Хирургический протокол для большого, закрываемого черепного окна, позволяющего продольные, мультимодальные электрофизиологические записи сети по умолчанию для мыши

Краткое содержание

Этот протокол описывает двухфазный хирургический метод создания большого, защищённого, удерживающего твердость черепного окна у мышей. Эта техника позволяет проводить хронические, мультимодальные электрофизиологические записи из распределённых глубокомозговых сетей, таких как Default Mode Network, в течение нескольких недель.

Аннотация

Сеть по умолчанию (DMN) — это центральная, крупномасштабная мозговая сеть, вовлечённая в ряд когнитивных функций и нейропсихиатрических расстройств, таких как большое депрессивное расстройство (MDD). Изучение сложной динамики DMN на животных моделях даёт бесценное понимание его функции как в здоровых, так и в патологических состояниях. Однако проведение стабильных, долгосрочных, масштабных электрофизиологических записей из множества глубоких и распределённых узлов DMN у бодрствующих мышей остаётся серьёзной задачей.

Здесь представлен новый двухфазный хирургический протокол для создания большого (4 мм × 7,6 мм), прочного и закрываемого черепного окна у мышей. Процедура направлена на сохранение целостности твердой мозговой мозговой мозги, что имеет первостепенное значение для долгосрочного здоровья мозга и стабильности записи.

Это окно позволяет одновременно проводить повторяющиеся продольные записи с более чем 1000 электродов, сочетая поверхностную микроэлектрокортикографию (μECoG) с двумя высокоплотными внутричерепными электродными зондами, обеспечивая беспрецедентный доступ к DMN. Эта методика предоставляет надёжную платформу для мультимодального, многомасштабного анализа электрофизиологической динамики всей сети в течение нескольких недель, открывая новые возможности для изучения нейропластических изменений, лежащих в основе патофизиологии заболеваний мозга, а также для оценки хронических эффектов новых терапевтических препаратов.

Введение

Сеть по умолчанию (DMN) была впервые выявлена в исследованиях визуализации мозга человека как созвездие областей, постоянно подавляемых во время внешне ориентированных, требующих внимания задач¹. В настоящее время она считается фундаментальной крупномасштабной сетью, поддерживающей внутренне ориентированные когнитивные процессы, такие как самореферентное мышление, автобиографическая память и планирование будущих событий ^2,3. У человека каноническая ДМН включает набор анатомически связанных основных областей, включая медиальную префронтальную кору (mPFC), заднюю поясную кору (PCC), нижнюю теменную долю (IPL) и^{гиппокампальную форму 4}. Дисфункция внутри этой сети является ключевой чертой ряда нейропсихиатрических расстройств. При большом депрессивном расстройстве (ВДП) ДМН обычно проявляет гиперактивность и изменённые модели функциональной связности, которые, как считается, лежат в основе основных симптомов ВДП, таких как руминация и негативное^{самовосприятие 5,6}.

Для изучения клеточных и цепных механизмов, вызывающих дисфункцию DMN, необходимы надёжные животные модели. У грызунов надежно выявлен гомологичный DMN, состоящий из сопоставимых областей мозга, таких как mPFC, поясная кора и ретросплениальная кора (RSP), что подтверждает мышь как трансляционно релевантную модель для механистического^{исследования 7,8}. Кроме того, хронический стресс, ключевой фактор депрессии, способен изменять связь DMN у грызунов, аналогично тому, как наблюдается у пациентов с ВДП^{человека 9}.

Понимание нейропластических изменений, возникающих при заболеваниях или в ответ на хронические терапевтические вмешательства, требует продолжения наблюдения за нейронной активностью, поскольку одна сессия записи не может зафиксировать динамическую адаптацию нейронных цепей во времени^{. 10}. Электрофизиология in vivo обеспечивает временное разрешение в миллисекундном масштабе, необходимое для изучения нейронных колебаний и синхронизации локального полевых потенциалов (LFP). LFP демонстрирует суммарный внеклеточный сигнал, отражающий синхронизированную синаптическую активность локальных нейронных популяций, которые являются фундаментальными основами сетевой^{коммуникации 11,12}. Однако проведение хронических масштабных электрофизиологических записей у бодрствующих мышей остаётся технически сложным. Традиционные хронические черепные окна были разработаны для оптической съёмки у бодрствующей мыши и остаются стандартной подготовкой для этой цели, где их типичная площадь однополушария и прозрачный стеклянный покров оптимальны для предполагаемого^{показания 13}. Однако они не были предназначены для электрофизиологии с несущими очками в нескольких точках, поэтому рабочая зона и оптический интерфейс исключают одновременную высокоплотную запись с распределённых двусторонних узлов сети, такой как^{DMN 14}. Хронические электродные имплантаты, в свою очередь, позволяют проводить продольные записи, но вызывают прогрессивную инкапсуляцию инородных тел и глиальные рубцы вокруг постоянно расположенного хвоста, что со временем снижает качество^{сигнала 15,16}.

Описанная здесь двухфазная хирургическая процедура напрямую устраняет эти ограничения. Он создаёт большое, закрывающееся черепное окно, закрытое между сессиями пассивной мембраной полидиметилсилоксана (PDMS), силиконовым герметиком и 3D-печатной крышкой, что позволяет многократно вставлять неконечные сетки μECoG для мезомасштабных LFP-записей вместе с несколькими высокоплотными внутричерепными электродными зондами для микромасштабных, ламинарно-разрешённых одиночных и LFP-активностей^17,18. В отличие от прежних хронических методов, которые либо полагаются на постоянно имплантированные электродные массивы, накапливающие глиальную инкапсуляцию электродов со временем, либо требуют терминальных острых краниотомий, исключающих продольные конструкции, описанное здесь окно сохраняет целостную твердую орудость и избегает постоянного контакта с^{инородным телом} 15,16,18 . Кроме того, в валидационной когорте, в которой черепное окно открывалось три раза (послеоперационные дни 0, 21, 22) без электрофизиологической записи, количественная иммунореактивность глиального фибриллярного кислотного белка (GFAP) и ионизированного кальцие-связывающего адаптера 1 (IBA1) существенно не отличалась от нехирургических контролей, что указывает на низкий уровень астроглиоза и микроглиоза по графику повторного открытия, используемом здесь. Метод особенно подходит для продольных, многоточечных записей распределённых корковых сетей, включая DMN, в сочетании с ламинарным высокаплотным внутричерепным электродным зондом к глубоким структурам у бодрствующих мышей с фиксированной головой. Основные эксплуатационные ограничения — микрохирургическая экспертиза, необходимая для надёжного удаления костного лоскута с сохранением дура, и несовместимость с свободно движущимися записями, поскольку высокоплотные внутричерепные электродные зонды требуют фиксации головы.

