Стандартизированный анализ потоковой цитометрии с использованием засушенных панелей рекомбинантных антител для характеристики CAR T-клеток

Краткое содержание

Этот протокол демонстрирует, как высушенные панели рекомбинантных антител упрощают характеристику клеток T (Chimeric Antigen Receptor T (CAR T), снижая вариабельность и упрощая рабочие процессы. Он позволяет воспроизводимо оценивать критические характеристики качества, включая абсолютную количественную оценку Т-клеток химерных антигенных рецепторов, и совместим с различными платформами потоковой цитометрии.

Аннотация

Проточная цитометрия часто используется для оценки критических характеристик качества клеток химерных антигенных рецепторов T (CAR T), включая жизнеспособность, фенотип и эффективность трансдукции. Традиционные рабочие процессы с жидкостными реагентами требуют нескольких этапов подготовки, что может привести к вариативности и различиям в обращении с оператором. Готовые высушенные панели рекомбинантных антител предоставляют альтернативный формат, сочетающий технологию рекомбинантных антител с готовой к использованию конфигурацией. Рекомбинантные антитела обладают определённой специфичностью и сниженной вариабельностью от партии к партии, тогда как сушёный формат уменьшает этапы подготовки и упрощает обращение с реагентами. Здесь мы представляем пошаговый рабочий процесс анализа CAR T-клеток с использованием панелей высушенных рекомбинантных антител. Протокол включает окрашивание образцов, сбор данных и анализ, а также сопровождается схематичным обзором рабочего процесса. Репрезентативные результаты окрашивания иллюстрируют нанесение панелей, а также выделяются различия во времени практического использования по сравнению с обычным рабочим процессом с жидкостным реагентом. Приведённые примеры демонстрируют, как эти панели можно использовать для оптимизации мультипараметрической характеристики CAR T-ячеек. В целом, эта работа предоставляет практическую основу для внедрения высохших панелей рекомбинантных антител в анализе CAR-клеток на основе проточной цитометрии.

Введение

Терапия CAR T-клеток стала значительным достижением в лечении рака, особенно гематологических злокачественных опухолей. Этот подход использует собственную иммунную систему пациента, модифицируя Т-клетки для экспрессии химерных антигенных рецепторов (CAR), которые распознают и нацелены на раковые^{клетки 1}. Однако высокая сложность инфраструктуры и трудоёмкие производственные процессы, необходимые для производства CAR T-клеток, делают строгую, стандартизированную характеристику необходимой для обеспечения качества продукции и безопасности пациентов. Значительная часть общей стоимости терапии CAR T связана с обширными лабораторными работами и процедурами контроля качества (QC), многие из которых включают ручные многоступенчатые рабочие процессы. В этом контексте ключевые параметры характеристики — такие как эффективность трансдукции и тестирование идентичности — имеют решающее значение для оценки терапевтического потенциала модифицированных^{клеток 2}. Традиционные методы жидкого окрашивания в проточной цитометрии, широко используемые для таких оценок, представляют ряд сложностей. Вариабельность в пипетировании, проблемы со стабильностью реагентов и смещение оператора могут привести к несоответствиям и неточностям данных, что потенциально может подорвать надёжность^{результатов 3}.

Потокная цитометрия является основной технологией для характеристики и контроля качества CAR T-клеток, позволяющая детально анализировать параметры нескольких клеток. Однако традиционное использование жидких реагентов в этом процессе сопровождается потенциальными рисками ^4,5. Вариабельность пипетирования может привести к значительной ошибке, особенно при работе с малыми объёмами и несколькими реагентами. Кроме того, жидкие реагенты со временем подвержены разрушению, что может нарушить их стабильность и привести к неравномерным результатам^{окрашивания 6}. Смещение оператора, возникающее из-за ручной подготовки и обработки, усугубляет эти проблемы, что может привести к вариативности результатов между лабораториями и даже внутри запусков в одной лаборатории. Критические характеристики качества, такие как жизнеспособность клеток, частота трансдукции, количество CD3⁺ и идентичность, необходимы для безопасного выпуска продуктов CAR T. Обеспечение точности и согласованности этих измерений крайне важно, поскольку они напрямую влияют на терапевтическую эффективность и безопасность CAR T-клеток¹. Например, точная оценка частоты трансдукции имеет решающее значение для определения доли Т-клеток, успешно модифицированных для экспрессии CAR, а количество CD3⁺ и процент дают представление о общем составе и чистоте популяции Т-клеток.

