Методическая статья

Отбор образцов окружающей среды ДНК с судов для наблюдения за китами для мониторинга китообразных

1.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70334

⸱

10 апреля 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University of Iceland's Húsavík Research Center, Húsavík, Iceland, 2Applied Animal Ecology Research Unit, Department of Zoology, University of Innsbruck, 3Politecnico di Milano DICA Civil and Environmental Engineering Department, 4Department of Life and Environmental Science DISVA, Marche Polytechnic University, 5CetaceanWatching Lda, 6Tethys Research Institute, 7WasserCluster Lunz - Biologische Station GmbH

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает стандартизированный рабочий процесс по сбору образцов экологической ДНК (eDNA) китообразных с судов для наблюдения за китами. Приоритетом является осуществимость для исследователей и обученных гражданских учёных, а условия окружающей среды, время фильтрации, мутность и логистика на борту определяют практические пределы его применения.

Аннотация

Экологическая ДНК (eDNA) предлагает неинвазивный подход к мониторингу китообразных, однако её широкое применение на операционных платформах требует стандартизированных и реализуемых рабочих процессов отбора проб. В данном исследовании описывается протокол сбора eDNA китообразных с судов для наблюдения за китами, разработанный для внедрения исследователями и подготовленными гражданскими учёными в определённых экологических и логистических условиях. Этот подход интегрирует сбор морской воды с помощью флюкпринта, бортовую фильтрацию с самосохраняющимися фильтрами и молекулярный анализ на последующих этапах для поддержки оперативно осуществимого генерации данных в реальных условиях. Протокол был реализован в ходе координированных полевых кампаний, проведённых в 2024 году в трёх регионах Северной Атлантики и Средиземного моря (Исландия, Португалия и Италия), охватывающих несколько таксонов китообразных. Эффективность метода оценивалась с помощью недавно разработанного видоспецифического количественного ПЦР-теста, направленного на митохондриальную ДНК горбатого кита (Megaptera novaeangliae), что демонстрировало стабильную скорость обнаружения при различных экологических и логистических условиях. Предоставляя практические рекомендации по внедрению в полевых условиях и контролю загрязнения, этот протокол поддерживает воспроизводимый мониторинг китообразных на основе eDNA и способствует межрегиональной сопоставимости в исследованиях морского биоразнообразия.

Введение

Эффективное управление морской мегафауной, включая китообразных и других широкомасштабных видов, крайне важно для сохранения биоразнообразия. Будучи ведущими хищниками и инженерами экосистем, китообразные вносят вклад в трофическую регуляцию, цикл питательных веществ и экологическую устойчивость в океаническихбассейнах 1. Однако создание всесторонних экологических знаний о этих высокомобильных видах остаётся сложным и часто зависит от ресурсоёмких программмониторинга 2. Традиционные методы, такие как биопсия, фотоидентификация, пассивный акустический мониторинг, спутниковая телеметрия и аэрофотосъёмки, дали критическое понимание экологической средыкитообразных 3, 4, 5, 6, 7, однако эти методы часто дорогостоящие, логистически требовательные, пространственно ограниченные или инвазивные и подлежат строгому этическому и нормативномуконтролю 8. В результате частота отбора проб, географическое покрытие и возможности участия заинтересованных сторон часто ограничены, особенно для изучения широкомасштабных или редких видов.

Отбор проб окружающей среды ДНК (eDNA, определяемая как генетический материал, отбрасываемый организмами в их среду) стал мощным, неинвазивным инструментом для обнаружения водных видов из водных образцов 9,10. Видоспецифические количественные ПЦР-анализы (qPCR), направленные на фрагменты митохондриальной ДНК, позволяют высокочувствительному и специфическому обнаружению морских таксонов, включаякитообразных 11,12,14. Помимо обнаружения наличия/отсутствия, относительная сила сигнала eDNA и целевые последовательности ДНК предоставляют ценную информацию, связанную с близостью, относительной численностью и генетическими паттернами на уровнепопуляции 15,16,17,18,19. Кроме того, образцы окружающей среды, собранные рядом с китами, часто содержат ДНК сопутствующих таксонов, включая виды добычи, симбионтов и паразитов, что подтверждает более широкие экологическиеассоциации 20,21,22. В совокупности эти достижения демонстрируют потенциал подходов на основе eDNA для дополнения традиционных методов и расширения сферы исследований китообразных в морскихсистемах 23,24.

Несмотря на эти преимущества, мониторинг морской мегафауны на основе eDNA сталкивается с постоянными трудностями, связанными с репрезентативным отбором проб, пространственным покрытием и методологической воспроизводимостью, особенно в открытых морских системах, где ДНК быстро разбавляетсяна 25,26, а целевые виды имеют обширные ареалы и встречаются с низкой плотностью. Для решения этих ограничений необходимы масштабируемые, операционно осуществимые фреймворки выборки, которые можно применять на широких пространственных и временных масштабах. Инициативы в области гражданской науки доказали свою эффективность в расширении сбора экологических данных, одновременно способствуя общественному участию в охране морских ресурсов, что делает их перспективным направлением для масштабного мониторинга на основеeDNA 27, 28, 29 и 30. Суда для наблюдения за китами представляют собой малоиспользуемую, но очень подходящую платформу для отбора проб eDNA, обеспечивающую регулярный доступ к средам обитания китообразных в сезоны и регионы31, 32, 33. Глобальная индустрия наблюдения за китами поддерживает обширные операционныесети 34, и предыдущие исследования показали возможность сбора eДНК китообразных с других оппортунистических платформ, таких как коммерческие суда, паромы35, а также с помощью целевого отбора проб, интегрированных с фотоидентификацией и поведенческиминаблюдениями 36,37. Быстрое расширение исследований eDNA привело к значительным методологическим инновациям, однако биологическая изменчивость между морскими системами и темпы технологического прогресса усложняют усилия по гармонизации протоколов и обеспечению сопоставимости между исследованиями. Поэтому стандартизированные, но адаптируемые полевые методологии крайне важны, особенно для крупномасштабных многонациональных мониторинговыхинициатив 38.

Обнаружение eDNA зависит от объёма фильтрованной воды, стратегии фильтрации, материала фильтра и размера пор. Фильтрация больших объёмов обычно увеличивает выход eDNA и вероятность обнаружения для мишеней позвоночных, включаякитообразных 39, 40, 41, 42. Однако в продуктивных или мутных водах эффективность фильтрации может быть ограничена быстрым засорениемфильтра 43,44, что требует компромиссов между достижимым объёмом и эксплуатационнойосуществимостью 45,46. Отбор проб с флюкпринтов — поверхностного возмущения, вызванного ударом хвоста кита — постоянно показывает улучшение обнаружения eDNA китообразных, поскольку недавно сброшенный биологический материал концентрируется у поверхности 24,41,42,47,48. Использование закрытых, самосохраняющихся фильтрующих систем снижает этапы обработки и риски загрязнения, что делает их отлично подходящими для применения в гражданскойнауке 38,42. Кроме того, включение биологических репликаций и рутинных полевых контролей минимизирует сбои обнаружения и повышает надёжностьданных 49,50,51.

Разработка и валидация протокола
ПроектeWHALE 52 — это транснациональная инициатива, объединяющая исследователей, операторов наблюдения за китами и гражданских учёных по всей Европе для мониторинга морской мегафауны с использованием eDNA. Отбор проб был направлен на несколько таксонов китообразных в Северной Атлантике и Средиземном море, используя основной протокол с региональными адаптациями для учёта местных экологических и логистических условий.

Здесь мы представляем стандартизированный, от начала до конца протокол сбора eДНК китообразных с судов для наблюдения за китами, усовершенствованный анализом 308 образцов eDNA морской воды, включая по две реплики на образец и 21 полевой контроль, собранных в ходе координированных полевых кампаний в 2024 году в заливе Скьялфанди (Исландия), Азорских островах (Португалия) и Лигурийском море (Италия). Метод интегрирует сбор морской воды, направленный на флюкпринт, бортовую фильтрацию с использованием самосохраняющихся eDNA-фильтров и молекулярные анализы на последующих этапах.