Протокол

Все эксперименты на животных были одобрены Национальным советом по экспериментам на животных в Финляндии (номер лицензии: ESACI/40845/2022), а эксперименты проводились в соответствии с директивой Европейского парламента 2010/63/ЕС о защите использования животных в научных целях и в соответствии с национальными рекомендациями по уходу и использованию лабораторных животных.

ПРИМЕЧАНИЕ: Все хирургические процедуры проводятся внутри ламинарного хирургического капюшона, предварительно стерилизованного ультрафиолетовым облучением (минимум 15 минут) или тщательной дезактивацией поверхности этанола. Отходы изофлурана улавливаются с помощью системы очистки активированного угля, установленной внутри капюшона. Оператор носит одноразовый чехол для волос, хирургическую маску, лабораторный халат с длинным рукавом и однослойные нестерильные нитриловые перчатки для осмотра (распылённые 80% этанолом перед посадкой в капюшон). Внутри капюшона размещается контейнер для утилизации острых предметов для немедленной утилизации лезвий скальпеля и игл.

1. Предоперационная подготовка и анестезия

1. Используйте мышей C57BL/6JRj, не менее 10 недель и весом более 20 г.
2. Перед операцией очистите все инструменты в тёплой ультразвуковой ванне. Ополосните, высушите и замочите в этаноле 70% минимум 15 минут.
3. В качестве альтернативы простерилизуйте инструменты коротким проходом через стеклянный или инфракрасный стерилизатор непосредственно перед использованием. Стерильные шторы не используются. Между последовательными животными в одной сессии возвращайте инструменты в этаноловую смесь как минимум на 2^{минуты 19} минут.
4. Взвесьте каждую мышь по отдельности на откалиброванных весах и рассчитывайте объёмы предоперационных препаратов.
5. Заранее подготовьте стерильные мембраны PDMS (проводите один раз за партию, вне острого хирургического дня).
   1. Отливайте стерильные мембраны PDMS из смеси эластомера с отверждающим агентом в соотношении 10:1, приготовленной согласно инструкции производителя, и листа, до целевой толщины примерно 500 мкм, затвердевая незатвердевшую смесь между двумя плоскими боросиликатными стеклянными пластинами, затем отверждайте при 60 °C не менее 2 часа.
   2. Запечатайте высушенные листы в автоклавные пакеты и простерилизуйте паровой автоклавировкой. В предварительно стерилизованном хирургическом капюшоне используйте стерильный скальпель #11 и небольшую линейку из нержавеющей стали, чтобы разрезать каждый лист на прямоугольные мембраны, соответствующие размерам окна черепа.
   3. Храните предварительно вырезанные мембраны в стерильной лабораторной посуде (например, в отдельных колодцах 6-колодной пластины для культивирования) до использования.
6. Проводите контроль качества аппаратного обеспечения перед каждой сессией записи.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рутинная проверка импеданса на массиве μECoG не проводится: неисправности опорного провода очевидны в исходных трассах, а тестирование импеданса вызывается только при подозрении на аппаратную проблему. Высокоплотные внутричерепные электродные зонды включают встроенный импеданс и диагностику целостности кабеля, доступную через графический интерфейс записывающего программного обеспечения; Запускайте их, когда качество сигнала явно ухудшается.

