Пространственная транскриптомика раннего морфогенеза зубов в эмбриональной ткани мышей, закреплённой с парафином,

Summary

Текущий протокол описывает использование формалин-фиксированных, вложенных в парафин срезов из краниофациальных областей E13.5 и E15.5 эмбрионов мышей для анализа дифференциальных профилей экспрессии генов с помощью пространственной транскриптомики.

Abstract

Развивающийся зуб состоит из разнообразных и высокоспециализированных популяций клеток, которые работают вместе для поддержания правильной формы и функции. Прояснение взаимодействий между этими клетками и окружающей их микросредой критически важно для понимания регуляторных механизмов, лежащих в основе нормального развития зубов. Нарушения этих процессов могут привести к врождённым заболеваниям, таким как агенезия зубов, несовершенный дентиногенез и несовершенный амелогенез. Несмотря на значительный прогресс, достигнутый с помощью секвенирования одноклеточной РНК (scRNA-seq) в выявлении клеточной гетерогенности, оно не сохраняет пространственный контекст клеток внутри тканей, ограничивая возможность связывать экспрессию генов с архитектурой ткани. Пространственные транскриптомические технологии решают это ограничение, интегрируя высокоразрешающее профилирование экспрессии генов с сохранением нативной тканевой архитектуры, что позволяет локально локализовать молекулярные сигнатуры. Здесь мы описываем пошаговый протокол сбора, фиксации и вложения парафина эмбриональной черепно-лицевой ткани мышей, подходящий для дальнейших пространственных транскриптомических приложений. Рабочий процесс описывает оптимизацию сечения и обработки формалин-фиксированной, парафин-вложенной ткани для сохранения целостности РНК и морфологии тканей для высокоразрешающего пространственного анализа. Этот метод совместим с платформами секвенирования и пространственной транскриптомики на основе изображений, что позволяет воспроизводимо пространственное транскриптомическое профилирование раннего морфогенеза зубов у эмбрионов мышей. Этот подход даёт глубокое понимание пространственной организации и функциональной динамики краниофациальных структур как в состоянии развития, так и в патологических состояниях, предоставляя критическую основу для связи молекулярных механизмов с морфологией тканей.

Introduction

Развитие зубов зависит от высоко координированной последовательности морфогенетических процессов в раннем эмбриональном^росте 1,2,3,4. Хотя множество ключевых генов и сигнальных путей было выявлено в ходе генетических и развивающихся исследований, наше понимание того, как эти факторы взаимодействуют с формированием отдельных краниофациальных структур, остаётся ограниченным. Примечательно, что даже при значительном прогрессе в связи специфических генетических вариантов с синдромными и несиндромными заболеваниями зубов, детальные молекулярные механизмы, лежащие в основе структуроспецифического морфогенеза, до сих пор не полностью^{определены} 1,2,3,4. Этот пробел в знаниях продолжает ограничивать прогресс целенаправленных терапевтических стратегий при агенезии зубов или других аберрациях зуба.

Секвенирование мРНК в одной клеточке (scRNA-seq) позволило открыть ранее неизвестные типы клеток как в здоровых, так и в больных тканях, а также выявить несколько подтипов клеток на основе различных профилей экспрессии генов. Однако, поскольку scRNA-seq требует диссоциации тканей на отдельные клетки, информация о первоначальном пространственном положении каждой клетки внутри ткани теряется. В результате эти наборы данных не отражают, как клетки расположены относительно архитектуры ^{тканей 5,6,7}. Кроме того, предсказанные взаимодействия между клетками зависят от наличия комплементарных взаимодействий транскриптов, но не учитывают фактическую пространственную информацию, что важно для определения, происходят ли такие взаимодействия in ^{vivo 5,6,7.}

Технология пространственной транскриптомики обеспечивает высокопроизводительное профилирование экспрессии генов, сохраняя пространственную информацию в срезах^{ткани 8,9}. Технологии пространственной транскриптомики либо основаны на^{визуализации 10, 11, 12}, либо на основе^{секвенирования 12, 13}. Подходы пространственной транскриптомики, основанные на визуализации, используют FISH для обнаружения и измерения целевой экспрессии генов с клеточной или субклеточной пространственной точностью. В отличие от этого, технологии на основе секвенирования фиксируют экспрессию генов по всему транскриптому с более низким пространственным разрешением. Пространственная транскриптомика на основе секвенирования использует стратегию достижения почти одного клеточного разрешения с покрытием всего транскриптома (~20 000 генов), поддерживая беспристрастный исследовательский анализ, тогда как пространственная транскриптомика на основе изображений нацелена на панели генов (до ~5 000 генов), позволяя точный гипотезный анализ специфических путей и клеточных^{взаимодействий 14}.