Этот протокол разработан для внедрения в реальных условиях наблюдения за китами обученными исследователями и гражданскими учёными, где фильтрация на борту может осуществляться в спокойных и умеренных морских условиях без нарушения активности по наблюдению за китами. Его реализация требует координации с участвующими организациями (например, операторами наблюдения за китами, некоммерческими организациями, исследовательскими учреждениями) для определения стратегий отбора проб и целей исследований. Хотя основные параметры должны оставаться фиксированными для обеспечения воспроизводимости и сопоставимости кросс-исследований, на участках с высокой мутностью, движением судна или ограничениями по времени, пространству или персоналу, могут потребоваться корректировки, соответствующие протоколу. К таким адаптациям относятся тип фильтра, достижимый объём фильтрованной воды и вспомогательное оборудование. Они должны применяться последовательно в каждой кампании выборки и прозрачно отражаться. Подробные операционные рекомендации и логистические вопросы приведены в этапах и обсуждении протокола для поддержки качества данных, прозрачности и региональной сопоставимости.

Проектирование анализов qPCR
Для оценки протокольной эффективности была усилена электронная ДНК горбатых китов (Megaptera novaeangliae), хорошо изученного мигрирующего вида, регулярно встречающегося в заливе Скьялфанди (Исландия)53 и сезонно присутствующего наАзорских островах 54, на основе образцов, собранных в полевых условиях. Рабочие процессы лиза, экстракции и qPCR ДНК изначально оптимизировались с помощью межлабораторного кольцевого теста с участием четырёх лабораторий проекта eWHALE, что повысило согласованность и применимость во всехучреждениях 14.

Для надёжного обнаружения eDNA горбатого кита был разработан и проверен видоспецифический MGB (незначительный связующий канавки) qPCR-анализ, направленный на митохондриальную область ND5, согласно установленнымрекомендациям 55 (Таблица 1). Праймеры олигонуклеотида и зонд были созданы с помощью программного обеспечения для выравнивания и анализа последовательностейДНК 56 с целью максимизации специфичности вида и эффективности амплификации (Дополнительный файл 1 — Дополнительный рисунок S1). Специфичность анализа оценивалась in vitro с использованием целевых и нецелевых таксонов (Balaenoptera acutorostrata, Delphinus delphis, Physeter macrocephalus, Homo sapiens). Концентрации ДНК, используемые для формирования стандартных кривых qPCR, были количественно измерены по тканевому стандартуДНК 42,57,58,59,60. Предел обнаружения (LOD) анализа, определяемый как самая низкая концентрация, дающая положительные амплификации в 95% реплицированных образцов, был определен11,61. Обнаружение eDNA горбатого кита оценивалось на полевых образцах путём оценки доли положительных реакций и силы сигнала (то есть порог цикла, значение CT) для каждого образца, репликационного на тройных qPCR-измерениях, чтобы учесть вариабельность амплификации и повысить надёжностьобнаружения 57,60,62. Обнаружение видов затем верифицировалось с помощью двунаправленного секвенирования Сэнгера, после чего подтверждалось анализом BLAST63.

данные qPCR представлены как среднее ± стандартное отклонение (SD). Статистическая значимость между группами оценивалась с помощью непараметрического теста Манна-Уитни U и двухвыборного t-теста Уэлча. Различия считались значительными при p < 0,05. Все анализы проводились с помощью программного обеспечениястатистического анализа 64.

Протокол

Этика и соблюдение нормативных требований
Все наблюдения китообразными и последующий отбор проб воды должны проводиться в соответствии с национальными и региональными правилами по дикой природе. Отбор проб осуществляется исключительно с авторизованных судов, действующих по действующим разрешениям на наблюдение за китами или исследования. Соблюдайте минимальные расстояния подхода к целевому виду, определённые местными правилами, и избегайте любых маневров, предназначенных исключительно для отбора проб. Образцы китовых тканей, использованные для валидации анализов, были собраны по соответствующим региональным разрешениям и распределены между партнёрами проекта eWHALE в соответствии с национальными и институциональными нормативами.

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом отбора проб изучите следующие документы и соберите необходимое оборудование: таблица материалов, набор для отбора проб eDNA (дополнительный файл 1 — дополнительный рисунок S2), материалы, используемые для сбора образцов окружающей среды (рисунок 1), а также обзор этапов отбора проб и процесса фильтрации на борту (рисунок 2).

1. Подготовка выборки eDNA

  1. Подготовить материалы полевой документации, включая полевые технические листы и ламинированный полевой протокол (Дополнительный файл 2 и Дополнительный файл 3).
  2. Подготовьте запасные перчатки, запасные фильтры (один фильтр на каждую образцу), водонепроницаемый маркер и специальный контейнер для отходов (рисунок 1A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте закрытые самосохраняющиеся eDNA-фильтры (размер пор 1,2 мкм) для минимизации рисков обращения изагрязнения 65,66.
  3. Подготовьте одно или несколько жёстких ковш, подходящих для типа судна и бортовой конфигурации (Дополнительный файл 1 — Дополнительная рисунок S3).
    1. Отмечайте ведра на 10 л перманентным маркером. Если работать с 10 литрами неудобно, готовьте несколько меньших ковш.
    2. Крепко прикрепляйте верёвку к ковшу, если доступ за борт ограничен.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте закрытые ведра для минимизации пролива при чрезмерном движении сосудов (рисунок 1B).
    3. Подготовьте вторичный контейнер eDNA для объединения меньших объёмов и дополнительную транспортную коробку для обеспечения безопасной транспортировки ведер, если это необходимо (рисунок 1C).
  4. Подготовьте портативный перистальтический или вакуумный водяной насос (рисунок 1D). Полностью зарядите насос перед посадкой и отключите питание непосредственно перед использованием.
  5. Назначьте роли по отбору проб, фильтрации и записи данных перед вылетом.
    ВНИМАНИЕ: Надевайте перчатки во время обращения с оборудованием и меняйте перчатки между заданиями.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Полевые материалы для сбора образцов ДНК из окружающей среды. (A) Набор инструментов с самосохраняющимися фильтрами eDNA, контейнер для отходов, бутылка с разбавленным бытовым отбеливателем (1:10), перчатки, полевой технический лист и водонепроницаемая ручка; (B) примеры типов ведра для отбора проб eDNA; (C) примеры дополнительного контейнера eDNA для транспортировки и фильтрации больших объёмов и контейнеров для перевозки ведер на борту; (D) примеры портативных насосов для фильтрации воды. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-protocol-2
Рисунок 2: Концептуальная схема отбора образцов ДНК окружающей среды на борту судов для наблюдения за китами. На иллюстрации описываются направляемые шаги, включая сбор образцов воды и бортовую фильтрацию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

2. Чистка оборудования

  1. Перед уборкой наденьте одноразовые перчатки.
  2. Приготовьте раствор отбеливателя, разбавляя бытовой отбеливатель (5-6% гипохлорита натрия) в 1:10 очищенной водой (~50 мл за раз на поездку).
  3. Нанесите раствор, равномерно разбрызгав все поверхности на ведра, крышки, контейнеры и трубки насоса. Минимальное время контакта с отбеливателем на всех поверхностях составляет 2-5 минут.
  4. Тщательно промывайте водопроводной водой три раза (рисунок 3).
  5. Сушите материалы на воздухе в надёжном месте и храните их в безопасном и чистом пространстве перед посадкой.

figure-protocol-3
Рисунок 3: Шаги для чистящего оборудования. (A) Применить разбавленный раствор бытового отбеливателя (1:10); (B) равномерно распределяться с помощью перчаток без ДНК; (C) тщательно промыть три раза водопроводной водой; и (D) повторять процесс для получения дополнительных материалов, если это применимо (например, контейнеров eDNA). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

3. Сбор проб воды

ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте все нормы безопасности на борту каждого судна или платформы, включая использование спасательных жилетов или плавучих комбинезонов при необходимости.