2. Фаза 1: Подготовка животных и имплантация головной пластины

1. Приготовление животных
   1. Анестезия мыши изофлураном (индукция: 4%, поддержание: 1,5−2,5%, скорость подачи кислорода 0,5 л/мин). Подтвердите глубину анестезии по потере рефлекса сжатия пальцев.
   2. Сбрийте шерсть от макушки примерно от глаз до шеи.
   3. Поместите животное на грелку с управляемой обратной связью, оснащённую внутренним датчиком температуры, откалиброванным так, чтобы поддерживать температуру тела на уровне 37 °C на протяжении всей процедуры. Наносите глазную мазь карбомер, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
   4. Закрепите мышь в стереотактической раме с помощью неразрывных ушных планок. Отрегулируйте режцовую планку так, чтобы череп лежал ровно, а брегма и лямбда — на одинаковой дорсовентральной высоте (горизонтальная ориентация черепа). Поддерживать анестезию с помощью изофлурана (1,5–2,5%), подаваемого через носовой конус при расходе кислорода 0,5 л/мин.
   5. Вводите предоперационные анальгетики и противовоспалительные препараты с помощью подкожных инъекций: карпрофен (5 мг/кг), бупренорфин (0,05 мг/кг) и дексаметазон (2 мг/кг).
   6. Дезинфицируйте выбритое место раствором повидона и йода.
   7. Введите раствор лидокаина-эпинефрина (s.c.) в качестве местного анестетика под кожу головы.
2. Экспозиция черепа
   1. Сделайте небольшой поперечный разрез на линии уха (примерно 1 см).
   2. Постепенно увеличивайте разрез, расширяя порез по бокам вокруг ушей и по обеим сторонам головы к глазам, но не превышайте предел пореза до глаз. Завершите экспозицию, сделав диагональный разрез с каждой стороны к средней линии, чтобы вся верхняя поверхность черепа была открыта.
3. Чистка черепа
   1. Тщательно очистите обнажённый череп лабораторным ацетоном. Окуните стерильную ватную палочку в ацетон, удалите лишний растворитель (предотвращая капать на соседние ткани) и наносите на кость, пока не удаляете весь видимый надственный элемент.
   2. Используйте ацетон из-за его способности растворять жировые остатки и стойкие мембранозные остатки на поверхности костей, а не как дезинфицирующее средство.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полное удаление надкостника и липидных остатков с поверхности кости критически важно для прочного сцепления головной пластины и зубного цемента. Поскольку имплантат должен выдерживать механические нагрузки, создаваемые бодрствующей мышью, любой остаточный окостник или липидная плёнка на границе костного клея становится доминирующей точкой разрушения.
   3. Используйте тупое микрохирургическое (круглое) лезвие скальпеля, чтобы удалить остатки периостальных и соединительных фрагментов, которые ацетоновая промывка не растворила полностью. Держите его примерно под углом 45° к поверхности кости и соскребите череп лёгкими, радиальными движениями, направленными наружу от соединения брегмы с средней линией к боковым краям открытой кости.
   4. Продолжайте, пока вся открытая поверхность кости не пройдёт хотя бы один раз и не будет равномерно чистой и матовой.
   5. Завершите финальной короткой очисткой с использованием ацетона на аппликаторе с хлопковой кончиком.
4. Маркировка места краниотомии
   1. Прикрепите биосовместимый хирургический кожный маркер к цифровой стереотаксической руке.
   2. Отметьте прямоугольную область размером 4 мм × 7,6 мм на черепе относительно брегмы.
      1. Переведите кончик маркера к bregma и сбросьте координаты X и Y на цифровом индикаторе до нуля.
      2. Переместите рычаг на каждый из четырёх углов планируемого окна, чтобы прямоугольник выходил на 2 мм вбок от брегмы с обеих сторон, по 3 мм рострально и 4,6 мм хвостово, и разместите по одной точке в каждом углу.
5. Отметьте два участка вставки внутричерепного зонда на правом полушарии.
   1. Отметьте место рострального зонда на 1,66 мм A/P и 1,95 мм M/L от bregma.
   2. Отметьте место хвостового зонда на -2,2 мм A/P и 1,9 мм M/L от брегмы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти сайты адаптированы с учетом специфических регионов DMN. С помощью этого протокола сайты введения могут быть настраиваны для нескольких разных областей.
   3. Отсоедините маркер от стереотаксической руки.
   4. Прикрепите к черепу стерилизованный гибкий прямой край (например, тонкую пластиковую карту) и соедините четыре угловые точки маркером, чтобы очертать будущее черепное окно как непрерывный прямоугольник.
6. Увеличение площади поверхности для лучшей адгезии
   1. Выполните все следующие шаги до четвертого раздела под бинокулярным микроскопом.
   2. Выгравируйте поперечный узор на всех открытых костных поверхностях за пределами оконной области хирургическим лезвием #11 и создайте неглубокие, но чётко выраженные бороздки глубиной 0,2–0,4 мм, чтобы получить равномерную сетку примерно 1 мм × квадратов 1 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это увеличит эффективную площадь поверхности и, соответственно, механическое сцепление сверхлежащего клея и зубного цемента.
   3. Создайте аппликатор из тонкого клея, поместив стерильную иглу весом 30 G на кончик длинной ватной палочки и согнув иглу в V-образную форму.
   4. Насыпьте цианоакрилатный клей в одноразовую пластиковую весовую лодку и окуните аппликатор в резервуар клея.
   5. Нанесите клей на каждую открытую и выгравированную поверхность кости, нанося не более одного налёта на участок, чтобы покрытие было тщательным, но никогда не чрезмерным. Дайте клею высохнуть 7 минут.
7. Имплантация опорного гнезда
   1. Выберите место бурения над левым мозжечком, чтобы избежать видимых поверхностных сосудов.
   2. Закрепите стоматологическое сверло на держатель дрели в стереотаксическом рычаге.
   3. Просверлите пилотное отверстие по 5–10 секунд с использованием круглого стального отверстия на скорости 20 000–25 000 об/мин, втягивая сверло между сериями для осмотра участка под биноклем.
   4. Сверлите, пока отверстие не станет более прозрачным, откроет светло-розовый оттенок, и твердая оболочка станет видна сквозь утонченную кость.
   5. На этом этапе немедленно прекратите сверление, чтобы избежать дюрального проникновения. Размер готового отверстия составляет примерно 0,5 мм, лишь немного больше внешнего диаметра опорного гнезда.
   6. Вставьте позолоченное опорное гнездо в пилотное отверстие, закрепите его цианоакрилатным клеем и укрепите соединение зубным цементом, который может оправиться ультрафиолетом. Зафиксируйте зубной цемент световым диодом (LED) на 1 минуту.
8. Имплантация головной панели
   1. Положите небольшое количество зубного цемента, поддающегося ультрафиолету, на вершину открытой ростральной кости (точку ближе к носу) для выравнивания.
   2. Положите головную пластину на череп так, чтобы один край опирался на зубные цементные каркасы, затвердевшие вокруг опорного гнезда (шаг 2.7.6), а противоположный край опирался на свежую ростральную цементную мазку.
   3. Выровняйте головную пластину так, чтобы её длинная ось была центрирована на сагиттальной средней линии, а две фиксационные ручки простирались перпендикулярно (90°) к средней оси. Зафиксируйте композит под ультрафиолетовой лампой, чтобы зафиксировать головную пластину на месте.
   4. Укрепите конструкцию, нанося последовательные ультрафиолет-отверждаемые зубные цементные слои толщиной примерно 1 мм вокруг основания головной пластины, окружающую гравированную кость и опорную лунку, пока вокруг периметра будущего черепного окна не сформируется непрерывное, герметичное ограждение.
   5. Закалывайте каждый шаг отдельно с помощью светодиодной отверждающей ручки 405 нм в течение 40 секунд на рабочем расстоянии 1–2 см, обеспечивая полную полимеризацию перед нанесением следующего слоя. Убедитесь, что готовая цементная стена заподлицо прилегает к верхней поверхности головной панели и полностью закрывает оголённый периметр без наложения на отмеченную зону окна.
9. Дайте мыши восстановиться после анестезии. Верните мышь в домашнюю клетку минимум на 48 часов.
10. Перед переходом к разделу 3 убедитесь, что животное вернулось к более чем 5% от дооперационного веса тела и не проявляет признаков боли по шкале^{гримасы мыши 20}. Если какой-либо из этих критериев не выполнен, продлевайте период восстановления до их удовлетворения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта поэтапная конструкция с межоперационным интервалом восстановления имеет решающее значение. Это позволяет животному восстановиться после первоначального физиологического стресса и воспаления перед краниотомией, что, как показало, улучшает успех операции и долгосрочное здоровье импланта; Здесь используется минимум 48 часов, а поэтапный черепный имплант с многодневным интервалом восстановления между фиксацией головной пластины и краниотомией доказал снижение периоперационного воспаления и улучшение качества долгосрочной подготовки¹⁴.