Технологические достижения в пространственной транскриптомике теперь позволяют анализировать экспрессию генов в архитектуре сохранённых тканей. Рабочие процессы на основе формалино-фиксированного парафина (FFPE) и криосечения предлагают дополняющие подходы для пространственной^{транскриптомики 15,16,17}. FFPE обеспечивает превосходное сохранение архитектуры тканей, позволяя точно пространственно картировать экспрессию генов в структурно сложных тканях, таких как развивающиеся зубы и палататальные полки. В нашем и других исследованиях фиксация и архивирование FFPE дали высокоточные и воспроизводимые пространственные транскриптомические^{данные 18}. Рабочие процессы криосекции сохраняют целостность РНК, но более подвержены искажениям^{тканей 18}. Поэтому для этого исследования был выбран FFPE. Хотя успех scRNA-seq во многом зависит от сохранения высокой целостности РНК, пространственная транскриптомика также требует высококачественной морфологии тканей для точной локализации сигналов экспрессии генов по определённым гистологическим признакам.

Этот протокол лучше всего подходит для эмбриональных черепно-лицевых тканей мышей FFPE, охватывающих ранние стадии развития, где сохранение тонкой тканевой архитектуры критически важно для пространственного транскриптомного анализа. Рабочий процесс, скорее всего, будет работать неоптимально в перефиксированных образцах, плохо ориентированных парафиновых блоках или тканях с нарушенной целостностью РНК, что может привести к снижению качества сигнала и потере пространственного разрешения. Успешное применение этого метода подтверждается целостной морфологией тканей, минимальным искажением сечений и устойчивыми, пространственно разрешёнными транскриптомическими сигналами, совпадающими с гистологическими особенностями.

Protocol

Все процедуры на животных были одобрены Национальным институтом здоровья, Комитетом по уходу и использованию животных Национального института здоровья детей и развития человека (ACUC) в соответствии с Протоколом исследования животных #21-031.

1. Подготовка экспериментальных животных и сбор тканей

1. Спарите здорового, плодовитого самца и самки мышечного мышца для спаривания по времени. Определите беременных самок мышей по наличию вагинальной пробки, обозначенной как эмбриональный день (E) 0,5.
2. Эвтаназия беременных самок мышей с помощью вдыхания CO₂, а затем вывиха шейки матки. Разместите спину животного на стерильную впитывающую хирургическую поверхность и продезинфицируйте область живота 70% этанола вдоль предполагаемого места разреза.
3. Сделайте разрез по средней линии живота стерильными хирургическими ножницами и аккуратно откройте брюшную стенку микрохирургическими ножницами, чтобы обнажить рога матки. Аккуратно выделите маточную цепь с помощью тупых щипцов. Изолировать эмбрионы, выделяя ткань матки вдоль миометрия и разрезая в области яйцевода и срединного рога матки.
4. Немедленно переместите целые эмбрионы в ледяной стерильный 1x PBS в чашке Петри диаметром 10 см.
5. Аккуратно отдельте каждый эмбрион от окружающей матки, амниотической и хорионной оболочек и переместите его в свежую чашу диаметром 10 см с ледяной стерильной 1x PBS.
6. Вскрыть эмбриональные головки на нужных стадиях развития стерильным хирургическим лезвием и промыть их один раз в ледяной температуре, 1x PBS, перед дальнейшей обработкой.

2. Фиксация и обработка ткани

1. Вскрыть эмбриональные мышиные головы на нужных стадиях развития и закрепить в 10% нейтральном буферном формалине на ночь при комнатной температуре на шейкере.
2. После фиксации удалите формалин и прополосните образцы 1x PBS перед передачей на 70% этанол для хранения. Проведите обезвоживание, очистку тканей и инфильтрацию парафина с помощью автоматизированного процессора тканей.
3. Встраивайте головы эмбрионов в парафин с ориентацией либо в корональной, либо сагиттальной плоскости.
4. После затвердевания воска удалите парафиновые блоки из форм, поместите их в герметичные контейнеры или пакеты с зип-локом и храните при 4 °C до разрезания на секционы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Блоки FFPE можно хранить несколько лет перед сечением без ущерба целостности тканей.

