Method Article

Пространственная транскриптомика раннего морфогенеза зубов в эмбриональной ткани мышей, закреплённой с парафином,

DOI:

10.3791/70340

⸱

March 13th, 2026

 , 
1Section on Craniofacial Genetic Disorders, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institutes of Health (NIH), 2Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, 3Department of Surgery, Harvard Medical School, 4Shriners Hospital for Children

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Текущий протокол описывает использование формалин-фиксированных, вложенных в парафин срезов из краниофациальных областей E13.5 и E15.5 эмбрионов мышей для анализа дифференциальных профилей экспрессии генов с помощью пространственной транскриптомики.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Развивающийся зуб состоит из разнообразных и высокоспециализированных популяций клеток, которые работают вместе для поддержания правильной формы и функции. Прояснение взаимодействий между этими клетками и окружающей их микросредой критически важно для понимания регуляторных механизмов, лежащих в основе нормального развития зубов. Нарушения этих процессов могут привести к врождённым заболеваниям, таким как агенезия зубов, несовершенный дентиногенез и несовершенный амелогенез. Несмотря на значительный прогресс, достигнутый с помощью секвенирования одноклеточной РНК (scRNA-seq) в выявлении клеточной гетерогенности, оно не сохраняет пространственный контекст клеток внутри тканей, ограничивая возможность связывать экспрессию генов с архитектурой ткани. Пространственные транскриптомические технологии решают это ограничение, интегрируя высокоразрешающее профилирование экспрессии генов с сохранением нативной тканевой архитектуры, что позволяет локально локализовать молекулярные сигнатуры. Здесь мы описываем пошаговый протокол сбора, фиксации и вложения парафина эмбриональной черепно-лицевой ткани мышей, подходящий для дальнейших пространственных транскриптомических приложений. Рабочий процесс описывает оптимизацию сечения и обработки формалин-фиксированной, парафин-вложенной ткани для сохранения целостности РНК и морфологии тканей для высокоразрешающего пространственного анализа. Этот метод совместим с платформами секвенирования и пространственной транскриптомики на основе изображений, что позволяет воспроизводимо пространственное транскриптомическое профилирование раннего морфогенеза зубов у эмбрионов мышей. Этот подход даёт глубокое понимание пространственной организации и функциональной динамики краниофациальных структур как в состоянии развития, так и в патологических состояниях, предоставляя критическую основу для связи молекулярных механизмов с морфологией тканей.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Развитие зубов зависит от высоко координированной последовательности морфогенетических процессов в раннем эмбриональномросте 1,2,3,4. Хотя множество ключевых генов и сигнальных путей было выявлено в ходе генетических и развивающихся исследований, наше понимание того, как эти факторы взаимодействуют с формированием отдельных краниофациальных структур, остаётся ограниченным. Примечательно, что даже при значительном прогрессе в связи специфических генетических вариантов с синдромными и несиндромными заболевания....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры на животных были одобрены Национальным институтом здоровья, Комитетом по уходу и использованию животных Национального института здоровья детей и развития человека (ACUC) в соответствии с Протоколом исследования животных #21-031.

1. Подготовка экспериментальных животных и сбор тканей

  1. Спарите здорового, плодовитого самца и самки мышечного мышца для спаривания по времени. Определите беременных самок мышей по наличию вагинальной пробки, обозначенной как эмбриональный день (E) 0,5.
  2. Эвтаназия беременных самок мышей с помощью вдыхания CO₂, а затем вывих....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот метод описывает обработку свежепрепарированных эмбриональных головок мышей для получения образцов FFPE краниофациальных тканей, включая развивающийся зуб, которые можно легко разрезать микротомом при сохранении целостности РНК (см. рисунок 1). Этот протокол был успешно применён к головам мышиных эмбрионов E13.5 (эмбриональный день 13.5), E15.5 и E16.5 для черепно-лицевых областей с изображением высокого разрешения (рисунок 2