  1. Возьмите все материалы на борт до прибытия пассажиров и храните их в специально отведённом, чистом месте.
  2. Координировать время отбора проб и позиционирование судна с экипажем судна.
  3. Наблюдайте за паттернами всплывания, чтобы предвидеть погружения китов (рисунок 4). Наденьте новые перчатки перед пробой.
  4. Собрать 20 л морской воды как можно скорее (не более 10 минут таймлапса) с флюкпринта после погружения кита, чтобы получить два повторения образца по 10 л.
  5. Транспортируйте собранную воду на специально оборудованную фильтрационную станцию на борту, используя крышки или дополнительный стерилизованный контейнер, чтобы избежать разлива (при необходимости).
  6. Запишите идентификацию вида, GPS-координаты, время и идентификацию реплицирования образца в техническом листе.
  7. Меняйте перчатки сразу после прибытия.

figure-protocol-4
Рисунок 4: Последовательность всплывания горбатого кита. (A) Вздох кита; (B) выгибание спины и поднятие хвоста перед погружением; (C) узор флюкприна на поверхности после погружения кита. Авторство изображения: Ocean Missions (A,B,C, 2024). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

4. Фильтрация eDNA

  1. Откройте фильтрующий мешок и держите фильтр только у выхода (Дополнительный файл 1 — Дополнительный рисунок S4).
  2. Вставьте впуск в трубку и подключите трубку насоса к выходу (рисунок 5A,B).
  3. Погрузите шноркель в образец воды, не погружая корпус фильтра (рисунок 5C).
  4. Установите насос (см. таблицу материалов для типов насосов) на быстрый и стабильный расход.
  5. Фильтруйте 10 л непрерывно, контролируя стабильность потока (проверьте на наличие пузырьков, разрывов, разрывов или сбоев герметизации).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Прекратите фильтрацию на максимальной длительности 45 минут.
  6. Переверните фильтр и запустите насос 30-60 секунд, чтобы удалить остатки воды. Убедитесь, что в корпусе фильтра не осталось видимой влаги.
  7. Выключите насос и отсоедините трубку.
  8. Выбросьте трубку в контейнер для отходов, положите фильтр в исходный пакет и сразу же промаркируйте.
  9. Храните фильтры на борту в закрытом жёстком контейнере или в охлаждающей коробке (если температура окружающей среды > 20 °C), вдали от прямых солнечных лучей и пассажирских зон.
  10. Меняйте перчатки и повторяйте фильтрацию для второй реплики.

figure-protocol-5
Рисунок 5: Шаги настройки бортовой фильтрации. (A) прикрепить вход фильтра (белую часть) к трубке (трубке); (B) соединить трубку насоса с выходом фильтра (жёлтая часть); и (C) погружает часть трубки в водный образец. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

5. Полевые отрицательные контроли и отчетность данных

  1. Фильтруйте одно поле отрицательного контроля после каждых пяти образцов флюкпринта.
  2. Используйте целевой воду без ДНК сразу после возвращения на берег и до чистки оборудования.
  3. После каждой поездки перенесите все данные в цифровую таблицу выборки eDNA (Дополнительный файл 4).

6. Фильтровое хранение и отправка

  1. Храните самосохраняющиеся eDNA-фильтры в безопасном, сухом контейнере в затенённой комнате с температурой окружающей среды — или в холодильнике, если температура окружающей среды превышает 20 °C — не более 3 месяцев до отправки.
  2. Перед отправкой визуально осмотрите фильтрующие пакеты на наличие влаги.
  3. Маркировать и отправлять фильтры в изолированных контейнерах с ледяными пакетами в назначенную лабораторию.

7. Лабораторный анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все лабораторные процедуры в специализированных помещениях, стерилизированных ультрафиолетом, с достаточной вентиляцией и отдельными верстаками для ПЦР, используя перчатки без ДНК и защитнуюодежду 55,67,68.

  1. Лизис ДНК
    1. Маркируйте реакционную трубку объёмом 2 мл на каждый фильтр.
    2. Поместите фильтр в колбу Erlenmeyer на 200 мл и сбросьте резиновую крышку (рисунок 6A).
    3. С помощью щипцов без ДНК сложите мембрану (Дополнительный файл 1 — Дополнительный рисунок S5) в треугольник и перенесите её в реакционную трубку объемом 2 мл, при этом кончик будет направлен вниз (рисунок 6B-D).
    4. Добавьте 380 мкл буфера TES и 20 мкл протеиназы K (см. таблицу материалов) в каждую реакционную трубку, получив 400 мкл буфера лизиса (рисунок 6E).
    5. Вихрь кратковременно инкубируется при 56 °C в течение ≥3 часа с перемешиванием (рисунок 6F).
    6. Центрифугные трубки при 18 626 × г в течение 10 минут при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Прозрачный или светлый лизат указывает на успешное пищеварение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть временно остановлен на этом этапе, если лизаты хранятся при -20 °C.
  2. Экстракция ДНК
    1. Инкубировать лизаты при 56 °C в течение 10 минут перед извлечением.
    2. Реагенты для экстракции пипетт в промывальных и элюсионных пластинах, учитывая отрицательные контроли и ошибкипипетирования 69 (см. Дополнительный файл 1 — Дополнительная таблица S1).
    3. Включайте по одной заготовке для экстракции на каждую пластину с использованием буфера TES.
    4. Переведите по 300 мкл лизата в каждую яме в пластине связывания. Добавьте в каждую скважину 300 мкл буфера AL и 300 мкл изопропилового спирта. Используйте несколько пластин связывания, если общий объём лизата превышает 300 мкл вихря, и добавляйте 30 мкл магнитных частиц для связывания нуклеиновой кислоты на каждую яме с первой пластиной связывания (таблица материалов).
    5. Накройте Bind Plate крышкой Rod.
    6. Запустите предварительную программу поглощения ДНК для двух связывающих пластин (всего 400 мкл лизата; см. таблицу материалов и рисунок 7) и автоматизированный протокол экстракции на лабораторном роботе на основе магнитных бусин.
    7. Утилизировать химикаты для экстракции в специальные контейнеры для отходов.
    8. Переносите элюированную ДНК в маркированные реактивные трубки объёмом 1,5 мл и храните при −20 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе протокол может быть временно остановлен. На этом этапе могут быть проведены этапы удаления ингибиторов аддиционирования.
  3. qPCR
    1. Подготовьте и количественно определите стандарты ДНК целевых видов с использованием экстрактов тканей и флуоресцентного высокочувствительного анализа dsDNA согласно инструкции производителя (Таблица материалов). Генерируйте восьмиточечную стандартную кривую последовательно разбавлением (1:10), начиная с 10 нг/мкл11,55. Стандарты aliquot до qPCR для минимизации циклов замерзания и оттаивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе протокол может быть временно остановлен.
    2. Подготовьте все qPCR-реакции в трёх экземплярах с использованием пластин с 96 ямецами.
    3. Включайте одну контрольную систему без шаблона (молекулярную воду) и одну экстракционную заготовку на каждую qPCR-пластину.
    4. Подготовьте мастер-микс согласно Дополнительному файлу 1 — Таблице S2 и рисунку 8A.
    5. В капюшоне для загрузки ДНК добавьте ранее подготовленные стандарты ДНК и 3 мкл экстракта ДНК в каждую яму, содержащую мастер-смесь (рисунок 8B).
    6. Запечатайте пластину герметизирующей пленкой (рисунок 8C).
    7. Центрифугу при 3 500 × г в течение 10 секунд и загрузите её в количественный термоцикл ПЦР в реальном времени (рисунок 8D, E).
    8. Проведите анализ в оптимальных условиях циклирования, указанных в Таблице 2, и зафиксируйте данные с помощью программного обеспечения производителя (Таблица материалов)11.

figure-protocol-6
Рисунок 6: Рабочий процесс лизиза ДНК. (A) Снимите резиновую крышку из самосохраняющегося eDNA-фильтра и поместите её в колбу Эрленмайера; (B) стерилизовать две пары щипцов трижды пламенем; (C) сгибать фильтрующую мембрану; (D) вставить его в трубку объёмом 2 мл; (E) добавить буфер лизиса и протеиназу K, а (F) инкубировать образцы при 56 °C в течение 3 часов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой рисунка.

figure-protocol-7
Рисунок 7: Материалы и оборудование, используемые для извлечения ДНК. (A) Связывать, промывать и элюировать пластины, расходные материалы и реагенты для подготовки к экстракции; и (B) лабораторный робот на основе магнитных шариков, используемый для обработки образцов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-protocol-8
Рисунок 8: Рабочий процесс для qPCR. (A) Подготовка мастер-смеси в ранее стерилизованной УФ-изоляцией комнате (под рабочей вытяжкой, предназначенной для приготовления мастер-смесей); (B) загрузить стандарты ДНК, экстракции и контроль в станции загрузки ДНК по указанному шаблону; (C) герметичная пластина; (D) центрифуга; (E) загрузить в реальное время количественный ПЦР-термоциклер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Результаты

В 2024 году с использованием этого оптимизированного протокола было собрано всего 154 образца флюкпринта (308 eDNA-фильтров), включая 96 фильтров в заливе Скальфанди (Исландия; 9 полевых контрольных и 76 репликий горбатого кита), полученных с марта по ноябрь, 151 фильтр на Азорских островах (Португалия; 12 полевых контрольных и 15 репликий горбатого кита), полученных в июле, и 61 фильтр в Лигурийском море (Италия; 4 полевых контрольных теста), полученных с мая по октябрь. Все образцы включали сбор до 10 л морской воды (по две реплики на образец флюкпринта) с использованием самосохраняющихся eDNA-фильтров (Таблица 3). Во время полевых работ были собраны два типа отрицательных контролей: очищенная вода, отфильтрованная после очистки оборудования отбеливателем, и морская вода, собранная при повторном входе в гавань(ы)42. Последний был намеренно отфильтрован перед очисткой отбеливателем для оценки возможного перекрёстного загрязнения eДНК китообразных во время отбора проб. Образцы отправлялись с каждого участка отбора проб двумя партиями в Исследовательское подразделение прикладной экологии животных, кафедра зоологии Университета Инсбрука (Австрия) для лабораторной обработки.