3. Фаза 2: Хроническое создание окон черепа

1. Предоперационная подготовка
   1. Подготовьте хирургическую зону и инструменты, как описано в разделе 1.
   2. Повторная анестезия мыши изофлураном (индукция 4%, поддержание 1,5–2,5%)
   3. Разместите мышь в стереотактической системе, как описано в шаге 2.1.4.
   4. Вводите предоперационные препараты в тех же дозах, что описаны на шаге 2.1, за исключением местного анестетика с лидокаином-эпинефрином (кожа с кожи головы уже удалена в фазе A, поэтому он больше не применим).
2. Сверление окна
   1. Начните истончение кости с помощью стоматологического сверла по прямоугольному контуру, отмеченному в Фазе 1 (шаг 2.4). Начните с 25 000 об/мин, держа буровое устройство перпендикулярно (≈ 90°) поверхности кости и выполните один-два чуть более глубоких прохода вдоль краёв прямоугольника, чтобы создать начальную резовую канавку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость стартового сверления может быть настроена в соответствии с уровнем опыта оператора.
   2. Буровые канавки (примерно 0,2–0,3 мм глубиной) в кость и стоматологический цемент рядом с окном черепа на двух координатах вставки зонда, отмеченных на шаге 2.5.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти борозды служат стойкими визуальными ориентирами, которые остаются видимыми после удаления костного лоскута и используются для воспроизводимого перестановки внутричерепных зондов в последующих электрофизиологических сессиях.
   3. Регулярно применяйте ледяную стерильную искусственноспинномозговую жидкость (ACSF; приготовленную по рецепту, содержащему цефазолин Голди и ^др.14), чтобы предотвратить термическое повреждение коры и минимизировать^{кровотечение 14}.
   4. Постепенно снижайте скорость сверления до 20 000 об/мин по мере того, как кость истончается, и наклоняйте настойку на ≈ 45°, чтобы оператор мог стабилизировать дрель на руке и перейти к более мягким, контролируемым движениям.
3. Удаление костного лоскута (критический этап)
   1. Продолжайте бурение вдоль периметра прямоугольника, пока кость внутри контура не станет примерно на 90% тоньше. Не просверливайте череп полностью.
   2. Подтвердите оставшуюся толщину кости с помощью двух дополнительных проверок:
      1. Под бинокулярным микроскопом мягко постучите тупым инструментом по краю тонкой костной полки. Величина отклонения, возникаемого лёгким касанием, напрямую указывает на остаточную толщину кости.
      2. Нанесите ледяной ACSF на просверленное окно и немедленно осмотрите через бинокль: в первые 20–30 секунд, до того как ACSF проникнет в кость, жидкий слой резко усиливает визуальный контраст, разрешая кортикальные капилляры там, где кость была истончена близко к твердой мозговой оболочке, в то время как участки остаточной толщины остаются относительно непрозрачными под жидкостью. Когда клапан станет равномерно прозрачным и явно гибким, переходите к шагу 3.3.3.
   3. Переключитесь на тонко изогнутый дуровый крюк, который заканчивается наконечником с углом 90°. Вставьте кончик под край истонченной кости с крайней осторожностью под углом примерно 15° относительно поверхности кости и проведите крючок по периметру окна, аккуратно отделяя костный лоскут от окружающего черепа и подлежащей ткани.
   4. Двигайтесь постепенно от одного угла к другому вдоль боковых сторон с обеих сторон, а затем продвигайтесь от углов к центру прямоугольника, пока весь периметр не отделится от подлежащей твердой орудии.
   5. При скольжении не давите вниз на твердый крюк и избегайте прикосновения к мозгу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чередование диагонально противоположных углов при малом углу крюка равномерно распределяет механические нагрузки вокруг костного лоску. Эта стратегия предотвращает дюральные разрывы и сохраняет долгосрочное здоровье подлежащей ткани мозга.
   6. Не заставляйте себя двигаться, если крюк столкнётся с сопротивлением в любом углу. Вместо этого опустите клапан и вернитесь к шагу 3.4, чтобы ещё больше утончить прилипливую область.
      1. Если произойдёт разрыв дуральной ткани, прекращайте процедуру для этого животного (распознанную по внезапному фокальному выпуклости, розовому оттенку жидкости или ярко-красному артериальному кровотечению, которое не проходит после трёхкратного заполнения головной пластины ледяным ACSF, позволяя каждой промывке задержаться 30 секунд).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Успешное отслоение свидетельствует по равномерной подвижности костного лоскута по всему периметру без видимых дюральных выпуклостей и лишь незначительного кровотечения из капилляров.
   7. Аккуратно поднимите успешно отсоединённый костный лоскут с помощью крючка дуры в направлении сзади или передней до примерно 35° выше поверхности черепа.
   8. Держите приподнятый край щипцами и мягко покачивайтесь влево и вправо, пока пластина полностью не освободится. Если пластина сопротивляется в любом углу, опустите её обратно в позицию и вернитесь к шагу 3.3.4, чтобы убавить прилипливую область перед повторной попыткой снятия; такое сопротивление указывает на локально недостаточно истончённый участок кости.
   9. Аккуратно очищайте открытую область от свернувшейся крови с помощью многократных промываний ледяным ACSF.
   10. Убедитесь, что дура цела и прозрачна, прежде чем продолжать.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Медленное, постепенное поднятие от заднего края необходимо для минимизации риска повреждения подлежащего верхнего сагиттального и поперечного венозных пазух, а также кортикальной поверхности.
4. Герметизация черепного окна
   1. Установите одну стерильную предварительно отлитую мембрану PDMS (подготовленную в секции 1) непосредственно на дюральную поверхность после того, как кровотечение остановится. При правильном размере она точно закрывает окно и пассивно прилипает к твердой мозговой мозговой мозгу.
   2. Поглощайте остатки ACSF с периметра окна с помощью неволокнистой салфетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протирка никогда не должна касаться открытой твердой оболочки и должна соблюдаться строгая асептическая техника (стерильный оператор, инструменты и поле), так как окно открывается неоднократно, и любое загрязнение, внесённое на этом этапе, может нарушить последующие продольные записи.
   3. Подготовьте двухкомпонентный силиконовый эластомерный герметик согласно инструкции производителя и нанесите смесь эластомера в течение 30 секунд после дозирования, чтобы заполнить все щели между зубно-цементным корпусом и внутренним краем головной пластины, полностью окружая и перекрывая края мембраны PDMS.
   4. Дайте эластомеру затвердеть примерно 2 минуты (или время, указанное производителем). Убедитесь, что затвердевшая пломба непрерывна и герметична для жидкости, но при этом механически удаляемая в начале каждой сессии записи.
   5. Прикрепите на голову индивидуально напечатанную 3D-защитную крышку с небольшим количеством цианоакрилатного клея для защиты окна между сессиями записи.
   6. Дайте мыши восстановиться после анестезии и вернуть её в домашнюю клетку для индивидуального содержания, чтобы предотвратить повреждение импланта.