Панели с высушенными антителами предлагают перспективное решение этих проблем, обеспечивая стабильную доставку реагентов и сокращая время установки и риск ошибок. Эти панели состоят из множества антител, высушенных из готовых коктейлей. После высыхания эти панели стабильны и готовы к использованию, что устраняет необходимость сложных этапов подготовки и минимизирует риск человеческой^{ошибки 6,7}. Важно, что нет необходимости восстанавливать эти засушенные панели перед использованием — клеточные суспензии можно добавлять непосредственно в сухую смесь антител. Включение рекомбинантных антител в эти высушенные форматы даёт ряд преимуществ по сравнению с традиционными поликлональными или гибридомными реагентами. Их молекулярно определённая структура обеспечивает высокую согласованность и воспроизводимость между партиями, снижая вариабельность между экспериментами и лабораториями. Инженерный Fc-регион на основе человеческого IgG1 минимизирует перекрёстную реактивность и окрашивание фона. В результате Fc-блокировка не требуется, что дополнительно сокращает время проведения цитометрического анализа потока. Сухой формат защищает реагенты от разрушения, сохраняя их эффективность со временем и в партиях. Эта консистенция крайне важна для достижения надёжных и воспроизводимых результатов в анализах проточной^{цитометрии 8}.

Применение форматов сушеных реагентов охватывает различные этапы разработки и мониторинга терапии CAR T-клетками. При контроле качества производства высушенные реагенты способствуют отбору проб в закрытой системе, обеспечивая стерильность и консистенцию. Это особенно важно в клинических условиях, где сохранение целостности образца имеет^{первостепенное значение.} Для характеристики продукта сушёные реагенты позволяют точно оценить абсолютное количество и иммунные подмножества, что имеет решающее значение для определения терапевтического качества CAR T-клеток. Кроме того, в исследовательских учреждениях сушёные реагенты незаменимы для долгосрочного мониторинга пациентов, позволяя стабильно отслеживать персистентность CAR T-клеток со временем, что критически важно для понимания долгосрочной эффективности и безопасности терапии.

Преимущества использования панелей с высохшими антителами в проточной цитометрии многократны, одним из самых важных является их способность снижать ошибки пипетирования за счёт создания полностью предварительно настроенной панели, а не необходимости вручную подвесить и комбинировать отдельные реагенты. В отличие от одиночных высохших антител — которые всё ещё требуют восстановления и пипетирования, поэтому они в первую очередь обеспечивают более длительный срок хранения — предварительно собранные сухие панели исключают несколько этапов ручной подготовки. Это упрощает рабочий процесс, значительно минимизируя возможности вариативности, зависящей от оператора. В результате процесс становится менее подверженным ошибкам, менее трудоёмким и менее зависимым от обширного технического обучения, что делает его доступным для более широкого спектра^{лабораторий 10}. Кроме того, стабильный и готовый к использованию формат панелей с высушенными рекомбинантными антителами обеспечивает стабильную и надёжную работу анализов между операторами и^{точками 9}.

Чтобы полностью реализовать потенциал технологии сушеных реагентов в проточной цитометрии, необходимо разработать пошаговый протокол её использования. Это включает рекомендации по окрашиванию сухих панелей, получению и автоматизированному анализу, гарантируя стандартизацию и оптимизацию всех аспектов процесса для точности и эффективности. Обеспечивая чёткий и комплексный протокол, лаборатории могут достигать последовательных и надёжных результатов, способствуя безопасному и эффективному выпуску продуктов CAR^{T-клеток 2}. Здесь мы предлагаем протокол, который использует преимущества высохших панелей антител для устранения ограничений традиционных методов жидкого окрашивания, тем самым повышая надёжность, эффективность и воспроизводимость — ключевые функции для обеспечения безопасной и эффективной терапии CAR T-клеток (см. рисунок 1).

