Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Пространственная транскриптомика раннего морфогенеза зубов в эмбриональной ткани мышей, закреплённой с парафином,

341 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70340

⸱

13 марта 2026 г.

 , 
1Section on Craniofacial Genetic Disorders, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institutes of Health (NIH), 2Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, 3Department of Surgery, Harvard Medical School, 4Shriners Hospital for Children

В этой статье

Краткое содержание

Текущий протокол описывает использование формалин-фиксированных, вложенных в парафин срезов из краниофациальных областей E13.5 и E15.5 эмбрионов мышей для анализа дифференциальных профилей экспрессии генов с помощью пространственной транскриптомики.

Аннотация

Развивающийся зуб состоит из разнообразных и высокоспециализированных популяций клеток, которые работают вместе для поддержания правильной формы и функции. Прояснение взаимодействий между этими клетками и окружающей их микросредой критически важно для понимания регуляторных механизмов, лежащих в основе нормального развития зубов. Нарушения этих процессов могут привести к врождённым заболеваниям, таким как агенезия зубов, несовершенный дентиногенез и несовершенный амелогенез. Несмотря на значительный прогресс, достигнутый с помощью секвенирования одноклеточной РНК (scRNA-seq) в выявлении клеточной гетерогенности, оно не сохраняет пространственный контекст клеток внутри тканей, ограничивая возможность связывать экспрессию генов с архитектурой ткани. Пространственные транскриптомические технологии решают это ограничение, интегрируя высокоразрешающее профилирование экспрессии генов с сохранением нативной тканевой архитектуры, что позволяет локально локализовать молекулярные сигнатуры. Здесь мы описываем пошаговый протокол сбора, фиксации и вложения парафина эмбриональной черепно-лицевой ткани мышей, подходящий для дальнейших пространственных транскриптомических приложений. Рабочий процесс описывает оптимизацию сечения и обработки формалин-фиксированной, парафин-вложенной ткани для сохранения целостности РНК и морфологии тканей для высокоразрешающего пространственного анализа. Этот метод совместим с платформами секвенирования и пространственной транскриптомики на основе изображений, что позволяет воспроизводимо пространственное транскриптомическое профилирование раннего морфогенеза зубов у эмбрионов мышей. Этот подход даёт глубокое понимание пространственной организации и функциональной динамики краниофациальных структур как в состоянии развития, так и в патологических состояниях, предоставляя критическую основу для связи молекулярных механизмов с морфологией тканей.

Введение

Развитие зубов зависит от высоко координированной последовательности морфогенетических процессов в раннем эмбриональномросте 1,2,3,4. Хотя множество ключевых генов и сигнальных путей было выявлено в ходе генетических и развивающихся исследований, наше понимание того, как эти факторы взаимодействуют с формированием отдельных краниофациальных структур, остаётся ограниченным. Примечательно, что даже при значительном прогрессе в связи специфических генетических вариантов с синдромными и несиндромными заболеваниями зубов, детальные молекулярные механизмы, лежащие в основе структуроспецифического морфогенеза, до сих пор не полностьюопределены 1,2,3,4. Этот пробел в знаниях продолжает ограничивать прогресс целенаправленных терапевтических стратегий при агенезии зубов или других аберрациях зуба.

Секвенирование мРНК в одной клеточке (scRNA-seq) позволило открыть ранее неизвестные типы клеток как в здоровых, так и в больных тканях, а также выявить несколько подтипов клеток на основе различных профилей экспрессии генов. Однако, поскольку scRNA-seq требует диссоциации тканей на отдельные клетки, информация о первоначальном пространственном положении каждой клетки внутри ткани теряется. В результате эти наборы данных не отражают, как клетки расположены относительно архитектуры тканей 5,6,7. Кроме того, предсказанные взаимодействия между клетками зависят от наличия комплементарных взаимодействий транскриптов, но не учитывают фактическую пространственную информацию, что важно для определения, происходят ли такие взаимодействия in vivo 5,6,7.

Технология пространственной транскриптомики обеспечивает высокопроизводительное профилирование экспрессии генов, сохраняя пространственную информацию в срезахткани 8,9. Технологии пространственной транскриптомики либо основаны навизуализации 10, 11, 12, либо на основесеквенирования 12, 13. Подходы пространственной транскриптомики, основанные на визуализации, используют FISH для обнаружения и измерения целевой экспрессии генов с клеточной или субклеточной пространственной точностью. В отличие от этого, технологии на основе секвенирования фиксируют экспрессию генов по всему транскриптому с более низким пространственным разрешением. Пространственная транскриптомика на основе секвенирования использует стратегию достижения почти одного клеточного разрешения с покрытием всего транскриптома (~20 000 генов), поддерживая беспристрастный исследовательский анализ, тогда как пространственная транскриптомика на основе изображений нацелена на панели генов (до ~5 000 генов), позволяя точный гипотезный анализ специфических путей и клеточныхвзаимодействий 14.