4. Послеоперационный уход и привыкание

1. Внимательно следите за здоровьем мыши как минимум 2 дня после операции. Вводите дополнительные обезболивающие (s.c.) в течение 2 дней после операции, если мышь проявляет признаки боли по шкале^{гримасы 20}.
2. Дайте мыши восстановиться без помех минимум 4 дня после операции. Затем начните 5-дневный период привычки с постепенно увеличивающейся продолжительностью: 5 минут в первый день, затем 15, 30, 45 и 60 минут на 2, 3, 4 и 5 днях соответственно, чтобы привыкнуть мышь к обращению и к платформе фиксации головы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Известно, что отёк тканей после краниотомии и местное воспаление сохраняются до двух^{недель 21}. Если позволяет экспериментальный график, рекомендуется длительный период восстановления перед первой сессией записи. Перед первой сессией записи убедитесь, что окно черепа выглядит чистым и свободным от непрозрачности или волокнистой ткани под бинокулярным микроскопом, а вес и поведение животного в норме.

5. Процедура продольных электрофизиологических записей

1. Размещение животного на платформе для записи
   1. Положите мышь на платформу для записи и наведите фиксационные зажимы головы мыши. Убедитесь, что высота была предварительно отрегулирована, чтобы сохранить естественную стойку животного во время фиксации головы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если мышь постоянно сопротивляется фиксации головы, не заставляйте процедуру выполнять. Вернуть животное в домашнюю клетку и продлить фазу привычки (раздел 4) на одну-две дополнительные сессии перед повторной попыткой фиксации.
   2. Затяните фиксирующие винты зажима.
   3. Замочите тупое микрохирургическое круглое лезвие в 80% этанола непосредственно перед использованием.
   4. Вставьте лезвие между 3D-напечатанной крышкой и верхней поверхностью наголовной пластины, удерживая лезвие почти параллельно поверхности налобницы. Никогда не продвигайте лезвие за внутренний край отверстия головной пластины, чтобы избежать риска контакта с мозгом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Колпачок намеренно напечатан из прозрачной смолы, чтобы глубина лопастей оставалась видимой по всему материалу.
   5. Двигайтесь по крышке мягкими движениями лево-вправо, которые постепенно расщепляют клейкий слой.
   6. Используйте мелкие щипцы, чтобы поднять крышку и выбросить её, когда она полностью освобождается.
   7. Захватите внешний край кремниевого эластомерного уплотнения и медленно поднимите его от хвостовой стороны к ростральной стороне. Эластомерное уплотнение и подлежащая мембране PDMS отделяются в единое целое, обнажая целую твердую орудую орудость.
   8. Поддерживайте влажность мозга, нанося несколько капель ACSF.
2. Размещение записывающих устройств
   1. Монтировать массив μECoG на сочленённый рычаг с магнитным основанием; Регулировать фрикционный циферблат рычага на основе опыта оператора, при этом опытные операторы предпочитают режим с низким трением, сохраняющий контроль мелкой моторики во время позиционирования.
   2. Направьте массив так, чтобы её поверхность электрода была перпендикулярно (90°) корковой поверхности вдоль правого края окна черепа; После того как устройство будет правильно расположено, затяните фрикционный циферблат для фиксации рычага.
   3. Используйте остроконный силиконовый инструмент для засыпки, чтобы аккуратно коснуться плоского ленточного кабеля массива вниз к верхней поверхности головной пластины, чтобы кабель пришёл в конформацию с головкой, а массив уложился ровно на твердую ободжённую оболочку, где остаточный ACSF обеспечивает пассивную адгезию. Поскольку окно черепа рассчитано на размещение двухсетчатого массива в одной ориентации, грубое выравнивание легко обнаружить.
   4. Сделайте последние тонкие корректировки силиконовым инструментом, сдвинув массив вбок, пока сагиттальная средняя линия не будет чётко центрирована внутри полупрозрачного массива.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полупрозрачная сетка μECoG обнажает сагиттальный синус как однозначный анатомический сигнал выравнивания, который остаётся видимым через массив, позволяя воспроизводить тот же боковой смещение на протяжении продольных сессий. Массив расположен так, чтобы покрыть переднюю поясную кору (ACC) в её ростральной половине и ретросплениальную кору (RSP) в хвостовой половине, охватывая узлы DMN, нацеленные в данном исследовании. Открытый аналитический пакет (ephy_spatial_fidelity-toolkit, доступный по адресу https://github.com/RazBalin/ephy_spatial_fidelity-toolkit) количественно оценивает дрейф размещения сетки от сессии к сессии по сравнению с консервативными записями.
   5. Подключите эталонный провод μECoG к позолоченному опорному гнезду, имплантированному на шаге 2.7.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве дополнительной проверки качества перед сессией сделайте краткую запись, где зонды и массив погружены в коническую трубку ACSF объемом 50 мл, чтобы убедиться, что клетка Фарадея эффективно ослабляет экологические электромагнитные помехи, прежде чем приступить к записи in vivo .