Протокол

Все человеческие образцы были собраны у здоровых анонимных добровольцев после получения письменного информированного согласия. Все процедуры были утверждены Этическим комитетом Ärztekammer Nordrhein (#2020272) и выполнялись в соответствии с необходимыми этическими и биобезопасными нормами.

1. Сбор и подготовка образцов

1. Асептически собирайте образцы клеток Chimeric Antigen Receptor T (CAR T) из подсумков для контроля качества производства.
2. Обрабатывайте образцы оперативно, чтобы поддерживать жизнеспособность клеток. Храните образцы при 2–8 °C, защищённых от света, до появления пятен.
3. Определите номер ячеек каждого образца перед окрашиванием.
4. Отрегулируйте концентрацию каждого образца до 10⁶ нуклеированных клеток на 100 мкл, используя фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS)/2 мМ EDTA/0,5% буфера BSA, pH 7,2.
   1. При необходимости центрифугуйте образцы при 300 × г в течение 5 минут. Полностью аспирируйте супернатант.
   2. Суспензировать клетки до нужной концентрации.

2. Высохшая панельная морилка

ПРИМЕЧАНИЕ: Для окрашивания образцов используются два заранее сформулированных панеля с высохшими антителами: высушенный коктейль с рекомбинантным составом иммунных клеток (ICC) в человеке и высушенный рекомбинантный коктейль CAR T Transduction Cocktail, человек. Окраска CAR для панели CAR T Transduction крайне важна. Для точного определения частоты трансдукции требуется надёжное разделение CAR-отрицательных и CAR-положительных клеток. Промывка может замедлять восстановление клеток из-за потери её во время центрифугирования и аспирации. Поэтому обычно предпочитаются протоколы без промывки, когда требуется точная концентрация клеток.

1. Коктейль ICC (протокол без мытья)
   1. Добавьте 100 мкл подготовленной клеточной суспензии непосредственно в высушенную трубку антитела ICC. Смешивайте, вводя пипеток вверх и вниз и/или кратковременно ввихря, чтобы полностью растворить гранулу. Инкубировать 10 минут в темноте при комнатной температуре (19–25 °C).
   2. Убедитесь, что высохшая гранула антитела полностью растворена. Переходите сразу к приобретению без промывки.
2. Коктейль трансдукции CAR T (протокол мойки)
   1. Добавьте 100 мкл подготовленной ячейки в высушенную трубку CAR T.
   2. Добавьте соответствующий объём реагента для обнаружения CAR (например, 2 мкл). Смешивайте, вводя пипеток вверх и вниз и/или кратковременно ввихря, чтобы полностью растворить гранулу. Инкубировать 10 минут в темноте при комнатной температуре (19–25 °C). Убедитесь, что высохшая гранула антитела полностью растворена.
   3. Промывайте клетки, добавив 1 мл буфера. Центрифугу при 300 × г в течение 5 минут. Полностью удалите супернатант.
3. Вторичная морилка (если это необходимо)
   1. Проведите вторую промывку (см. шаг 2.2.3) для реагентов для обнаружения CAR с меткой биотина, чтобы удалить свободный биотин-конъюгированный реагент и уменьшить фоновые окрашивания.
   2. Суспензировать ячейки в 98 мкл буфера. Добавьте 2 мкл вторичного антитела, маркированного фикоэритрином (ПЭ). Ненадолго Vortex для смешивания. Инкубировать 10 минут в темноте при комнатной температуре (19–25 °C).
   3. Промыть клетки, чтобы удалить несвязанные вторичные антитела (см. шаг 2.2.3).
4. Окончательная подготовка к приобретению
   1. Отрегулировать объём всех окрашенных образцов (CAR T Transduction Cocktail и ICC Cocktail) до 300–500 мкл с помощью буфера. Защищайте образцы от света и держите температуру 2–8 °C.
   2. Проведите приобретение в течение 1 часа для поддержания стабильности флюорофора и жизнеспособности клеток.