3. Обработка ткани FFPE для пространственной транскриптомики

1. Дезинфицируйте рабочие поверхности и инструменты 70% этанолом, затем обработайте раствором дезинфекции РНКазы для минимизации деградации РНК.
2. Подготовьте водную ванну с деионизированной водой и поддерживайте её при 40 °C, регулируя температуру от 40 °C до 43 °C в зависимости от эмбриональной стадии или характеристик ткани.
3. Установите микротом, установите новое лезвие после аккуратного протирания раствором деконтаминации РНазы, закрепите лезвие и установите угол зазора на 10°.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что новое лезвие используется для сечения с целью получения точных срезов ткани. Изменение угла лопасти микротома может существенно повлиять на качество сечения, влияя на целостность ткани, однородность толщины и сохранение морфологических особенностей.
4. Уберите избыточный парафин вокруг встроенной ткани и закрепите блок FFPE на холодной стадии микротома.
5. Подготовьте и обработайте чистые пинцеты и щётки раствором для дезинфекции РНазы перед использованием.
6. Выровняйте лицо парафинового блока с лезвием микротома и сделайте обрезанные разрезы примерно 12 мкм до приближения интересующей области (например, пока мезиальная часть моляров не станет видна в коронных срезах). Регулируйте положение блока и лопастей по мере необходимости, чтобы обеспечить симметричные, правильно ориентированные корональные секции всей головы.
7. Если планируется выделение РНК срезов ткани, напрямую собирайте срезы 10 мкм в микроцентрифугальные пробирки объёмом 1 мл и обрабатывайте их согласно рекомендациям^{производителя 19,20} для оценки качества DV200.
8. Вырезать серийные срезы толщиной 5 мкм и постоянно отслеживать близость к интересующей зоне, изучая тестовые срезы на обычном стекле под микроскопом.
9. Приблизившись к интересующей области, аккуратно нарежьте ткань с помощью скальпеля No11, не разрезая полностью, в двух стратегически расположенных областях, чтобы предотвратить сгибание или прилипывание срезов. После сечения удалите прикреплённый парафин щетинкой мелкой щётки.
10. Перенесите срезы тканей на водяную баню при 41 °C, чтобы можно было нежно расслабиться и расплющить, прежде чем поднимать их на горке.

4. Пространственная транскриптомика на основе секвенирования

1. Соберите тканевые срезы на рекомендованных стеклянных стеклянных стеклах, убедившись, что все интересующие области находятся в пределах площади 6,5 × 6,5 мм. Когда на одном затворе размещают несколько соседних секций, кратковременно нагрейте стекли на подогревателе при 40 °C, чтобы улучшить адгезию и предотвратить отслоение ранее установленных секций. После того как все секции будут размещены, инкубировать их в закрытом подогревателе при 60 °C в течение 2 часов для улучшения прилипления тканей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Участки, выходящие за пределы площади 6,5 × 6,5 мм, не были обработаны.
2. После инкубации проведите окрашивания гематоксилином и эозином (H&E) по стандартному протоколу окрашивания H&E, заменяя деионизированную воду водопроводной водой для сохранения целостности РНК.
3. Монтировать покрытия с использованием 80% глицерина и получать высокоразрешённые изображения H&E, обеспечивая более качественное эталонное изображение, заменяющее типичное изображение H&E, созданное системой слайдовой визуализации и переноса тканей.
4. После визуализации удалите накладки, погрузив их по отдельности в трубки объёмом 50 мл с деионизированной водой, и подготовьте их к отправке в основной установке для последующего обработки.

5. Пространственная транскриптомика на основе изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Производитель поставил²⁰ слайдов, каждое содержало выделенную область для изображения (контурные линии) размером 12 мм × 24 мм, с доступной областью размещения образца примерно 235 мм² (10,45 мм × 22,45 мм).

1. Разместить тканевые срезы полностью в этой определённой области, чтобы срезы, включая остатки парафина, не перекрывались. При размещении нескольких соседних секций кратковременно нагрейте стекли на подогревателе при 40 °C, чтобы улучшить сцепление и предотвратить отслоение ранее установленных секций.
2. После того как все срезы тканей будут размещены, поместите их в крытый подогреватель и инкубуйте на ночь при 40 °C для правильного прилипления.
3. После инкубации следуйте протоколу¹⁹ производителей, чтобы обработать слайды и загрузить их в машину для секвенирования РНК, при этом протокол сверяется с самой последней версией, так как процедурные детали периодически обновляются.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все опасные материалы, образующиеся в ходе протокола, такие как формалин, этанол и растворы для дезинфекции РНаз, должны быть утилизированы в соответствии с институциональной политикой безопасности и местными нормами, используя соответствующие контейнеры для химических отходов, методы утилизации биологических опасностей и практику использования выхлопных вытяжных газов.