   6. Разместить каудальный высокоплотный внутричерепный электродный зонд на руке микроманипулятора, ориентированную перпендикулярно (≈ 90°) поверхности мозга, а ростральный высокоплотный внутричерепный электродный зонд — на вторую руку, наклонённую под углом 50°.
   7. Под бинокулярным микроскопом продвигайте каждый зонд примерно на 1 мм выше твердой орудости и выровняйте ось Y каждого зонда с соответствующим гравированным направляющим канавкой, фрезерованной на шаге 3.2.4.
   8. Записывайте с помощью письменной записки или фотографии через бинокль, где электродная сетка μECoG находится непосредственно рядом с планируемой точкой входа каждого зонда.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При правильном проведении операции и отёка коры отёка отсутствует, расстояние между кромом кости и массивами μECoG минимально, что делает выбор входной точки однозначным. Для максимальной пространственной точности в продольных сессиях сделайте фотографию экспонированной коры с установленным массивами и определите характерный пиальный сосуд в узкой области между костью и массивами μECoG. Это изображение, аннотированное опорным сосудом и его относительным положением к площадкам μECoG, служит эталонной картой сессии для воспроизведения одной и той же точки входа в последующие дни записи.
   9. Втяните каждый зонд вверх примерно на 15 мм после того, как будет зафиксировано соответствие между зондом и площадкой, чтобы защитить хрупкий электродный прокол во время дюрального прокола.
   10. Изготовление инструмента для дурал-пункции, прикрепив стерильную иглу 30 G к кончику аппликатора с хлопковым наконечником и согнув кончик иглы под углом 90° с помощью тонких щипцов без зубцов.
   11. Медленно направляйте инструмент для прокола по головной пластине. Смотря в бинокль, подсчитайте электродные площадки μECoG, чтобы выровнять инструмент с записанной входной координатой. Опустите изогнутый кончик к дюральной поверхности так, чтобы режущий кончик приближался к дуре под углом 90°, а вал инструмента был удерживан параллельно длинной оси спины мыши.
   12. Продвините кончик примерно на 1 мм ниже дюральной плоскости и убратьте. Ожидается небольшое временное кровотечение в месте прокола; Высушите её скрученным уголком неволокнистой салфетки.
   13. Опускайте каждый высокоплотный внутричерепный электродный зонд на поверхность дуральной поверхности при непрерывном бинокулярном наблюдении сразу после прокола. Если прокол был точно установлен, зонд плавно скользит по перфорации, без отклонения шанки.
   14. Постепенно опускайте каждый зонд до целевой глубины 5 мм ниже твердой мозговой обработки с контролируемой скоростью примерно 0,1 мм/с или^{медленнее 22} мм/с.
   15. Дайте зондам механически осесть в течение 10 минут перед началом сбора данных.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшая дюральная перфорация, созданная иглой 30 G, самозакрывается в течение нескольких минут; поэтому ввод зонда должен следовать за проколом без задержки.
3. Сбор данных
   1. Начать сбор данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сигналы μECoG усиливаются четырьмя 128-канальными цифровыми гарнитурами, соединёнными через интерфейсные кабели SPI с открытой платой приёма, а два высокоплотных внутричерепных электродных зонда получаются через специальный модуль высокоплотного датчика, размещённый в модульном корпусе приборов вместе с многофункциональными модулями ввода/вывода и сбора данных для синхронизации и цифровой передачи. Обычный TTL-мастер-такт генерируется открытой платой μECoG и распространяется в виде аппаратной синхронизационной линии с корпусом захвата зонда (через многофункциональный модуль ввода/вывода), чтобы оба потока приобретения имели единую временную базу, выровненную по образцам. Все потоки данных записываются синхронно через графический интерфейс системы приобретения; полные модели фурнитуры и каталожные номера приведены в Таблице материалов.
   2. В конце сессии записи нанесите 0,5 мл ACSF на μECoG-сетки, затем втяните каждый высокоплотный внутричерепный электродный зонд с той же скоростью, что и при вставке (≈6 мм/мин), и аккуратно уберите массив μECoG.
   3. Очистите зонды и массив, замачив на 45 минут в свежеприготовленном ферментативном растворе 1% (w/v).
   4. После замачивания в ферментном моющем средстве промывайте электроды тремя последовательными окунутыми в воде, очищенной обратно осмосом, используя новую трубку для каждого промывания.
   5. Замените мембрану PDMS на новый стерильный лист, как в шаге 3.4.1.
   6. Повторно нанесите эластомерный герметик (шаги 3.4.3–3.4.4) и установите новую защитную крышку на 3D-принтере (шаг 3.4.5).
   7. Дайте заново запечатанной конструкции высохнуть на воздухе 5 минут, прежде чем вернуть мышь в домашнюю клетку. Процедура может повторяться в течение нескольких сессий записи в течение нескольких недель.

Результаты

Успешная операция приводит к появлению прозрачного окна над корой с видимой сосудистой системой и минимальными признаками воспаления или инфекции. Эта прозрачность может сохраняться более 21 дня (см. рисунок 1), что позволяет проводить долгосрочные долгосрочные исследования. Прочность имплантата демонстрируется его способностью оставаться стабильным даже на протяжении 21-дневного режима введения хронического кортикостерона — распространённой модели для вызов...