3. Потоково-цитометрический сбор и анализ данных

1. Подготовьте и подготовьте проточный цитометр, обеспечив оптимизацию калибровки и настройки приборов.
2. Включите лазеры и прополосните жидкостную систему. Дайте минимум 30 минут на прогрев оптического стола.
3. Во время разогрева запустите программу очистки с раствором 1% гипохлорита.
4. Используйте калибровочные шарики для настройки лазера.
5. Подготовьте одноокрашенные контроли для компенсации с использованием соответствующих наборов антител.
   1. Для бусин: добавьте соответствующее количество положительных и отрицательных контрольных бусин.
   2. Для ячеек: добавьте 100 мкл суспензии ячейки.
   3. Для биотин-конъюгированных реагентов: включите пробирку с 98 мкл буфера и 2 мкл вторичного антитела с маркировкой ПЭ.
   4. Проверьте, совпадают ли компенсативные реагенты с антителами (номера партий).
6. Инкубация контролирует 10–20 с, вихрь — 5 секунд, затем инкубирует 10 минут в темноте при температуре 19–25 °C.
7. Разведите образцы с помощью 600 мкл буфера и тщательно перемешайте.
8. Настройте компенсацию с помощью однократных элементов управления.
9. Отрегулировать напряжения FSC и SSC и определить пороги, чтобы исключить мусор.
10. Получить не менее 50 000–100 000 живых лимфоцитов на образец.
11. Проведите гейтинг для оценки жизнеспособности, экспрессии CD3 и экспрессии CAR.
12. Для абсолютной количественной оценки определите долю CAR-положительных Т-клеток (f₍CAR T₎).
13. Определите общие лейкоциты (N₍total₎) как жизнеспособные CD45⁺, отдельные клетки после исключения обломков.
14. Измеряйте общее количество лейкоцитов с помощью прямого подсчёта образцов с ICC, если это подтверждается инструментом, или с помощью счётных шариков или гематологического анализатора.
15. Рассчитайте концентрацию Т-клеток CAR:
    
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пример расчёта со значениями из рисунка 2 и рисунка 3
    ​
    
16. Применяйте этот метод для количественной оценки CAR T-клеток на различных приборах и рабочих процессах.

Результаты

Высушенные панели рекомбинантных антител применялись к образцам CAR⁺ Т-клеток для демонстрации рабочих процессов окрашивания проточной цитометрией. Как показано на рисунке 1, замена традиционных рабочих процессов с жидкостными реагентами на заранее сформулированные панели с высохшими антителами исключает несколько этапов подготовки — включая маркировку пробирки (для обозначения состава антител панели; для каждой пробирки требуется соответствующий идентификатор образца), комбинирование реагентов и ручное смешивание — тем самым упрощая процесс окрашивания. Пробирки оснащены этикеткой, которую можно сканировать совместимыми цитометрами или читать вручную, что обеспечивает гибкие возможности идентификации образцов.

Репрезентативные примеры показывают, что панель состава сухих иммунных клеток позволяет идентифицировать ключевые подмножества лейкоцитов (рисунок 2), а панель трансдукции высушенного CAR T позволяет визуализировать Т-клетки, экспрессирующие CAR, и оценить трансдукцию (рисунок 3). Fc-блокировка для этих панелей не требуется, и для всех антител в панели требуется только один контроль изотипа. Эти примеры подчёркивают применение высушенных панелей для мультипараметрического анализа CAR T-элементов и демонстрируют, как рабочий процесс можно эффективно выполнять с уменьшением практических этапов. Состав высохших панелей антител, использованных в этом исследовании, приведён в таблице 1.