Технологические достижения в пространственной транскриптомике теперь позволяют анализировать экспрессию генов в архитектуре сохранённых тканей. Рабочие процессы на основе формалино-фиксированного парафина (FFPE) и криосечения предлагают дополняющие подходы для пространственнойтранскриптомики 15,16,17. FFPE обеспечивает превосходное сохранение архитектуры тканей, позволяя точно пространственно картировать экспрессию генов в структурно сложных тканях, таких как развивающиеся зубы и палататальные полки. В нашем и других исследованиях фиксация и архивирование FFPE дали высокоточные и воспроизводимые пространственные транскриптомическиеданные 18. Рабочие процессы криосекции сохраняют целостность РНК, но более подвержены искажениямтканей 18. Поэтому для этого исследования был выбран FFPE. Хотя успех scRNA-seq во многом зависит от сохранения высокой целостности РНК, пространственная транскриптомика также требует высококачественной морфологии тканей для точной локализации сигналов экспрессии генов по определённым гистологическим признакам.

Этот протокол лучше всего подходит для эмбриональных черепно-лицевых тканей мышей FFPE, охватывающих ранние стадии развития, где сохранение тонкой тканевой архитектуры критически важно для пространственного транскриптомного анализа. Рабочий процесс, скорее всего, будет работать неоптимально в перефиксированных образцах, плохо ориентированных парафиновых блоках или тканях с нарушенной целостностью РНК, что может привести к снижению качества сигнала и потере пространственного разрешения. Успешное применение этого метода подтверждается целостной морфологией тканей, минимальным искажением сечений и устойчивыми, пространственно разрешёнными транскриптомическими сигналами, совпадающими с гистологическими особенностями.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры на животных были одобрены Национальным институтом здоровья, Комитетом по уходу и использованию животных Национального института здоровья детей и развития человека (ACUC) в соответствии с Протоколом исследования животных #21-031.

1. Подготовка экспериментальных животных и сбор тканей

  1. Спарите здорового, плодовитого самца и самки мышечного мышца для спаривания по времени. Определите беременных самок мышей по наличию вагинальной пробки, обозначенной как эмбриональный день (E) 0,5.
  2. Эвтаназия беременных самок мышей с помощью вдыхания CO₂, а затем вывиха шейки матки. Разместите спину животного на стерильную впитывающую хирургическую поверхность и продезинфицируйте область живота 70% этанола вдоль предполагаемого места разреза.
  3. Сделайте разрез по средней линии живота стерильными хирургическими ножницами и аккуратно откройте брюшную стенку микрохирургическими ножницами, чтобы обнажить рога матки. Аккуратно выделите маточную цепь с помощью тупых щипцов. Изолировать эмбрионы, выделяя ткань матки вдоль миометрия и разрезая в области яйцевода и срединного рога матки.
  4. Немедленно переместите целые эмбрионы в ледяной стерильный 1x PBS в чашке Петри диаметром 10 см.
  5. Аккуратно отдельте каждый эмбрион от окружающей матки, амниотической и хорионной оболочек и переместите его в свежую чашу диаметром 10 см с ледяной стерильной 1x PBS.
  6. Вскрыть эмбриональные головки на нужных стадиях развития стерильным хирургическим лезвием и промыть их один раз в ледяной температуре, 1x PBS, перед дальнейшей обработкой.

2. Фиксация и обработка ткани

  1. Вскрыть эмбриональные мышиные головы на нужных стадиях развития и закрепить в 10% нейтральном буферном формалине на ночь при комнатной температуре на шейкере.
  2. После фиксации удалите формалин и прополосните образцы 1x PBS перед передачей на 70% этанол для хранения. Проведите обезвоживание, очистку тканей и инфильтрацию парафина с помощью автоматизированного процессора тканей.
  3. Встраивайте головы эмбрионов в парафин с ориентацией либо в корональной, либо сагиттальной плоскости.
  4. После затвердевания воска удалите парафиновые блоки из форм, поместите их в герметичные контейнеры или пакеты с зип-локом и храните при 4 °C до разрезания на секционы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Блоки FFPE можно хранить несколько лет перед сечением без ущерба целостности тканей.