Обсуждение

В этом отчёте подробно описан двухфазный хирургический протокол, сохраняющий твердую опухлину, который обеспечивает надёжный и высокоэффективный метод создания большого, хронического и закрываемого черепного окна у мышей. Значение этой техники выходит за рамки размера окна. Его главное преимущество — возможность одновременного многомасштабного допроса крупномасштабных мозговых сетей на продольных временных масштабах. Объединяя поверхностные μECoG сетки (предоставляющие мезомасштабные дан...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
& микро; ECoG array и mdash; 512-канальный кастомный (2 и раз; 256 каналов)	NeuroNexus	E256-200-30-80	Упаковка: IH256. Два раза по 16; 16 подсеток (каждая размером 3,3 мм и 3,5 мм); 200 и мю; m тональность; 80 μ диаметр электрода m. Поверхностные записи DMN.
Левый микроманипулятор с тремя осями	Мировые прецизионные приборы (WPI)	504926	10 μ m разрешение; цифровой дисплей; используется для позиционирования наголовья/зонда во время операции
3D-печатная защитная крышка	Внутренний (Anycubic Photon Mono 4K)	Н/Д	Индивидуальный дизайн; напечатан из УФ-смолы Anycubic High Clear; Файл STL доступен по адресу https://github.com/RazBalin/ProtectiveDMN_Cap
Ацетон (лабораторного класса)	Сигма-Олдрич	179973	Обезжиривание поверхности черепа и удаление надкостника перед нанесением клея
Адсон Dura Hook 5 мм (Fine Dura)	gSource	gS 25.2570	Используется для отделения костяной пластины от дуры вдоль периметра; изготовлена из тонкой вольфрамовой проволоки или аналогичной
Anycubic High Clear UV смола	Anycubic	STMGCL-102B	Фотополимерная смола, используемая с принтером Anycubic Photon Mono 4K, для защитных крышек, напечатанных на 3D-принтере
Смоляный принтер Anycubic Photon Mono 4K	Anycubic	PHOTON-MONO-4K	Используется для печати защитных крышек окон из Anycubic High Clear Resin
Промывка и смола Anycubic UV Cure Machine 2.0	Anycubic	285-550	Постпечатная стирка и ультрафиолетовое отверждение 3D-печатных конденсаторов
Шарнирный рычаг с магнитным основанием (и временем; 2)	Инструменты Haas	09-0535	Использовался для удержания и микроконтроля; ECoG-подсетки на корковой поверхности во время записи
Искусственная ЦСЖ (aCSF)	Внутренняя подготовка	N/A (внутри компании)	рецепт ЦСФ: 124 мМ NaCl, 3 мМ KCl, 26 мМ NaHCO<суб>3, 2 мМ CaCl<суб>2, 1 мМ MgSO<суб>4, 1,25 мМ KH<суб>2PO<суб>4, 10 мМ D-глюкозы; Насыщение кислородом 95% O2 / 5% CO2 сразу после приготовления. Каталожные номера указаны отдельно.
Тупое микрохирургическое лезвие (круглый скальпель)	Iogen	374769	Используется для соскребания поверхности черепа и удаления крышки
Бупренорфин (Темгезик)	Отдельно	BE-112515	Опиоидный анальгетик; 0,05 мг/кг с.к. до операции
Мыши C57BL/6JRj	Лаборатория Жанвье		Самец или женщина; Минимум 10 недель, вес тела >20 г на момент операции
Хлорид кальция (CaCl2 и middot; 2H2O)	Сигма-Олдрич	C-7902	2 мМ; МВт 147,02; 0,29 г/л. Готовится как Ca & Times; 100 штук. Компонент внутреннего aCSF.
Карпрофен (Римадил)	Zoetis Animal Health	RXRIM-INJ	НПВС анальгетик; 5 мг/кг С.К. до операции
Кортикостерон	Сигма-Олдрич	C2505	Растворённые в питьевой воде для модели хронического стресса / депрессии в течение 21 дня
Ватная палочка	Фишербранд	22-363-157	Служит рукояткой для устройства для прокола твердой дуры на 30 G и для обезжирения поверхности черепа ацетоном
Цианоакрилатный клей и мдаш; Loctite 401	Клеи Henkel	Loctite 401	Тонковязкий цианоакрилат; Используется для грунтовки поверхности черепа, фиксации головы и крышки
Стоматологическая дрель и мдаш; Foredom K.1070	Фордом	K.1070	Гибкий валовой ротационный дрель; используется для краниотомического истончения и сверления пилотных отверстий
Дексаметазон	Dopharma	1DEX004	Кортикостероидные противовоспалительные; 2 мг/кг С.К. до операции
D-глюкоза	Сигма-Олдрич	G-7021	10 мМ; MW 180.20; 1,80 г/л. Приготовлено в виде глюкозы и размножения; 100 штук. Компонент внутреннего aCSF.
Буровое сверлочное сверло из бура 1/007W 1/007W	Hager & Мейзингер	18089	Используется для справочного сайта и краниального окна
Этанол 80% (v/v) - A12t Dilutus	Бернер	13221132	Предоперационное замачивание хирургических инструментов и ламинарного капюшона для стерилизации
Аппарат для эвакуации газа	RWD Life Science	R546W	Отходы анестетика из операционной зоны
Позолоченная опорная головка	DigiKey	310-13-102-41-001000	Имплантирован на левый мозжечок; служит эталонной площадкой/эталоном ECoG
GRANT Ultrasonic Cleaner — Модель 17002A	GRANT Instruments	17002A	ИН: 4064343191654. Ультразвуковая ванна с горячей водой; используется с TICKOPUR TR 3 для очистки приборов
Грелка и mdash; Supertech TMP-5B	Supertech	TMP-5B	Поддерживает температуру тела на уровне 37 градусов; C во время анестезии
Изофлуран	Piramal Healthcare	66794-017-25	Ингаляционный анестетик; Индукция 4%, обслуживание 1,5 и нижняя панель; 2.5%
Kimtech Science, прецизионные салфетки (неволокнистая ткань)	КИМБЕРЛИ КЛАРК	7552	Используется с острым наконечником для сушки остатков ACSF и поддержки присоединения мембраны PDMS к твердой орудии
Стерильный эластомерный герметик Kwik-Cast	Мировые прецизионные приборы (WPI)	KWIK-CAST-S	Модель: KWIK-CAST-S. Биосовместимый силикон; используется для создания съемного уплотнения вокруг мембраны PDMS.
LED УФ-перо для отверждения 405 нм	CureUV	514424-405	Используется для отверждения зубного цемента, активируемого УФ-излучением (Total C-Ram) во время имплантации
Раствор лидокаина-эпинефрина	Орион Фарма	05 10 31	Местный анестетик; Инъекция S.C. под кожу головы
Гептагидрат сульфата магния (MgSO4 и middot; 7Ч<суб>2О)	Сигма-Олдрич	M-7774	1 мМ; МВт 246,48; 0,25 г/л. Готовится в мг и раз; 100 штук. Компонент внутреннего aCSF.