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой работе мы представляем подробный протокол подготовки FFPE-блоков эмбриональных головок мышей, оптимизированных для использования с высококачественными платформами пространственной РНК-визуализации, включая пространственную транскриптомику на основе секвенирования и визуализации. Ключевая цель этого протокола — сохранить как морфологию тканей, так и целостность нуклеиновых кислот в целых срезах головы, с особым вниманием к развивающейся краниофациальной области. Обеспечение такого .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликтов интересов, которые нужно раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы искренне благодарим доктора Сергея Л. Лейкина, доктора Елену Макарееву (Секция физической биохимии, NICHD/NIH) и доктора Джереми Оливера Пинью (Секция молекулярной биологии костей и зубов, NIDCR/NIH) за советы по разработке экспериментов и техническую помощь. Мы благодарим доктора Айбена Джеймса, доктора Вивека Махадевана (Molecular Genomics Core, NICHD/NIH) за техническую помощь в проведении пространственной транскриптомики на основе секвенирования. Благодарим доктора Густава Вигерблада (Отдел системной аутоиммунности, Национальный институт артрита и заболеваний опорно-двигательного аппарата и кожи, NIAMS/NIH) за техническую помощ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1x PBSТермо Фишер10010023Use  для проведения промывки во время рабочего процесса
50 мл конических трубок (Ambion) без РНКТермо ФишерAM12502Используйте для хранения образцов в различных растворах
Продвинутый орбитальный шейкерVWR6683-470Используйте для встряхивания тканей в фиксационном растворе во время инкубации
Алкоголь — 70%, Fisherbrand, HistoPrepFisher ScientificHC-1000-1GLИспользуйте для очистки и дезинфекции всего рабочего пространства
Автоматизированный процессор вакуумных тканейLeica BiosystemsASP300SИспользуйте для очистки обезвоживания, регидратации и инфильтрации образцов воском
Толщина стекла крышки 1,5, 25 мм x 25 мм Корнинг2850-25Использование для монтажа затвора в рабочем процессе Visium HD
Dako Bluing Buffer, готовый к использованиюAgilant TechnologiesCS70230-2Использование для H& E-окрашивание
Эозин-Y с флоксиномFisher Scientific22050198Использование для H& E-окрашивание
Гематоксилин, Mayer's, готовый к использованию водный растворAgilant TechnologiesS330930-2Использование для H& E-окрашивание
Водяная ванна HistoCore Leica BiosystemsHIS2326Используйте для плавания секций под углом 40-43 градуса; C для удаления морщин на срезах FFPE 
Loupe browser  9.0.010X Genomics, Inc. Используйте для анализа данных Visium HD 
Одноразовые лопасти низкого профиля DB80LXLeica Biosystems14035843496Используйте разделение FFPE-блоков и bbsp;
Нейтральный буферизованный формалин 10%Azer ScientificNBF-4-GИспользуйте для фиксации тканей
Раствор для дезактивации RNaseZap RNaseZapТермо ФишерAM9782Используйте для очистки и удаления РНазы
Полуавтоматический вращательный микротомLeica BiosystemsRM2245Используйте разделение блоков FFPE, как указано в руководстве.
Подогреватель с крышкойПремьера XH2004Использование для инкубации затворов при разных температурах
Слайды Superfrost Plus Fisher Scientific12-550-15 Используйте для прикрепления секций для Vsium HD
Хирургическое лезвие No 11Integra Miltex4-311Применение для оценки тканей FFPE
Парапласт SurgipathLeica Biosystems39601006Используется для проведения инфильтрации тканей и вложения тканей
TISsue DISH 100X20MM 500/CSFisher Scientific877222Использование для сбора и вскрытия образцов в 1x PBS
UltraPure GlycerolТермо Фишер15514011Использование для крепления стекла на слайд Visium HD перед CytAssist
Visium CytAssist10X Genomics, Inc. PN-1000442Использование для экспериментов с рабочими процессами Visium HD
Пространственное РНК-секвенирование Visium HD10X Genomics, Inc. 1000676Использование для проведения пространственных транскриптомических экспериментов
Локализация РНК Xenium 5K in situ 10X Genomics, Inc. PN-1000724Использование для проведения пространственных транскриптомических экспериментов
Анализатор ксения10X Genomics, Inc. PN-1000481Используйте Xenium и Xenium 5K РНК-визуализацию  
Xenium Explorer 410X Genomics, Inc. Используйте для анализа данных по ксению 
Локализация РНК ксения in situ10X Genomics, Inc. 1000672Использование для проведения пространственных транскриптомических экспериментов

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thesleff, I. From understanding tooth development to bioengineering of teeth. Eur J Oral Sci. 126 (1), 67-71 (2018).
  2. Bei, M. Molecular genetics of tooth development. Curr Opin Genet Dev. 19 (5), 504-510 (2009).
  3. Roth, D. M., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Spatial TranscriptomicsTooth MorphogenesisMouse Embryonic TissueFormalin Fixed TissueParaffin EmbeddingCraniofacial DevelopmentRNA IntegrityTissue MorphologyGene Expression ProfilingSingle Cell RNA Sequencing

Related Articles