3. Обработка ткани FFPE для пространственной транскриптомики

  1. Дезинфицируйте рабочие поверхности и инструменты 70% этанолом, затем обработайте раствором дезинфекции РНКазы для минимизации деградации РНК.
  2. Подготовьте водную ванну с деионизированной водой и поддерживайте её при 40 °C, регулируя температуру от 40 °C до 43 °C в зависимости от эмбриональной стадии или характеристик ткани.
  3. Установите микротом, установите новое лезвие после аккуратного протирания раствором деконтаминации РНазы, закрепите лезвие и установите угол зазора на 10°.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что новое лезвие используется для сечения с целью получения точных срезов ткани. Изменение угла лопасти микротома может существенно повлиять на качество сечения, влияя на целостность ткани, однородность толщины и сохранение морфологических особенностей.
  4. Уберите избыточный парафин вокруг встроенной ткани и закрепите блок FFPE на холодной стадии микротома.
  5. Подготовьте и обработайте чистые пинцеты и щётки раствором для дезинфекции РНазы перед использованием.
  6. Выровняйте лицо парафинового блока с лезвием микротома и сделайте обрезанные разрезы примерно 12 мкм до приближения интересующей области (например, пока мезиальная часть моляров не станет видна в коронных срезах). Регулируйте положение блока и лопастей по мере необходимости, чтобы обеспечить симметричные, правильно ориентированные корональные секции всей головы.
  7. Если планируется выделение РНК срезов ткани, напрямую собирайте срезы 10 мкм в микроцентрифугальные пробирки объёмом 1 мл и обрабатывайте их согласно рекомендациямпроизводителя 19,20 для оценки качества DV200.
  8. Вырезать серийные срезы толщиной 5 мкм и постоянно отслеживать близость к интересующей зоне, изучая тестовые срезы на обычном стекле под микроскопом.
  9. Приблизившись к интересующей области, аккуратно нарежьте ткань с помощью скальпеля No11, не разрезая полностью, в двух стратегически расположенных областях, чтобы предотвратить сгибание или прилипывание срезов. После сечения удалите прикреплённый парафин щетинкой мелкой щётки.
  10. Перенесите срезы тканей на водяную баню при 41 °C, чтобы можно было нежно расслабиться и расплющить, прежде чем поднимать их на горке.

4. Пространственная транскриптомика на основе секвенирования

  1. Соберите тканевые срезы на рекомендованных стеклянных стеклянных стеклах, убедившись, что все интересующие области находятся в пределах площади 6,5 × 6,5 мм. Когда на одном затворе размещают несколько соседних секций, кратковременно нагрейте стекли на подогревателе при 40 °C, чтобы улучшить адгезию и предотвратить отслоение ранее установленных секций. После того как все секции будут размещены, инкубировать их в закрытом подогревателе при 60 °C в течение 2 часов для улучшения прилипления тканей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Участки, выходящие за пределы площади 6,5 × 6,5 мм, не были обработаны.
  2. После инкубации проведите окрашивания гематоксилином и эозином (H&E) по стандартному протоколу окрашивания H&E, заменяя деионизированную воду водопроводной водой для сохранения целостности РНК.
  3. Монтировать покрытия с использованием 80% глицерина и получать высокоразрешённые изображения H&E, обеспечивая более качественное эталонное изображение, заменяющее типичное изображение H&E, созданное системой слайдовой визуализации и переноса тканей.
  4. После визуализации удалите накладки, погрузив их по отдельности в трубки объёмом 50 мл с деионизированной водой, и подготовьте их к отправке в основной установке для последующего обработки.

5. Пространственная транскриптомика на основе изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Производитель поставил20 слайдов, каждое содержало выделенную область для изображения (контурные линии) размером 12 мм × 24 мм, с доступной областью размещения образца примерно 235 мм² (10,45 мм × 22,45 мм).

  1. Разместить тканевые срезы полностью в этой определённой области, чтобы срезы, включая остатки парафина, не перекрывались. При размещении нескольких соседних секций кратковременно нагрейте стекли на подогревателе при 40 °C, чтобы улучшить сцепление и предотвратить отслоение ранее установленных секций.
  2. После того как все срезы тканей будут размещены, поместите их в крытый подогреватель и инкубуйте на ночь при 40 °C для правильного прилипления.
  3. После инкубации следуйте протоколу19 производителей, чтобы обработать слайды и загрузить их в машину для секвенирования РНК, при этом протокол сверяется с самой последней версией, так как процедурные детали периодически обновляются.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все опасные материалы, образующиеся в ходе протокола, такие как формалин, этанол и растворы для дезинфекции РНаз, должны быть утилизированы в соответствии с институциональной политикой безопасности и местными нормами, используя соответствующие контейнеры для химических отходов, методы утилизации биологических опасностей и практику использования выхлопных вытяжных газов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этот метод описывает обработку свежепрепарированных эмбриональных головок мышей для получения образцов FFPE краниофациальных тканей, включая развивающийся зуб, которые можно легко разрезать микротомом при сохранении целостности РНК (см. рисунок 1). Этот протокол был успешно применён к головам мышиных эмбрионов E13.5 (эмбриональный день 13.5), E15.5 и E16.5 для черепно-лицевых областей с изображением высокого разрешения (рисунок 2