Результаты анализа и управления
Было проанализировано подмножество из 44 фильтров (30 реплик, включая 2 полевых контроля из залива Скьялфанди, Исландия, и 14 фильтров, включая 1 контрольный фильтр из вод вокруг островов Фаял и Пику, Азорские острова, Португалия) на предмет eDNA горбатого кита (рисунок 9). Сигнал измерялся в трёхкратных qPCR-реакциях. Образец (то есть eDNA-фильтр) считался положительным, если одна из трёх реплицированных qPCR была амплирована. Предел обнаружения (LOD) в этом исследовании был рассчитан как 0,0001 нг/мкл (средний ct LOD = 35,8). Из 41 проанализированного фильтра 20 (49%) дали амплификации, тогда как 24 (58%) не показали амплификации. Отсутствие обнаружения (без значения КТ) скорее всего отражают либо отсутствие, либо крайне низкую концентрацию целевой ДНК. Невыявленные фильтры составили 5 из 13 фильтров с Азорских островов (38%) и 19 из 28 фильтров из Исландии (68%). Экстракционные заготовки были проверены на наличие ДНК морских позвоночных с помощью анализаMarVer3 70 и не показали обнаруживаемой амплификации, что указывало на отсутствие перекрёстного загрязнения во время экстракции ДНК. Полевые контроли (NC) и qPCR (NT) не дали усилений, что подтверждает отсутствие загрязнения во время полевых работ и qPCR-скрининга (Таблица 4).

Из 20 положительных фильтров девять (22%) дали как минимум одно значение Ct ниже предела обнаружения анализа (LOD; 0,0001 нг/мкл) и поэтому были классифицированы как надёжные обнаружения. Среди них — 4 из 8 фильтров с Азорских островов (50%) и 5 из 12 из Исландии (42%). Дополнительные 11 фильтров (27%) дали одно или несколько CT значений выше LOD, включая 4 фильтра с Азорских островов (50%) и 7 из Исландии (58%), что указывает на правдоподобные обнаружения (рисунок 10). Сравнительный анализ выявил немного более низкое среднее значение порога цикла (Ct) для фильтров Азорских островов (34,7 ± 3,60; n = 8) по сравнению с исландскими фильтрами (36,9 ± 3,60; n = 10). Тест Mann-Whitney U показал, что эта разница не является статистически значимой (U = 199,0, p = 0,204). Учитывая обратную зависимость между значением Ct и силой ДНК-сигнала, результаты указывают на немного более высокие концентрации eDNA целевых горбатых китов в фильтрах Азорских островов (рисунок 11).

Ограничения на осуществимость
Количество образцов флюкпринта за одну поездку варьировалось в зависимости от длительности поездки и погодных условий. За 3-часовые туры на Азорских островах было собрано примерно от двух-трёх образцов (до шести фильтров eDNA), в Италии — от двух до четырёх образцов в течение ~8 часов (до восьми фильтров), а также от одного до двух образцов (до 4 фильтров) во время 3,2-часовых туров в Исландии. Фильтрационные показатели были в целом высокими на Азорских островах и в Италии. На Азорских островах 10 л морской воды стабильно фильтровались в течение 10–15 минут, тогда как в Италии тот же объём фильтровался примерно за 10 минут. В Исландии объёмы фильтров варьировались от 4,5 до 10 л (среднее = 8,5 л), со средним временем фильтрации ~40 мин из-за частых засоров фильтра, вероятно, вызванного наличием частиц в воде в исследуемом районе. В частности, 10 л были успешно отфильтрованы для 46 из 98 фильтров (47%), объемы от 7 до 10 л были получены для 31 фильтра (32%), а объёмы от 4 до 7 л — для 21 фильтра (21%) (Дополнительный файл 1 — Дополнительная таблица S3).

Протокол рекомендует фильтрацию одного контрольного теста с отрицательным результатом после каждых пяти образцов флюкпринта. Однако в условиях оперативного наблюдения за китами это не могло быть полностью реализовано в описанном кейсе из-за логистических ограничений, включая ограниченную доступность фильтров, временные ограничения и задержки с доставкой. Это снизило допустимое соотношение контроля к выборке до 1:10,7 в Исландии (9/96), 1:12,6 на Азорских островах (12/151) и 1:15,3 в Италии (4/61). Несмотря на эти отклонения, ни одна полевые или лабораторные отрицательные контрольные тесты не показала амплификации.

figure-results-1
Рисунок 9: Обзор местоположения образцов. Чёрные точки на карте обозначают места, где были взяты образцы с отпечатка горбатого кита в заливе Скьялфанди (Исландия) и на Азорских островах. Название eDNA-фильтра указано рядом с соответствующим регионом отбора проб. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 10: Обнаружения из подмножества eDNA-фильтров с Азорских островов и Исландии. qPCR — средние значения КТ и сила ДНК-сигнала для положительных выявлений на Азорских островах и Исландии (по крайней мере одно положительное ПЦР-реплицирование), с SD и LOD. Полосы окрашены по силе сигнала относительно LOD: тёмно-синий = сильный сигнал (Ct ≤ 35.8) — надёжные обнаружения, светло-голубой = слабый сигнал (Ct > 35.8) — это правдоподобные обнаружения. Индикаторы ошибок SD обозначают вариабельность между репликами ПЦР. Красная пунктирная линия указывает на LOD (Ct = 35.8). Средние значения Ct отображаются над каждой полосой. Сокращения: Ct = порог цикла; SD = стандартное отклонение; LOD = предел обнаружения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 11: Средние значения порога цикла для обнаружения ДНК горбатого кита с Азорских островов и Исландии. Чёрные линии внутри квадратных графиков указывают медиану, красные квадраты — средние значения Ct (SD), а усы — минимальные и максимальные значения для Азорских островов и Исландии. Тест Mann-Whitney U показал, что эта разница не является статистически значимой (U = 199,0, p = 0,204). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 1: Праймерные и зондовые последовательности для qPCR-анализа, направленного на ND5. К таким последовательностям относятся прямые и обратные праймеры, MGB-зондовые последовательности (5′-3′), оптимальная температура отжига и предел обнаружения анализов (LOD). (*) LOD определяется как самая низкая концентрация ДНК (ng/μL) в ДНК целевого вида, при которой ≥95% репликаций ПЦР приводят к положительной амплификации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Оптимизированные условия циклирования для eDNA qPCR-анализа горбатого кита .Эти оптимизированные настройки qPCR включают 95°C в течение 10 минут (активация ферментов), затем 40 циклов при 95°C в течение 15 секунд (денатурация) и 60°C в течение 90 секунд (отжиг/расширение). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 3: Обзор конфигурации выборки в поле. Обзор регионов отбора проб, полевых партнёров, типов сосудов, целевых видов, периодов отбора проб и реплик образцов на Азорских островах, в Исландии и Италии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 4: сводка по обнаружению qPCR для образцов окружающей среды и контролей. Положительные выявления (выделены жёлтым), qPCR воспроизводят значения КТ, а также результаты обнаружения; образцы классифицировались как положительные, если хотя бы одна из реплик qPCR показала амплификацию. «Нет Ct» означает отсутствие усиления, отрицательные контроли не показывали усиления, а стандартная серия разбавления M. novaeangliae , используемая для определения эффективности анализа, и LOD включён внизу таблицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительный файл 1: содержит дополнительные рисунки и таблицы, содержащие дополнительную информацию о применении протокола, включая набор для отбора проб eDNA для дизайна праймера, типы сосудов для наблюдения за китами, характеристики самосохраняющегося фильтра eDNA, объёмы реагентов для экстракции ДНК и qPCR-реакций, а также вариации скоростей фильтрации по регионам отбора проб. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 2: Полевой технический лист, использованный при отборе пробы eDNA китообразных. Стандартизированная форма для записи метаданных круизов, наблюдений китообразных, а также информации о выборках и фильтрах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 3: Пошаговый полевой протокол для отбора образцов eDNA китообразных на борту судов для наблюдения за китами, включая чистку оборудования, сбор морской воды и бортовую фильтрацию, отчётность и хранение образцов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 4: шаблон таблицы для отбора eDNA китообразных. Стандартизированная форма для записи информации о выборке после сбора образцов и бортовой фильтрации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Операционная осуществимость и реализация в полевых условиях
Представленный здесь протокол способствует стандартизированному рабочему процессу eDNA, который балансирует чувствительность к обнаружению с реальными ограничениями. Интегрируя крупнообъёмное отбор проб с использованием флюкпринта, бортовую фильтрацию с использованием самоконсервирующихся закрытых фильтров и стандартизированные меры по контролю загрязнения, протокол обеспечивает воспроизводимую структуру, которую можно применять в разных регионах и в рамках кампаний отбора проб. Этот подход соответствует растущему признанию eDNA как экономичного и масштабируемого дополнения к традиционным методам морскогомониторинга 9,10,22.