Рисунок 4 иллюстрирует сокращение времени подготовки к репрезентативному эксперименту при использовании сухих панелей как для менее опытных, так и для опытных пользователей. Сухой формат упрощает процедуры окрашивания, минимизирует ручное обращение и предоставляет практические рекомендации по реализации рабочих процессов и обучению. Важно отметить, что использование коктейлей с высушенными антителами дало частоты подмножества иммунных клеток, сопоставимые с теми, что получаются в традиционных жидких коктейлях (рисунок 5). Кроме того, высохшие панели антител стабильны при комнатной температуре и могут храниться в условиях окружающей среды на протяжении всего года срока годности, в отличие от традиционных жидких антител, которые обычно требуют холодного хранения. Такая стабильность поддерживает повторное использование, долгосрочные исследования и упрощённое управление запасами.

В заключение, приведённые примеры демонстрируют, как высушенные панели рекомбинантных антител могут быть использованы для оптимизации мультипараметрической характеристики CAR T-клеток. В целом, эта работа предоставляет практический подход к внедрению засушенных антител в анализе CAR Т-клеток на основе цитометрии потока, с упрощённым обращением, сокращением этапов подготовки и адаптивной конфигурацией панелей.

Рисунок 1: Сравнение процесса ручного окрашивания и панелей высушенных рекомбинантных антител .Традиционный ручной рабочий процесс (верх) включает несколько этапов подготовки, включая маркировку трубок, смешивание и смешивание реагентов, а также добавление образцов, что увеличивает практические усилия. В отличие от этого, рабочий процесс с высушенной рекомбинантной панелью антител (снизу) использует предварительно смешанные, высушенные панели, для которых требуется только добавление образца. Такой упрощённый подход уменьшает ручные шаги и упрощает процесс окрашивания, демонстрируя эффективность рабочего процесса и практическую реализацию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Проточный цитометрический анализ образца лейкофереза, окрашённого панелью высушенных рекомбинантных антител «Коктейль состава иммунных клеток». (A) Обломки были исключены путём гейтинга на FSC против SSC для включения всех клеток. (B) Дублеты были удалены с помощью гейта FSC-A против FSC-H. (C) Лейкоциты были выявлены путём гейтинга на клетках CD45⁺, что позволяло исключать остаточные эритроциты. (D) Мёртвые клетки исключались с помощью окрашивания 7-AAD. (E,F) Были идентифицированы клетки CD3⁺ и далее классифицированы на (E) T-клетки и (F) NKT-клетки на основе экспрессии CD56. (G) Т-клетки впоследствии были разделены на подмножества CD4⁺ и CD8⁺. (H) ^{В популяции} CD3 моноциты определялись экспрессией CD14, а B-клетки — экспрессией CD19. (I) Оставшиеся ^клетки CD14^–/CD19–были разделены на эозинофилы SSC high/CD16^, нейтрофилы SSC high/CD16⁺ и клетки SSC low/CD56⁺/CD16⁺. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Проточный цитометрический анализ CD19 CAR T-клеток (FMC63), окрашенных с использованием панели высушенных рекомбинантных антител «CAR T Transduction Cocktail». (A) Обломки были исключены путём гейтинга на FSC против SSC для включения всех клеток. (B) Дублеты были удалены с помощью гейта FSC-A против FSC-H. (C) Лейкоциты были выявлены путём гейтинга на клетках CD45⁺ . (D) Мёртвые клетки были исключены на основе окрашивания 7-AAD⁻ . (E,F) Были выявлены клетки CD3⁺ и впоследствии разделены на популяции ^CAR+ и ^CAR− . (G) CAR⁺ и (H) ^CAR− клетки дополнительно делились на подмножества CD4⁺ и CD8⁺ T-клеток. (I) Внутри популяции CD3⁻ остаточные моноциты определялись по экспрессии CD14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Экономия времени с помощью высушенных панелей антител на разных уровнях опыта. Для неопытных пользователей (слева) и опытных пользователей (справа) оценивалось время для организации проточного цитометрического эксперимента (панель с высушенными рекомбинантными антителами «Коктейль состава иммунных клеток», технические триэкаты) с начала эксперимента до начала инкубации, включая обработку реагентов, пипетирование и документацию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5: Анализ проточной цитометрии лизированной цельной крови, наложение образца, окрашённого высохшей панелью рекомбинантных антител «Коктейль состава иммунных клеток» (синий) и образца, окрашённого такими же антителами в жидком формате (оранжевый). (A) Обходы были исключены путём гейтинга на FSC против SSC для включения всех клеток. (B) Дублеты были удалены с помощью гейта FSC-A против FSC-H. (C) Лейкоциты были выявлены путём гейтинга на клетках CD45⁺, исключая тем самым остаточные эритроциты. (D) Мёртвые клетки исключались с помощью окрашивания 7-AAD. (E) Были выявлены клетки CD3⁺. (F) Эти клетки затем классифицировались на Т-клетки и NKT-клетки на основе экспрессии CD56. (G) Т-клетки впоследствии были разделены на подмножества CD4⁺ и CD8⁺. (H) ^{В популяции} CD3 моноциты определялись экспрессией CD14, а B-клетки — экспрессией CD19. (I) Оставшиеся ^клетки CD14^–/CD19–были разделены на эозинофилы SSC high/CD16^, нейтрофилы SSC high/CD16⁺ и клетки SSC low/CD56⁺/CD16⁺. (J) Частоты, полученные с помощью жидких антител и панелей высушенных реагентов, сравнивались. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Назначение	V1 VioBlue	V2 VioGreen	B1 FITC	B2 PE	B3 7-AAD PerCP-Vio 700	B4 PE-Vio770	R1 БТР	R2 APC-Vio770
Определение жизнеспособности и состава иммунных клеток	CD45	CD4	CD3	CD56/CD16	7-AAD	CD19	CD14	CD8
Определение эффективности трансдукции Т-клеток CAR	CD45	CD4	CD3	Реагент для обнаружения CAR	7-AAD	/	CD14	CD8

