние обучения могут влиять на результаты.
4. Оценка походки
   ПРИМЕЧАНИЕ: Тест оценки походки оценивает координацию движения, схему шага и устойчивость осанки у свободно движущихся мышей. Мыши с атаксией часто демонстрируют укорочённую длину шага, неустойчивые движения и нерегулярное положение лап, что указывает на нарушения координации и контроля^{равновесия 5}.
   1. Выложите ровную взлётно-посадочную полосу белой бумагой (8,5 × 11 дюймов). Поставьте домашнюю клетку в конце бумаги, чтобы мышь могла пройти по бумаге.
   2. Слегка покройте передние и задние лапы двумя контрастными цветами (например, синим для передних лап, красным для задних) с помощью нетоксичной тушильной подушечки (рисунок 1E).
   3. Разместите мышь на стартовом конце подиума и дайте ей свободно двигаться по бумаге без внешнего давления.
   4. Наблюдайте и измеряйте следующие параметры:
      Длина шага: расстояние между последовательными положениями одной и той же лапы.
      Ширина основания: боковое расстояние между левой и правой задними следами.
   5. Выполните от двух до трёх забегов на мышь, давая возможность отдохнуть между тестами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте нетоксичные, быстросохнущие чернила и убедитесь, что покрыты только подушечки лап. Заменяйте бумагу после каждого испытания, чтобы избежать размазывания. Наносите чернила экономно, чтобы избежать размытия следов, так как избыток чернил снижает точность измерения шага.
5. Оценка кифоза
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оценка кифоза оценивает выравнивание позвоночника и аномалии осанки во время естественного передвижения. Мыши с неврологическими или мышечными нарушениями часто демонстрируют стойкую дорсальную кривизну или сутулость^{позвоночника 5}.
   1. Положите мышь на поверхность и дайте ей свободно ходить или исследовать несколько секунд. Избегайте пугать животное, так как резкие движения могут временно изменить осанку.
   2. Запишите короткое видео из бокового вида, чтобы задокументировать кривизну ствола.
   3. Наблюдайте за осанкой мыши во время ходьбы, сосредотачиваясь на выравнивании позвоночника и изгибе туловища, как описано ниже.
      1. Определите нормальную осанку, когда мышь сохраняет прямую или слегка выгнутую спину с плавными движениями тела.
      2. Определите аномальную осанку, когда у мыши проявляется кифоз, характеризующийся аномально согнутым или изогнутым позвоночником, жёстким стволом и сниженной гибкостью при походке.

3. Анализ теста на атаксию

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все поведенческие оценки наблюдателем, ослеплённым для распределения экспериментальных групп, чтобы минимизировать предвзятость наблюдателя.

1. Оценка тестов на карнизе
   1. Если мышь плавно идёт по карнизу, сохраняет равновесие и спускается в клетку без поскальзывания, ставьте счёт 3.
   2. Присвоите балл 2, если у мыши есть лёгкое нарушение, например, колебание или небольшое скольжение лапы, но она благополучно восстанавливается и опускается.
   3. Присвоите балл 1, если у мыши умеренное нарушение, включая частые поскальзывания, присевшу, чрезмерное использование хвоста для баланса или задержку снижения.
   4. Если мышь проявляет серьёзное нарушение, не может удерживать равновесие, падает с выступа или отказывается двигаться, ставьте балл 0.
2. Оценка теста с зацепкой задних конечностей
   1. Присвоите счёт 3, если мышь постоянно демонстрирует задние конечности, выведенные наружу без признаков сцепления.
   2. Присвоите балл 2, если у мыши наблюдается лёгкое нарушение, например, периодическое втягивание одной задней конечности.
   3. Присвоить балл 1, если у мыши наблюдается умеренное нарушение, характеризующееся частичным втягиванием обеих задних конечностей, расположенных рядом с брюшком.
   4. Присвоить балл 0, если мышь проявляет серьёзное повреждение, при этом обе задние конечности плотно прижаты к брюшной животу большую часть периода наблюдения.
3. Оценка походки
   1. Присвоите счёт 3, если мышь идёт ровно, скоординированно и движется по прямым.
   2. Присвоите балл 2, если у мыши наблюдаются лёгкие нарушения, например, медленное движение с лёгкой неустойчивостью или боковым отклонением, хромание в сторону или движение по широким, круговым маршрутам.
   3. Присвоите балл 1, если мышь проявляет умеренное нарушение, включая чистую походку, ходьбу двумя или тремя лапами, волочение части тела или движение по плотным кругам.
   4. Если мышь проявляет серьёзное нарушение, не может эффективно передвигаться, остаётся на месте или проявляет неконтролируемые перекатывания в сторону.
4. Подсчёт очков кифоза
   1. Присвоите балл 3, если мышь остаётся ровной, прямо назад во время отдыха и ходьбы.
   2. Если у мыши есть лёгкое нарушение, с лёгким изгибом спины в покое, который выпрямляется при движении, присвоите балл 2.
   3. Присвоите балл 1, если у мыши умеренное нарушение, а спина в покое остаётся изогнутой при ходьбе.
   4. Если мышь проявляет серьёзное нарушение, при этом на протяжении всего периода наблюдения она сильно сутулится и ограничивает нормальное движение, ставьте балл 0.

4. Межоценочная оценка надёжности

1. Обучайте наблюдателей с использованием репрезентативных видео перед формальным оцениванием для стандартизации интерпретации критериев оценки.
2. Чтобы минимизировать предвзятость наблюдателей, оценивайте все поведенческие тесты независимо двумя обученными наблюдателями, ослеплёнными по группе лечения и экспериментальной точке времени.
3. Количественно оценить надёжность между оценщиками для каждого поведенческого анализа с помощью коэффициента каппы Коэна. Толкуем значения каппы следующим образом: <0,40, плохое согласование; 0,40-0,60, умеренное согласие; 0,60-0,80, существенное согласие; и >0,80 — почти идеальное согласие.
4. Устраните любые расхождения в оценках совместным просмотром записанных видео и достигните консенсусного^{балла 5}.

Результаты

Рост опухоли CPA вызывает атаксию в модели мышей VS

Для оценки опухолевой атаксии мы выделили две экспериментальные когорты. Во-первых, чтобы оценить влияние хирургии на животных и имплантации опухолевых клеток на атаксию, мыши прошли фиктивную операцию и введение физиологического раствора в область CPA. Симптомы атаксии у мышей фиктивной группы сравнивались с симптомами у неоперированных контрольных мышей. Во второй когорте опухоли Nf2^-/- были введены в об...

Обсуждение

Описанные здесь поведенческие анализы предоставляют надёжную и количественную основу для оценки дефицитов атаксии и моторной координации в мышиных моделях ВС и связанных с ними вестибулярных расстройств. Адаптированные из устоявшихся протоколов для моделей нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Хантингтона и спиномозжечковые^{атаксии 10}, эти тесты хорошо подходят для характеристики опухоль-индуцированной вестибулярной дис...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Сыворотка плода быка	ThermoFisher	A5670701
Микропластинный люминометр GloMax 96;	Promega	GM3000
Процедура McKesson blue под накладкой	МакКессон	75402
Добавка для роста клеток Шванна	ScienCell	1752