Предыдущие исследования eDNA китообразных в основном опирались на транзектный отбор проб морской воды с крупных исследовательских судов или на основе мелких объёмов рядом с наблюдениями китообразных. Подходы, основанные на трансектах, обеспечивают широкое пространственное покрытие, но часто захватывают разбавленные и временно отделённые ДНК-сигналы, ограничивая обнаружение редких или временныхвидов 71, даже если отбор проб происходит близко к поверхности, и обычно требует специализированных сосудов иинфраструктуры 25,37,72. В то же время малообъёмный отбор проб рядом с выходящими на поверхность китов улучшает специфичность встречи, но остаётся подвержен ложноотрицательным результатам из-за ограниченного объёма воды и непоследовательных методовфильтрации 72,73. Явно нацеливаясь на флюкпринты и фильтруя большие объемы на борту, представленный здесь рабочий процесс увеличивает вероятность захвата eDNA китообразных с низкой концентрацией, оставаясь при этом возможной при временных и пространственных ограничениях, типичных для операций наблюдения за китами. Использование закрытых, самосохраняющихся фильтров дополнительно минимизирует риски обработки и загрязнения, устраняя необходимость в буферах для сохранения в полевых условиях и упрощая логистику в условиях ограниченногоборта 42,66.

Для обеспечения сопоставимости перекрёстного исследования следующие параметры должны оставаться неизменными в ходе кампании отбора проб: сбор морской воды непосредственно из видимых отпечатков китообразных; две биологические реплики по 10 литров на каждый флюкпринт; использование самосохраняющихся eDNA-фильтров имметитирует бортовую фильтрацию при стандартизированных мерах контроля загрязнения, включая регулярные полевые отрицательные контроли с установленной минимальной частотой; а также видоспецифический qPCR-скрининг, проводимый в тройных экземплярах с соответствующими контролями. Другие параметры могут варьироваться без ущерба методологической основе, при условии их последовательного и прозрачного отчёта, включая оборудование для сбора воды и обработку, размер пор фильтра, тип насоса и конфигурацию трубок, продолжительность фильтрации и достижимый объем фильтрации при засоре, логистику образцов на борту и условия краткосрочного хранения перед отправкой. Поскольку многие этапы обработки в исследованиях eDNA остаются переменными, настоятельно рекомендуется тщательно отчёт всех этапов отбора проб и аналитики.

Реализуемость этого протокола наивысшая при спокойных и умеренных морских состояниях (≤ Beaufort 3), при низкой или умеренной мутности, когда время и пространство на борту позволяют обрабатывать два eDNA-фильтра на флюкпринт, а фильтрованный объём воды составляет 10 л на фильтр. На практике обученные учёные могут брать образцы до Beaufort 3, но гражданские учёные должны работать только в спокойных условиях (Beaufort 1-2) из-за движения судов и турбулентности, несмотря на то, что экскурсии по наблюдению за китами иногда проводятся на Beaufort 3. Фильтрация должна начаться как можно скорее после сбора воды, чтобы минимизировать деградациюДНК 47,74. Стратегии отбора проб, минимизирующие разбавление поверхностной eDNA, вызванное винтом, такие как отбор проб с подветренной и нижней стороны судна, дополнительно поддерживают точность прицеливания и надёжныеобнаружения 47. Избегание обратного маневрирования и предотвращение контакта верёвок (прикреплённых к ведрам) с образцами морской воды дополнительно снижает риск загрязнения, что соответствует лучшим практикам воднойeDNA 38. В зависимости от конфигурации судна и логистики (например, высоты емкости, движения и доступного места на борту) поддерживаются две стратегии отбора проб, если применяются последовательно: (i) независимый сбор и фильтрация двух 10-литровых репликий с использованием двух отдельных ведер, или (ii) сбор одного образца воды объёмом 20 л, перемещённого в герметичный стерильный контейнер для безопасной транспортировки на борту и затем разделённого на две 10-литровые реплики для фильтрации. Объём фильтрации 10 л на фильтр представляет собой практический компромисс между вероятностью обнаружения и усилиями фильтрации в условиях наблюдения за китом.

Большие объёмы увеличивают вероятность захвата редкой или низкоконцентрационной eDNA и снижают ложноотрицательные результаты, характерные для исследованийкитообразных 39,40,75, при этом остаются оперативно осуществимыми в сочетании с самосохраняющимися фильтрами и большими порами 42. Повышенные частицы, движение судна, ограниченное пространство на палубе или временные ограничения могут снижать эффективность фильтрации и достижимые объёмы, тем самым ограничивая применимость протокола. В таких случаях могут потребоваться адаптации, соответствующие протоколу, такие как уменьшение объёма воды или альтернативные размеры пор фильтра, которые должны применяться последовательно в кампаниях отбора проб для поддержания сопоставимости данных. Длительность поездки, время встреч с китами и фильтрационная способность определяют допустимое количество образцов. На стандартных трёхчасовых экскурсиях по наблюдению за китами обычно можно выполнить от одного до двух образцов флюкпринта (иногда три) без нарушения работы и гражданской науки. Во время длительных экспедиций ёмкость по отбору проб увеличивается в зависимости от ежедневных усилий по наблюдению за китами (например, ~8 ч/день в нашем итальянском исследовании). На практике отбор eDNA может быть реализован во всех трёх местах во время пиковой туристической активности.

Успех амплификации eDNA и контроль загрязнения
Образцы окружающей среды, особенно собранные в богатых питательными веществами водах, могут содержать ингибиторы ПЦР, способные подавлять амплификацию и генерироватьложноотрицательные результаты 76. Хотя в предыдущих анализах исландских образцов в рамках того же проекта42 ингибирования не было обнаружено, включение этапа удаления ингибиторов обеспечило стабильный успех амплификации (см. таблицу материалов) и соответствует рекомендациям лучших практик для водных рабочих процессов eDNA14,55.

Стабильная эффективность обнаружения qPCR в разных регионах свидетельствует о том, что протокол надёжно фиксирует eДНК китообразных в различных условиях окружающей среды. Незначительные вариации КТ, вероятно, отражают региональные различия в температуре, мутности и продуктивности, что влияет на высвобождение, деградацию и дисперсиюeDNA 75,76. Предел обнаружения теста (0,0001 нг/мкл) входит в диапазон чувствительности, сообщенный для других валидированных анализов китообразных, разработанных в рамках проектаeWHALE 14,11,42. Показатели обнаружения соответствовали ранее опубликованным исследованиям на основе флюкпринта, что подчёркивало влияние поведения и частоты появления видов на успехобнаружения 41,42,47. Для количественной оценки qPCR использовались стандарты ДНК, полученные из тканей, что отражает распространённую практику в исследованиях морскойeDNA 57,72,77,78,79. Хотя этот подход может вводить дисперсию в абсолютнойколичественной оценке 11,61,80,81,82,83, особенно для низкоконцентрационных и гетерогенных образцов окружающей среды 84,85, он отражает реальную сложностьвыборки 55,86. Использование синтетических стандартов может повысить количественную воспроизводимость и сопоставимость между исследованиями и рекомендуется для будущихприменений 11,87.

Возможные источники загрязнения включают перекрёстный перенос образцов, а также введение человеческой или нецелевой ДНК окружающей среды во время этапов обработки, что может привести к ложноположительнымвыявлениям 88. Строгий контроль загрязнения необходим на всех этапах полевых и лабораторных обработок, особенно в условиях, типичных для гражданской науки. Рутинная смена перчаток, использование оборудования без ДНК, закрытых систем фильтрации, стандартизированное обучение, рутинное включение полевых и лабораторных контролей, документирование возможных событий загрязнения и валидация анализов по установленным рамкам критически важны для обеспечения надёжности данных и обнаружениявидов 11,31,49,51,55,89 . Хотя использование пластика является неизбежным ограничением для полевого молекулярного отбора, потребление было минимизировано, где это было возможно, и использовались частично биоразлагаемые фильтрационныематериалы 66.