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этой работе мы представляем подробный протокол подготовки FFPE-блоков эмбриональных головок мышей, оптимизированных для использования с высококачественными платформами пространственной РНК-визуализации, включая пространственную транскриптомику на основе секвенирования и визуализации. Ключевая цель этого протокола — сохранить как морфологию тканей, так и целостность нуклеиновых кислот в целых срезах головы, с особым вниманием к развивающейся краниофациальной области. Обеспечение такого ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликтов интересов, которые нужно раскрывать.

Благодарности

Мы искренне благодарим доктора Сергея Л. Лейкина, доктора Елену Макарееву (Секция физической биохимии, NICHD/NIH) и доктора Джереми Оливера Пинью (Секция молекулярной биологии костей и зубов, NIDCR/NIH) за советы по разработке экспериментов и техническую помощь. Мы благодарим доктора Айбена Джеймса, доктора Вивека Махадевана (Molecular Genomics Core, NICHD/NIH) за техническую помощь в проведении пространственной транскриптомики на основе секвенирования. Благодарим доктора Густава Вигерблада (Отдел системной аутоиммунности, Национальный институт артрита и заболеваний опорно-двигательного аппарата и кожи, NIAMS/NIH) за техническую помощь в области пространственной транскриптомики на основе изображений. Мы благодарим доктора Майкла Келли и доктора Джатиндера Сингха (CCR Single Cell Analysis Facility (SCAF), NCI/NIH) за техническую помощь в проведении пространственной транскриптомики на основе изображений. Благодарим сотрудников ветеринарного хозяйства NICHD за помощь в уходе и разведении животных. Рисунок 1 был создан с использованием BioRender.com.

Текущая рукопись поддерживается средствами NIH/NIDCR [грант, 1RO1DE033520] для M.B. Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, решении о публикации или подготовке рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1x PBSТермо Фишер10010023Use  для проведения промывки во время рабочего процесса
50 мл конических трубок (Ambion) без РНКТермо ФишерAM12502Используйте для хранения образцов в различных растворах
Продвинутый орбитальный шейкерVWR6683-470Используйте для встряхивания тканей в фиксационном растворе во время инкубации
Алкоголь — 70%, Fisherbrand, HistoPrepFisher ScientificHC-1000-1GLИспользуйте для очистки и дезинфекции всего рабочего пространства
Автоматизированный процессор вакуумных тканейLeica BiosystemsASP300SИспользуйте для очистки обезвоживания, регидратации и инфильтрации образцов воском
Толщина стекла крышки 1,5, 25 мм x 25 мм Корнинг2850-25Использование для монтажа затвора в рабочем процессе Visium HD
Dako Bluing Buffer, готовый к использованиюAgilant TechnologiesCS70230-2Использование для H& E-окрашивание
Эозин-Y с флоксиномFisher Scientific22050198Использование для H& E-окрашивание
Гематоксилин, Mayer's, готовый к использованию водный растворAgilant TechnologiesS330930-2Использование для H& E-окрашивание
Водяная ванна HistoCore Leica BiosystemsHIS2326Используйте для плавания секций под углом 40-43 градуса; C для удаления морщин на срезах FFPE 
Loupe browser  9.0.010X Genomics, Inc. Используйте для анализа данных Visium HD 
Одноразовые лопасти низкого профиля DB80LXLeica Biosystems14035843496Используйте разделение FFPE-блоков и bbsp;
Нейтральный буферизованный формалин 10%Azer ScientificNBF-4-GИспользуйте для фиксации тканей
Раствор для дезактивации RNaseZap RNaseZapТермо ФишерAM9782Используйте для очистки и удаления РНазы
Полуавтоматический вращательный микротомLeica BiosystemsRM2245Используйте разделение блоков FFPE, как указано в руководстве.
Подогреватель с крышкойПремьера XH2004Использование для инкубации затворов при разных температурах
Слайды Superfrost Plus Fisher Scientific12-550-15 Используйте для прикрепления секций для Vsium HD
Хирургическое лезвие No 11Integra Miltex4-311Применение для оценки тканей FFPE
Парапласт SurgipathLeica Biosystems39601006Используется для проведения инфильтрации тканей и вложения тканей
TISsue DISH 100X20MM 500/CSFisher Scientific877222Использование для сбора и вскрытия образцов в 1x PBS
UltraPure GlycerolТермо Фишер15514011Использование для крепления стекла на слайд Visium HD перед CytAssist
Visium CytAssist10X Genomics, Inc. PN-1000442Использование для экспериментов с рабочими процессами Visium HD
Пространственное РНК-секвенирование Visium HD10X Genomics, Inc. 1000676Использование для проведения пространственных транскриптомических экспериментов
Локализация РНК Xenium 5K in situ 10X Genomics, Inc. PN-1000724Использование для проведения пространственных транскриптомических экспериментов
Анализатор ксения10X Genomics, Inc. PN-1000481Используйте Xenium и Xenium 5K РНК-визуализацию  
Xenium Explorer 410X Genomics, Inc. Используйте для анализа данных по ксению 
Локализация РНК ксения in situ10X Genomics, Inc. 1000672Использование для проведения пространственных транскриптомических экспериментов