Металлическая панель и mdash; Нейротар Модель 13	Нейротар	Модель 13	Титановая головная пластина; диаметром круглого отверстия 11 мм; прикреплён к черепу цианоакрилатом и зубным цементом.
NeuroNexus headstage адаптер :)	NeuroNexus	Кастомный IH256 64 раза; 4 Molex	Кастомная адаптерная плата; сэндвичи каждый и микро; ECoG подсетка между двумя головными панелями Intan RHD 128 каналов
Зонд Neuropixels 1.0 с металлической крышкой (и раз; 2)	IMEC	PRB_1_4_0480_1_C	960 площадок для записи; 10 мм шанк. Один зонд нацелен на гиппокампально-таламовно-зрительную колонну, другой — на колонну mPFC
Шасси NI PXIe-1083	Национальные инструменты	PXIe-1083	9-слотный корпус PXI Express, содержащий модуль Neuropixels и NI DAQ-карты
Многофункциональный модуль ввода-вывода NI PXIe-3839	Национальные инструменты	PXIe-3839	Установлен на шасси NI PXIe-1083; используется для синхронизации и вспомогательного ввода/вывода
Многофункциональный DAQ NI PXIe-6363	Национальные инструменты	PXIe-6363	Установлен на шасси NI PXIe-1083; аналоговый и цифровой ввод-вывод для синхронизации
Nova Microcinerator -  Инфракрасный стерилизатор	Argos Tech	S3022	Используется для быстрой стерилизации любого инструмента, который может касаться открытых тканей мозга
Стереобинокулярный микроскоп Olympus SZ51	Олимп	SZ51	Хирургическая визуализация; Используется на этапах краниотомии и имплантации
Open Ephys Acquisition Board (One Box, первое поколение)	Open Ephys	OEPS-9029	Принимает и микро; Потоки данных ECoG через SPI; Аппаратное обеспечение с открытым исходным кодом. См. open-ephys.org
Открытый графический интерфейс Ephys	Open Ephys	N/A (с открытым исходным кодом)	Бесплатное, открытое программное обеспечение для получения электрофизиологии. Доступно по адресу: open-ephys.org
Хлорид калия (KCl)	Сигма-Олдрич	P-5405	3 мМ; MW 74,55; 0,22 г/л. Компонент внутреннего aCSF.
Дигидрофосфат калия (KH2PO4)	Сигма-Олдрич	P-5655	1,25 мМ; MW 136.09; 0,17 г/л. Компонент собственного aCSF (Klebs & times; 10 запасов).
Раствор повидона-йода (БЕТАДИН)	Такеда	45 70 28	Местное дезинфекторное средство для подготовки хирургического поля
Модуль приобретения PXIe	Нейропиксели	PXIE_1000	PXI-форматный модуль для сбора данных Neuropixels 1.0; установлен на шасси NI PXIe-1083
Эталонный разъём соёма	DigiKey	342-10-102-00-591000	Соответствующий соединительный разъём для опорного гнезда выше; Подтвердите номер детали с помощью DigiKey
Правый 128-канальный headstage (и времена; 4)	Intan Technologies	RHD 128	Два headstage на каждый и микро: подсетка ECoG; Подтверждение модели (например, RHD2132 или RHD2164)
Правый интерфейсный кабель SPI, 0,9 м	Intan Technologies / Open Ephys	C3203	Стандартный кабель SPI, соединяющий RHD головные сцены с приёмной коробкой Open Ephys
Передний воздушный насос	RWD Life Science	R510-29	Обеспечивает поток воздуха через анестезиологический контур
Задний привод для анестезии для животных	RWD Life Science	R5835	Прецизионный испаритель изофлурана для индукции и поддержания анестезии
Лезвие скальпеля #11	Свонн Мортон	SM0103	Используется для гравировки крестообразного узора на поверхности черепа с целью улучшения клеивого захвата
Триммер для мелких животных для волос — GT416	Aesculap Schermaschinen GmbH	D-98528H	Используется для стрижки кожи головы животного перед операцией
Бикарбонат натрия (NaHCO3)	Сигма-Олдрич	S-5761	26 мМ; MW 84.01; 2,18 г/л. Компонент внутреннего aCSF.
Хлорид натрия (NaCl)	Сигма-Олдрич	S-5886	124 мМ; MW 58,44; 7,25 г/л. Компонент внутреннего aCSF.
SOL-M (стерильная шподермическая игла 30 G)	Солнечно-тысячелетняя Европа	113005	Изгиб на 90°; на кончике и прикрепляется к ватной палочке, чтобы создать устройство для прокола дуровой орудии
Стандартная манипуляторная рука, трёхосевой ЛЕВЫЙ (Штёльтинг)	Stoelting Co.	51604	Используется для вставки зонда Neuropixels во время сессий записи
Стандартный манипулятор, трёхосевой ПРАВЫЙ (Столтинг)	Stoelting Co.	51606	Используется для вставки зонда Neuropixels во время сессий записи
Стереотактический кадр и mdash; RWD F67001	RWD Life Science	F67001	Стандартная стереотаксическая рамка; используется для стабилизации головки и установки имплантов с координатами
Перо для кожи с хирургическим маркером и линейкой (Violet Ink)	Фаннин	SM0372	Биосовместимый хирургический кожный маркер на основе горечавки и фиолетовой кожи, используемый для определения планируемой краниотомии и имплантного следа на кости. Устойчив к цианоакрилатному праймингу (Loctite 401) и остаётся видимым благодаря обезжириванию черепа и фиксации головы, что позволяет надёжно передавать стереотактические координаты на поверхность кости.
Набор силиконового эластомера SYLGARD 184 (PDMS)	Dow (Германия)	1673921	Полидиметилсилоксан; Отлитой в тонкий (< 1 мм) мембран; Помещается на дюральную поверхность для защиты мозга
Ферментативное моющее средство тергазим	Alconox	1304-1	Очиститель на основе протеаз, используемый в температуре 1% (w/v) в тёплой воде обратного осмоса для послесессионной очистки электродов (45 минут замачивания, затем тройное промывкание в очищенной воде).
Total C-Ram Automix UV Dental Cement (белый)	Итена	R301950	Модель: TTCRAM-BLC. зубную смолу, которую УФ-отрабатывает; используется для усиления головки и фиксации головок
Ультразвуковое чистящее средство (TICKOPUR TR 3)	Dr. H. Stamm GmbH	TR-3-913	Концентрат на основе лимонной кислоты; Используется в ультразвуковых ваннах для послеоперационной чистки инструментов
Глазной гель Viscotears 2 мг/г	Alcon	503849	мазь для глаз на основе карбомера; Применение на роговицу во время анестезии для предотвращения высыхания
Zeiss Cold Light Source KL1500 LCD	Карл Цейсс	KL1500 LCD	Волоконно-оптическое холодное освещение для хирургического поля; Предотвращает термические повреждения