Ограничения, масштабируемость и будущие последствия
Засор фильтров остаётся ключевым фактором в мутных или продуктивных средах, таких как залив Скьяльфанди (Исландия), где взвешенные органические вещества и плотность планктона, вероятно, снижали эффективностьфильтрации 43,90. Фиксация длительности фильтрации, признаков засоров фильтра, таких как снижение потока, видимые пузырьки воздуха в фильтре или деформация насоса, а также ограничение времени фильтрации примерно 45 минутами на повторение, способствуют дальнейшей интерпретации и сравнениям. Использование стерилизованного плавающего устройства для подвешивания фильтра или фильтрующих мешков с подачей силы тяжести может сократить время обработки при фильтрации, хотя последнее может быть несовместимо с самосохраняющимися eDNA-фильтрами и большими объёмами (≥1 L)91. Фильтры большого порового размера (≥ 5 мкм) могут дополнительно повысить скорость фильтрации, однако эффективность обнаружения, специфическая для таксона, следует оценивать при пилотном отборе eDNAкитообразных 45,92.

Ключевые аспекты перед полномасштабным отбором проб включают: приоритет фильтрации на борту вместо задержки обработки, поддержание единообразных объёмов воды и конфигурации фильтра, проведение пилотного отбора проб для оптимизации фильтрации в местных условиях и согласование усилий по отбору проб с вместимостью сосудов и продолжительностью рейса. Для будущих применений рекомендуется цифровые инструменты ввода данных, позволяющие гражданским учёным проводить структурированную записьна местах 93.

Успешное применение этого комплексного рабочего процесса демонстрирует надёжность в условиях эксплуатационных ограничений, одновременно подчёркивая ограничения, связанные с пространством, временем, погодой и рисками загрязнения, присущими контекстам гражданскойнауки 10,94. Несмотря на эти ограничения, суда для наблюдения за китами представляют собой мощную и малоиспользуемую платформу для мониторинга eDNA китообразных, когда предоставляются стандартизированные тренировки инадзор 31, 32, 42, 95. Интеграция этого рабочего процесса с проверенными инструментами мониторинга китообразных, такими как фотоидентификация, пассивная акустика и биопсия, может связать генетические обнаружения с поведенческими и демографическими данными. Хотя данное исследование сосредоточено на выявлении на основе qPCR, в будущем применение может интегрировать меташтрих-кодирование ДНК или популяционный генетический анализ, что ещё больше расширяет экологическую и природоохранную ценность мониторинга eДНК китообразных.

По мере процветания подходов на основе eDNA этот рабочий процесс обеспечивает масштабируемую основу для интеграции генетического мониторинга в существующие морские программы наблюдения и охраны, особенно в горячих точках китообразных и чувствительных экосистемах.

Раскрытие информации

Белен Гарсия Овиде — основатель и исполнительный директор Ocean Missions, некоммерческой организации, занимающейся сохранением океана, базирующейся в Хусавике на северо-востоке Исландии. Ocean Missions координирует отбор проб с судов для наблюдения за китами в Исландии, а также с арктических экспедиционных судов. Она также является представителем компании North Sailing, занимающейся наблюдением за китами в Хусавике, в рамках проекта eWHALE. Эти аффилиации не повлияли на дизайн исследования, сбор данных, анализ или интерпретацию результатов.

Благодарности

Мы хотели бы выразить признательность всем, кто участвовал в полевых и лабораторных работах, а именно:

i) Айдан Мабей, Маттео Тосато, Анук Адольф, Жанна Лапорт, Роми Неро и Изабель Эстерле, которые участвовали в образцах, собранных в заливе Скьялфанди, Исландия; ii) Дания Тезеи, Майкл Коста, Рита Норберто, Марлен Швандт, Рита Лейтан, Рикардо Вентура, Мартейн Схаутен, Джада Висконтини, Катарина Либ, Энтони Ле Флох, Франсиско Нунес, Ренато Кардозо, Фаустин Дариус, Моник Схаутен, Лаура Бьет на Азорских островах (Португалия); iii) Сандра Шаллхарт, Яна Робертсон в Австрии; и iv) Сабина Айролди, Марио Габуальди, Марина Коста, Моргана Виги, Нино Пьерантонио, Роберто Райнери для сбора данных в заповеднике Пелагос (Италия).

Это исследование было профинансировано Biodiversa+, Европейским партнёрством по биоразнообразию в рамках совместного сбора исследовательских предложений BiodivProtect на 2021-2022 годы, совместно финансируемого Европейской комиссией (GA No 101052342) и совместно с финансирующими организациями: 1) Исландским центром исследований (RANNÍS), (грант No 229030), 2) Министерством университетов и исследований (MUR), из специального счета FIRST и IGRUE, связанного с европейским партнёрством Biodiversa+ Call 2021 - проект eWHALE, 3) Австрийского научного фонда (FWF) [doi: 10.55776/I6389] и издательского фонда Инсбрукского университета.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Альтернативные eDNA-фильтры: SterivexTM / WaterraMerck Millipore/Waterra Pumps LimitedSVHVL10RC/NA0,45 и микро; m размера пор. Требуются буферы сохранения eDNA 
Буферы AW1, AW2, AEQiagen   19081, 19072, 19077Буферные растворы, используемые для очистки ДНК во время экстракции
Раствор отбеливателя (1:10)DM — Denk mit, HygienereinigerПерсонализацияДезактивация поверхности. Все этапы лабораторных процессов
ВедраМагазины для катания на лодках, рыболовные снасти, AmazonЖёстко. Резина или твёрдый пластик (& 10 л). Один или несколько вариантов, в зависимости от настройки отбора проб и логистики на борту
Очищающий реагент, Express PCR ExoSAP-IT75001.1.EAПодготовка ПЦР-продуктов для секвенирования Сэнгера
Охлаждающая коробкаЖильёИзолированный жёсткий контейнер или охлаждающий мешок
Одноразовые перчатки, большие (L) и средние (M) размеры,
без порошка		Кимберли-Кларк43431, 55090Одноразовые нитриловые или латексные перчатки, коробка на 100 единиц. Необходимое объём: 1 коробка за 10–15 поездок
Стандарты ДНК (3 и mu; L) NAПерсонализацияСерийное разбавление ДНК-ткани (8 точек, 10 нг/и микро; L) от горбатого кита. Калибровка в qPCR
ДНК-безопасная лабораторная одеждаФалано, PP-Overall081-2900Все этапы лабораторных процессов.
Контейнер eDNAЖилищные или хозяйственные магазиныNAС крышкой, прочный, прозрачный (≥ 10 л). 
Эллюционная пластина, крышка для стержня, промывочные пластины, пластина для связкиЦягэн19581, 997004, 1031656, 302570Пластмассы, используемые для экстракции ДНК  
Этанол (8:10)Терпеть , ACS ISO РангРазличныеСтационарная стерилизация. Все лабораторные этапы
Полевые технические листы
Флуоресцентный анализ с высокой чувствительностьюТермо Фишер СайентификQ32851Анализ высокой чувствительности кубитов dsDNA (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, США)
Высокоскоростная центрифуга (24 000 об/мин)Hettich Zentrifugen Отделяет ДНК-содержащий супернатант от обломков. Лизис ДНК
Ледяные покровыЖилые магазиныОхлаждение образцов внутри транспортного контейнера
Праймеры IPC вперёд и назадИнтегрированные ДНК-технологииNAИндивидуальный продукт, используемый для амплификации ДНК целевых видов
Зонды IPC PrimeTime qPCRИнтегрированные ДНК-технологииNAИндивидуальный продукт, используемый для амплификации ДНК целевых видов
Ламинарный поток капюшон;Лабораторные продукты KendroVFS1206Стерильная среда для подготовки реагентов в подготовке qPCR
Ламинированный иллюстрированный протокол поля Персонализация
Буфер лизисаЦягэн79216DNeasy Lysis Buffer AL. Альтернатива TES Buffer + Proteinase K
Magnetic-bead– ДНК-робот на основеПЦР-головка KingFisher Apex 965400910Программное обеспечение: BindIx PC 
Магнитные частицы для связывания нуклеиновых кислот (30 & micro; L)Цягэн67563MagAttract частиц. Облегчает связывание ДНК с магнитными шариками при извлечении ДНК
Мастер-микс (5 и mu; L)EMM, Life Technologies4396838TaqMan Мастер-микс по окружающей среде (2.0)
Мини-центрифуга с пластинчатым спиннером LabnetC1000Откручивать жидкие капли и конденсат от ПЦР и микропластин
Комплект для удаления ингибитора ПЦР OneStep-96Исследования ZYMOD6035Очистка и удаление загрязнителей в экстрактах eDNA 
ПЦР-пластиныБио-РадHSP9601Твёрдый корпус 96-колодец
Пипетки + стерильные фильтрованные наконечникиПипетты: BIOHIT, наконечники фильтра: Biozym Safe  Seal Tips  ПрофессиональныйРазличныеРучные или электронные пипетки могут использоваться при различных максимальных объёмах
Центрифуга с пластинчатым спиннером NANAУдаляет пузырьки перед qPCR 
Протеиназа KAvantor VWRA4392.0010Переваривает белки, чтобы помочь высвобождать ДНК во время лизиса
Очищенная водаMilliQNAВода без РНази, используемая для негативного контроля и очищающего раствора 
Реактивные трубки (2 мл)Эппендорф30120094Лизис ДНК
Количественный термоциклер ПЦР в реальном времениAnalytikjenaNAQTower 3G-платформа. Амплифицирует и количественно оценивает ДНК в реальном времени
ВерёвкиКатание на лодках, хозяйственные магазины, рыболовные гаваниNAПрочный материал (например, полиэтилен или плетеная верёвка). Длина не менее чем в два раза больше высоты судна
Герметизирующая плёнка, клей, оптическаяБио-РадMSB1001Микропечать 'B'. Герметизация пластины PRC перед ПЦР
Самосохраняющиеся eDNA-фильтрыSmith-Root 11579-251.2 и микро; m размера пор. Количество за каждую кампанию выборки: по необходимости
Контейнер для перевозкиЛаборатории, аптеки, AmazonРазличныеПенопластовая изоляция
Программное обеспечение для выравнивания и анализа биологических последовательностейБиографическая редакцияВерсия 7Удобная редактор и анализ биологических последовательностей для Windows 95/98/NT
Бутылка для сжиманияЛаборатории, аптекиРазличныеНаполнено домашним отбеливателем (1:10)
Программное обеспечение для статистического анализаКоманда студии R. (2023)Версия 4.2.1
Стерилизованные перчатки без ДНКSempercare  Издание79712Все этапы лабораторных процессов. 
Буфер TESКастомный продукт, эквивалентный буферу лизиса DNeasy
Контейнер для токсичных отходовБезопасная утилизация опасных отходов. Все шаги
УФ-лампа SterilAIRСтерилизация вытяжки для подготовки qPCR
Vortex-genie 2 вихревой миксер Термо Фишер Сайентифик50728002Гомогенизирует и смешивает реагенты. Лизис ДНК, экстракция
Контейнер для мусораЖилые магазиныМаленький жёсткий контейнер
Водяной насос (перистальтический/вакуумный)Эйкелькамп; Solinst/Smith-Root 12.34.SB; 410/12099Портативные насосы
Водонепроницаемый маркерРазличные