Ссылки

  1. Thesleff, I. From understanding tooth development to bioengineering of teeth. Eur J Oral Sci. 126 (1), 67-71 (2018).
  2. Bei, M. Molecular genetics of tooth development. Curr Opin Genet Dev. 19 (5), 504-510 (2009).
  3. Roth, D. M., et al. Craniofacial development: neural crest in molecular embryology. Head Neck Pathol. 15 (1), 1-15 (2021).
  4. Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development. 147 (2), dev184754(2020).
  5. Krivanek, J., et al. Dental cell type atlas reveals stem and differentiated cell types in mouse and human teeth. Nat Commun. 11 (1), 4816(2020).
  6. Nagata, M., et al. Single-cell transcriptomic analysis reveals developmental relationships and specific markers of mouse periodontium cellular subsets. Front Dent Med. 2, 679937(2021).
  7. Chiba, Y., et al. Single-cell RNA-sequencing from mouse incisor reveals dental epithelial cell-type specific genes. Front Cell Dev Biol. 8, 841(2020).
  8. Marx, V. Method of the year: spatially resolved transcriptomics. Nat Methods. 18 (1), 9-14 (2021).
  9. Feng, J., et al. High-resolution spatial transcriptomics and cell lineage analysis reveal spatiotemporal cell fate determination during craniofacial development. Nat Commun. 16 (1), 4396(2025).
  10. Janesick, A., et al. High-resolution mapping of the tumor microenvironment using integrated single-cell, spatial and in situ analysis. Nat Commun. 14 (1), 8353(2023).
  11. Bliese, S. R., et al. Single-cell resolution spatial transcriptomic signature of the retrosplenial cortex during memory consolidation. Mol Psychiatry. 30, in press (2025).
  12. Aminu, M., et al. CoCo-ST detects global and local biological structures in spatial transcriptomics datasets. Nat Cell Biol. 27 (11), 2019-2031 (2025).
  13. Ren, P., et al. Systematic benchmarking of high-throughput subcellular spatial transcriptomics platforms across human tumors. Nat Commun. 16 (1), 9232(2025).
  14. Long, M., et al. Comparing Xenium 5K and Visium HD data from identical tissue slide at a pathological perspective. Exp Clin Cancer Res. 44 (1), 219(2025).
  15. Chen, X., et al. Integrative spatial and single-nucleus transcriptomics elucidate cell lineage dynamics in human tooth morphogenesis. Int Dent J. 75 (6), 103920(2025).
  16. Raju, R., et al. Profiles of Wnt pathway gene expression during tooth morphogenesis. Front Physiol. 14, 1316635(2024).
  17. Piña, J. O., et al. Single-cell spatial transcriptomics links Wnt signaling disruption to extracellular matrix development in a cleft palate model. Sci Rep. 15 (1), 29639(2025).
  18. Gao, X. H., et al. Comparison of fresh frozen tissue with formalin-fixed paraffin-embedded tissue for mutation analysis using a multi-gene panel in patients with colorectal cancer. Front Oncol. 10, 310(2020).
  19. Visium spatial gene expression for FFPE tissue preparation guide. Document number CG000408 Rev E. , 10x Genomics. (2023).
  20. Xenium in situ - FFPE tissue preparation handbook. Document number CG000578 Rev F. , 10x Genomics. (2025).
  21. Ståhl, P. L., et al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science. 353 (6294), 78-82 (2016).
  22. Kleshchevnikov, V., et al. Cell2location maps fine-grained cell types in spatial transcriptomics. Nat Biotechnol. 40 (5), 661-671 (2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.