Таблица 1: Состав засохших панелей рекомбинантных антител, используемых для анализа CAR T-клеток. В этой таблице перечислены антитела, включённые в каждую высушенную панель, с указанием целевого антигена, клона, фторхрома и типичного количества на пробирку. Показаны две панели: панель «Состав иммунных клеток» для идентификации основных подмножеств лейкоцитов и панель «Трансдукция CAR T» для обнаружения экспрессии CAR и характеристики подмножеств Т-клеток. Эта информация служит ориентиром для реализации рабочего процесса и необязательной адаптации с дополнительными жидкостно-конъюгированными антителами.

Обсуждение

Высушенные панели рекомбинантных антител обеспечивают упрощённый и практичный рабочий процесс для характеристики CAR T-клеток в лаборатории. Заранее сформулированный формат уменьшает этапы подготовки и упрощает обработку, помогая ограничить вариативность, зависящую от оператора, и поддерживая последовательное выполнение многопараметрических процедур потоковой^{цитометрии 8}. Репрезентативные примеры иллюстрируют использование этих панелей для выявления подмножеств лейкоцитов, обнаружения экспрессии CAR и оценки подмножеств Т-клеток. Панели также могут быть дополнены дополнительными жидкостно-конъюгированными антителами с добавлением дополнительных маркеров или иммунных подмножеств, что позволяет гибко адаптироваться к специфическим экспериментальным потребностям или анализу с более высокими параметрами.

Точное обнаружение CAR критически важно для надежного определения частоты^{трансдукции 1}. Чёткое разделение CAR-отрицательных и CAR-положительных популяций зависит от оптимальных условий окрашивания, особенно при различных уровнях экспрессии CAR. Такие элементы, как образцы с флуоресценцией минус один (FMO), могут поддерживать точное гейтинг. В некоторых случаях этапы промывания могут улучшить различительность, удаляя несвязанные антитела; однако эти этапы могут снизить восстановление клетки из-за потери при центрифугировании и аспирации. Поэтому при точной количественной оценке элементов могут быть предпочтительнее рабочие процессы без промывки.