Ссылки

  1. Hammerschlag, N., et al. Ecosystem function and services of aquatic predators in the Anthropocene. Trends Ecol Evol. 34 (4), 369-383 (2019).
  2. Sequeira, A. M. M., et al. Overhauling ocean spatial planning to improve marine megafauna conservation. Front Mar Sci. 6, 639(2019).
  3. Noren, D. P., Mocklin, J. A. Review of cetacean biopsy techniques: Factors contributing to successful sample collection and physiological and behavioral impacts. Mar Mamm Sci. 28 (1), 154-199 (2012).
  4. Evans, P. G. H., Hammond, P. S. Monitoring cetaceans in European waters. Mammal Rev. 34 (1-2), 131-156 (2004).
  5. Bittencourt, L., et al. Mapping cetacean sounds using a passive acoustic monitoring system towed by an autonomous Wave Glider in the Southwestern Atlantic Ocean. Deep Sea Res Part I. 142, 58-68 (2018).
  6. Balmer, B. C., et al. Advances in cetacean telemetry: A review of single-pin transmitter attachment techniques on small cetaceans and development of a new satellite-linked transmitter design. Mar Mamm Sci. 30 (2), 656-673 (2014).
  7. Angliss, R. P., et al. Comparing manned to unmanned aerial surveys for cetacean monitoring in the Arctic: Methods and operational results. J Unmanned Veh Syst. 6 (3), 109-127 (2018).
  8. Jahoda, M., et al. Mediterranean fin whale (Balaenoptera physalus) response to small vessels and biopsy sampling assessed through passive tracking and timing of respiration. Mar Mamm Sci. 19 (1), 96-110 (2003).
  9. Fu, M., Hemery, L., Sather, N. Cost efficiency of environmental DNA compared to conventional methods for biodiversity monitoring at marine energy sites. PNNL Rep. , PNNL-32310(2021).
  10. Sahu, A., et al. Environmental DNA (eDNA): Powerful technique for biodiversity conservation. J Nat Conserv. 71, 126325(2023).
  11. Klymus, K. E., et al. Development and testing of species-specific quantitative PCR assays for environmental DNA applications. J Vis Exp. (165), e61825(2020).
  12. Wilcox, T. M., et al. Robust detection of rare species using environmental DNA: The importance of primer specificity. PLoS ONE. 8 (3), e59520(2013).
  13. Wilcox Talbot, L. A., et al. Validated environmental DNA assay for detection of the rare Rice's whale (Balaenoptera ricei). Environ DNA. 7 (2), e70074(2025).
  14. Rodriguez, L. K., et al. Inter-laboratory ring test for environmental DNA extraction protocols: Implications for marine megafauna detection using novel qPCR assays. Metabarcoding Metagenomics. 9, e128235(2025).
  15. Adams, C. I., et al. Beyond biodiversity: Can environmental DNA cut it as a population genetics tool. Genes. 10 (3), 192(2019).
  16. Parsons, K. M., et al. Water everywhere: Environmental DNA can unlock population structure in elusive marine species. R Soc Open Sci. 5 (8), 180537(2018).
  17. Rourke, M. L., et al. Environmental DNA as a tool for assessing fish biomass: A review. Environ DNA. 4 (1), 9-33 (2022).
  18. Sard, N. M., et al. Comparison of fish detections using environmental DNA metabarcoding and traditional gears. Environ DNA. 1 (4), 368-384 (2019).
  19. Sigsgaard, E. E., et al. Population-level inferences from environmental DNA-Current status and future perspectives. Evol Appl. 13 (2), 245-262 (2020).
  20. Afonso, L., et al. Environmental DNA as a complementary tool for biodiversity monitoring. PLoS ONE. 19 (10), e0300992(2024).
  21. Silliman, K., et al. Evaluating prey availability for the Rice's whale based on environmental DNA. Ecol Evol. 16 (1), e72789(2026).
  22. Boyse, E., et al. Environmental DNA reveals fine-scale spatial and temporal variation of marine mammals and prey species. Environ DNA. 6 (4), e587(2024).
  23. Székely, D., Cammen, K. M., Olsen, M. T. Using environmental DNA to study marine mammals in the North Atlantic. NAMMCO Sci Publ. 12, (2021).
  24. Alter, S. E., et al. Using environmental DNA to detect whales and dolphins in the New York Bight. Front Conserv Sci. 3, 820377(2022).
  25. Parsons, K. M., et al. Environmental DNA for monitoring marine mammals: Challenges and opportunities. Front Mar Sci. 9, 987774(2022).
  26. Couton, M., Viard, F., Altermatt, F. Opportunities and inherent limits of using environmental DNA for population genetics. Environ DNA. 5 (5), 1048-1064 (2023).
  27. Leerhøi, F., et al. Exploring the potential of extreme citizen science with Danish high school students using environmental DNA for marine monitoring. Front Mar Sci. 11, 1347298(2024).
  28. Tøttrup, A. P., et al. Citizens in the lab: Performance and validation of eDNA results. Citiz Sci Theory Pract. 6 (1), (2021).
  29. Kelly, R., et al. Citizen science and marine conservation: A global review. Philos Trans R Soc B. 375 (1814), 20190461(2020).
  30. Church, E. K., et al. From citizen science experiences to stewardship action. Mar Policy. 173, 106537(2025).
  31. Barbaccia, E., et al. Combining citizen science, environmental DNA, and whale watching. Ocean Coast Manag. 269, 107827(2025).
  32. Barbaccia, E., et al. Willingness to engage in marine conservation through eDNA-informed citizen science. Sci Rep. 15 (1), 41983(2025).
  33. Broadhurst, H. A., et al. Citizen scientists' motivation to participate in environmental DNA (eDNA) surveys. Citiz Sci Theory Pract. 10 (1), (2025).
  34. O'Connor, S., et al. Whale Watching Worldwide. , Int Fund Anim Welfare. Yarmouth, MA. (2009).
  35. Valsecchi, E., et al. Ferries and environmental DNA: Underway sampling from commercial vessels. Front Mar Sci. 8, 704786(2021).
  36. Foote, A. D., et al. Investigating the potential use of environmental DNA (eDNA) for genetic monitoring of marine mammals. PLoS ONE. 7 (8), e41781(2012).
  37. Baker, C. S., et al. Environmental DNA (eDNA) from the wake of the whales. Front Mar Sci. 5, 342201(2018).
  38. Takahashi, M., et al. Aquatic environmental DNA: A review. Sci Total Environ. 873, 162322(2023).
  39. Govindarajan, A. F., et al. Improved biodiversity detection using a large-volume environmental DNA sampler. Deep Sea Res Part I. 189, 103871(2022).