Results

Этот метод описывает обработку свежепрепарированных эмбриональных головок мышей для получения образцов FFPE краниофациальных тканей, включая развивающийся зуб, которые можно легко разрезать микротомом при сохранении целостности РНК (см. рисунок 1). Этот протокол был успешно применён к головам мышиных эмбрионов E13.5 (эмбриональный день 13.5), E15.5 и E16.5 для черепно-лицевых областей с изображением высокого разрешения (рисунок 2

Discussion

В этой работе мы представляем подробный протокол подготовки FFPE-блоков эмбриональных головок мышей, оптимизированных для использования с высококачественными платформами пространственной РНК-визуализации, включая пространственную транскриптомику на основе секвенирования и визуализации. Ключевая цель этого протокола — сохранить как морфологию тканей, так и целостность нуклеиновых кислот в целых срезах головы, с особым вниманием к развивающейся краниофациальной области. Обеспечение такого ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Термо Фишер	10010023	Use  для проведения промывки во время рабочего процесса
50 мл конических трубок (Ambion) без РНК	Термо Фишер	AM12502	Используйте для хранения образцов в различных растворах
Продвинутый орбитальный шейкер	VWR	6683-470	Используйте для встряхивания тканей в фиксационном растворе во время инкубации
Алкоголь — 70%, Fisherbrand, HistoPrep	Fisher Scientific	HC-1000-1GL	Используйте для очистки и дезинфекции всего рабочего пространства
Автоматизированный процессор вакуумных тканей	Leica Biosystems	ASP300S	Используйте для очистки обезвоживания, регидратации и инфильтрации образцов воском
Толщина стекла крышки 1,5, 25 мм x 25 мм	Корнинг	2850-25	Использование для монтажа затвора в рабочем процессе Visium HD
Dako Bluing Buffer, готовый к использованию	Agilant Technologies	CS70230-2	Использование для H& E-окрашивание
Эозин-Y с флоксином	Fisher Scientific	22050198	Использование для H& E-окрашивание
Гематоксилин, Mayer's, готовый к использованию водный раствор	Agilant Technologies	S330930-2	Использование для H& E-окрашивание
Водяная ванна HistoCore	Leica Biosystems	HIS2326	Используйте для плавания секций под углом 40-43 градуса; C для удаления морщин на срезах FFPE
Loupe browser  9.0.0	10X Genomics, Inc.		Используйте для анализа данных Visium HD
Одноразовые лопасти низкого профиля DB80LX	Leica Biosystems	14035843496	Используйте разделение FFPE-блоков и bbsp;
Нейтральный буферизованный формалин 10%	Azer Scientific	NBF-4-G	Используйте для фиксации тканей
Раствор для дезактивации RNaseZap RNaseZap	Термо Фишер	AM9782	Используйте для очистки и удаления РНазы
Полуавтоматический вращательный микротом	Leica Biosystems	RM2245	Используйте разделение блоков FFPE, как указано в руководстве.
Подогреватель с крышкой	Премьера	XH2004	Использование для инкубации затворов при разных температурах
Слайды Superfrost Plus	Fisher Scientific	12-550-15	Используйте для прикрепления секций для Vsium HD
Хирургическое лезвие No 11	Integra Miltex	4-311	Применение для оценки тканей FFPE
Парапласт Surgipath	Leica Biosystems	39601006	Используется для проведения инфильтрации тканей и вложения тканей
TISsue DISH 100X20MM 500/CS	Fisher Scientific	877222	Использование для сбора и вскрытия образцов в 1x PBS
UltraPure Glycerol	Термо Фишер	15514011	Использование для крепления стекла на слайд Visium HD перед CytAssist
Visium CytAssist	10X Genomics, Inc.	PN-1000442	Использование для экспериментов с рабочими процессами Visium HD
Пространственное РНК-секвенирование Visium HD	10X Genomics, Inc.	1000676	Использование для проведения пространственных транскриптомических экспериментов
Локализация РНК Xenium 5K in situ	10X Genomics, Inc.	PN-1000724	Использование для проведения пространственных транскриптомических экспериментов
Анализатор ксения	10X Genomics, Inc.	PN-1000481	Используйте Xenium и Xenium 5K РНК-визуализацию
Xenium Explorer 4	10X Genomics, Inc.		Используйте для анализа данных по ксению
Локализация РНК ксения in situ	10X Genomics, Inc.	1000672	Использование для проведения пространственных транскриптомических экспериментов