В идеале подход использует специфический для CAR-реагент обнаружения, который распознаёт внеклеточную область инженерного CAR, но также могут применяться альтернативные реагенты, такие как антитела, направленные на консервативные области связывающих между доменами связывания антигена и сигнальной связывающей области. Эти альтернативы позволяют обнаруживать клетки, экспрессирующие CAR, и могут быть интегрированы в рабочие процессы, где специфические для CAR реагенты недоступны, с соответствующей оптимизацией.

Интеграция с автоматизированными системами сбора и анализа, включая Express Mode, может ещё больше упростить сбор и анализ данных, сокращая время работы на практике и обеспечивая единообразное выполнение рабочих процессов между операторами.

Хотя эта работа иллюстрирует метод, формальная валидация теста для регулируемого производства или тестирования на выпуск не проводилась. Многоцентровая валидация пока не проведена, поэтому воспроизводимость между лабораториями остаётся^{подтверждена 5}. Подход основан на заранее сформулированных панелях, что может ограничивать гибкость для высокоспециализированных приложений. Однако варианты панелей с индивидуальной сушкой могут быть разработаны с учетом конкретных маркеров или комбинаций, что позволяет адаптировать рабочие процессы и преодолевать ограничения стандартных панелей. Стоимость в целом компенсируется сокращением времени на практике и оптимизацией процедур, что особенно выгодно для высокопроизводительных рабочих процессов.

Будущая работа может быть сосредоточена на количественной оценке эффективности, формальной валидации для регулируемого использования и расширении до многоцентровых исследований для оценки согласованности рабочих процессов между лабораториями. Индивидуальный дизайн панелей представляет собой практический путь расширения покрытия маркеров, решения уникальных экспериментальных вопросов или адаптации к исследованиям продольного иммуномониторинга.

В заключение, панели с высушенными рекомбинантными антителами предоставляют гибкую и практичную платформу для цитометрии потока CAR T-клеток. Они сокращают этапы подготовки, упрощают рабочие процессы и поддерживают гибкий экспериментальный дизайн, включая индивидуальные конфигурации панелей.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
(Опционально) Биотин антитело, PE, REAfinity	Miltenyi Biotec	130-110-951	Нужен только в случае использования биотин-конъюгированного CAR детектированного реагента.
(Опционально) CAR T клетки, режим экспресс-пакета	Miltenyi Biotec	160-002-376	Дополнительное ПО для MACSQuant анализаторов; позволяет автоматизированное гейтинг и анализ данных, хотя ручной анализ также возможен.
CAR детектированный реагент выбора, обнаруживаемый в PE канале, напр., CD19 CAR детектированный реагент, человеческий, биотин	Miltenyi Biotec	130-129- 550	Альтернативные варианты: CD19 CAR FMC63 идиотип антитело, PE, REAfinity (130-127-342); CAR детектированный реагент CD22, человеческий, биотин (130-126-727); CAR детектированный реагент BCMA, человеческий, PE (130-133-888)
Флоу-цитометр, напр., MACSQuant анализатор 16	Miltenyi Biotec	130-109-803	СтайнЭкспресс трубки совместимы со всеми стандартными флоу-цитометрами.
СтайнЭкспресс CAR T трансдукционный коктейль, человеческий	Miltenyi Biotec	130-127-638	Кастомные конфигурации сухих антитело панелей могут быть запрошены через вашего местного представителя Miltenyi Biotec или техническую команду поддержки.
СтайнЭкспресс коктейль для анализа иммунных клеток, человеческий	Miltenyi Biotec	130-127-637	Кастомные конфигурации сухих антитело панелей могут быть запрошены через вашего местного представителя Miltenyi Biotec или техническую команду поддержки.