  40. Bessey, C., et al. Maximizing fish detection with environmental DNA metabarcoding. Environ DNA. 2 (4), 493-504 (2020).
  41. Robinson, C. V., et al. DNA from dives: Species detection of humpback whales from flukeprint environmental DNA. Environ DNA. 6 (2), e524(2024).
  42. Rodriguez, L. K., et al. Enhancing environmental DNA sampling efficiency for cetacean detection. Environ DNA. 7 (3), e70103(2025).
  43. Jackman, J. M., et al. Performance of eDNA filtration methods in a hyper-tidal estuary. Environ DNA. 7 (5), e70206(2025).
  44. Majaneva, M., et al. Environmental DNA filtration techniques affect recovered biodiversity. Sci Rep. 8, 4682(2018).
  45. Liu, Q., et al. Optimization of pore size and filter material for better enrichment of environmental DNA. Front Environ Sci. 12, 1422269(2024).
  46. Li, J., et al. Effect of filtration method on environmental DNA capture efficiency. Mol Ecol Resour. 18 (5), 1102-1114 (2018).
  47. Robinson, C. V., et al. Temporal dynamics of flukeprint environmental DNA detection. Environ DNA. 7 (3), e70132(2025).
  48. Székely, D., et al. Environmental DNA captures the genetic diversity of bowhead whales. Environ DNA. 3 (1), 248-260 (2021).
  49. Bruce, K., et al. A practical guide to DNA-based methods for biodiversity assessment. Adv Books. 1, e68634(2021).
  50. Pogner, C. -E., et al. Airborne DNA: State of the art. Sci Total Environ. 957, 177439(2024).
  51. Goldberg, C. S., et al. Critical considerations for environmental DNA detection. Methods Ecol Evol. 7 (11), 1299-1307 (2016).
  52. Combining environmental DNA sampling, whale watching and citizen science. , eWHALE Project. accessed (2025).
  53. Klotz, L., et al. Annual and monthly fluctuations in humpback whale presence. J Cetacean Res Manag. 16, 9-16 (2017).
  54. Peres dos Santos, R., et al. First humpback whale re-sighting. Polar Biol. 45 (3), 523-527 (2022).
  55. Thalinger, B., et al. Validation scale for environmental DNA assays. Environ DNA. 3 (4), 823-836 (2021).
  56. Hall, T. A. BioEdit. Nucleic Acids Symp Ser. 41, 95-98 (1999).
  57. Benoit, N. P., et al. Using qPCR of environmental DNA to estimate salmon biomass. Environ DNA. 5 (4), 683-696 (2023).
  58. Skovhus, T. L., et al. Real-time quantitative PCR for marine bacteria. Appl Environ Microbiol. 70 (4), 2373-2382 (2004).
  59. Godhe, A., et al. Quantification of diatom and dinoflagellate biomasses. Appl Environ Microbiol. 74 (23), 7174-7182 (2008).
  60. Baudry, T., et al. Influence of distance and seasonality in eDNA detection. Environ DNA. 5 (4), 733-749 (2023).
  61. Hunter, M. E., et al. Detection limits of PCR assays. Mol Ecol Resour. 17 (2), 221-229 (2017).
  62. Lee, J., et al. Species-specific eDNA assay for Ascidiella aspersa. Ecol Evol. 15 (11), e72453(2025).
  63. National Center for Biotechnology Information. BLAST. , accessed (2025).
  64. R Foundation. R. , (2023).
  65. susannat, eDNA sampling protocol: Smith-Root citizen scientist sampler. , protocols.io. (2024).
  66. Thomas, A., et al. Self-preserving eDNA filter. Methods Ecol Evol. 10, 1137-1145 (2019).
  67. Thalinger, B., et al. eDNA shedding of freshwater fish. Front Ecol Evol. 9, 623718(2021).
  68. Hymus, C. [PhD Thesis]. , Murdoch Univ. (2016).
  69. Rodriguez, L. K., Thalinger, B. DNA extraction - Qiagen BioSprint® 96 Workstation using the Biosprint 96 tissue protocol UIBK eWHALE. , protocols.io. (2024).
  70. Valsecchi, E., et al. Universal primers for marine mammals. Environ DNA. 2 (4), 460-476 (2020).
  71. Rota, A., Valsecchi, E. Floating Lab SOP. J Vis Exp. 222, e67366(2025).
  72. Robinson, C. V., et al. Limited cetacean detection by low-volume eDNA. Environ DNA. 5 (6), 1641-1651 (2023).
  73. Pinfield, R., et al. False-negative detections in killer whale presence. Environ DNA. 1 (4), 316-328 (2019).
  74. Strickler, K. M., et al. eDNA degradation. Biol Conserv. 183, 85-92 (2015).
  75. Rishan, S. T., et al. Applications of eDNA metabarcoding. Environ Adv. 12, 100370(2023).
  76. Schrader, C., et al. PCR inhibitors. J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).
  77. Thomsen, P. F., et al. Detection of marine fish fauna. PLoS ONE. 7 (8), e41732(2012).
  78. Guri, G., et al. Detection sensitivity of qPCR and ddPCR. Ecol Evol. 14 (12), e70678(2024).
  79. Andruszkiewicz, E. A., et al. Persistence of marine fish eDNA. PLoS ONE. 12 (9), e0185043(2017).
  80. Venegas, V., Halberg, M. C. mtDNA copy number. Methods Mol Biol. 837, 327-335 (2012).
  81. Naue, J., et al. mtDNA copy number variation. Mitochondrion. 74, 101823(2024).
  82. Andreu, A. L., et al. mtDNA copy number. Mitochondrion. 9 (4), 242-246 (2009).
  83. Langlois, V. S., et al. Robust qPCR-based eDNA assays. Environ DNA. 3 (3), 519-527 (2021).
  84. Barnes, M. A., Turner, C. R. Ecology of environmental DNA. Conserv Genet. 17, 1-17 (2016).
  85. Mathieu, C., et al. Variability in eDNA data. Front Ecol Evol. 8, 466868(2020).
  86. Wilson, C. C., et al. Synthetic controls for eDNA. Methods Ecol Evol. 7 (1), 23-29 (2016).
  87. Lux, M. W., et al. Reproducibility in synthetic biology. Synth Biol. 8 (1), ysad014(2023).
  88. Sepulveda, A. J., et al. Contamination in eDNA studies. Front Ecol Evol. 8, 609973(2020).
  89. Minamoto, T., et al. An illustrated manual for environmental DNA research. Environ DNA. 3 (1), 8-13 (2021).
  90. Barnes, M. A., et al. Environmental conditions influence eDNA persistence. Environ Sci Technol. 48 (3), 1819-1827 (2014).
  91. Oka, S. I., et al. Gravity filtration of eDNA. MethodsX. 9, 101838(2022).
  92. Berran, M. S., et al. eDNA sampling strategies. Hydrobiologia. 852, 3485-3501 (2025).
  93. Esri. ArcGIS Survey123. , (2025).
  94. Ralson, M. J., et al. Translating eDNA into conservation action. Conserv Sci Pract. 7 (2), e70000(2025).
  95. Dela Cruz-Modino, R., Cosentino, M. Whale-watching industry value. Sustainability. 14 (20), 13471(2022).

Перепечатки и разрешения

Теги

Flukeprint
Отбор образцов окружающей среды ДНК с судов для наблюдения за китами для мониторинга китообразных
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.