Мультиплексный анализ на бусинах в потоковом цитометре для функционального профилирования CAR T-клеток

Summary

Эта статья представляет собой многокомпонентный анализ иммуноферментного тестирования на основе шариков для количественного определения до 12 цитокинов и эффекторных молекул из надосадочной жидкости, полученной из Т-клеток с кариорезепторами (CAR), что позволяет быстрый, воспроизводимый анализ функциональности инженерных Т-клеток с небольшими объемами образцов.

Abstract

Профилирование клеток CAR T представляет собой сложности из-за их гетерогенности, сложных иммунных реакций и ограниченной доступности образцов. Мультиплексные анализы позволяют оценить функциональность, позволяя одновременно обнаруживать широкий спектр эффекторных молекул, включая цитокины, хемокины и цитотоксические медиаторы. Здесь мы описываем мультиплексный анализ на основе бисера, совместимый с проточной цитометрией, для анализа секреции эффекторных молекул человеческими клетками CAR-T с химическим антигенным рецептором. Супернатанты клеток CAR T инкубируются со смесью захватывающих бисерных шариков, состоящих из нескольких флуоресцентно-кодированных популяций, связанных с анализируемыми специфичными антигенам антителами. Эти шарики связывают растворимые мишени в образце, формируя комплексы шарик-анализируемый объект, которые затем обнаруживаются с помощью метки антител для обнаружения. Анализ включает в себя панель иммунных медиаторов, таких как интерферон (IFN)-γ, интерлейкин (IL)-2, фактор некроза опухоли (TNF)-α, IL-6, IL-10, фактор колоний гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF) и Гранзим B. Использование заранее определенных стандартов позволяет количественно измерить несколько анализируемых веществ из одного образца. Сбор и анализ данных могут быть выполнены с помощью автоматизированных подходов к воротам, предоставленных инструментальными или веб-инструментами программного обеспечения, что облегчает обработку данных. Таким образом, представленный мультиплексный анализ позволяет проводить многопараметрический анализ функциональности клеток CAR T и может применяться в таких контекстах, как исследования, контроль качества, механизмы исследований и функциональная характеристика.

Introduction

Функциональная характеристика имеет важное значение при тестировании Т-клеток с химирическими рецепторами антигена (CAR), так как она предоставляет представление о потенции, безопасности и механизмах действия этих методов лечения. Понимание подписей цитокинов и цитотоксических медиаторов помогает оценить терапевтическую эффективность и потенциальные нежелательные последствия, обеспечивая разработку безопасных и эффективных лечебных средств. Традиционные однокомпонентные анализы, такие как ферментно-связанные иммуноанализы (ELISA), имеют ограничения, такие как необходимость больших объемов образцов, длительное время обработки и отдельные запуски для каждого анализируемого вещества, при этом предлагая ограниченный динамический диапазон в рамках отдельных образцов^1,2. Напротив, мультиплексные анализы на основе перлов для анализа анализируемых веществ позволяют одновременно обнаруживать несколько растворимых медиаторов, сокращая время обработки и требования к образцам при увеличении динамического диапазона^1,2. Эта эффективность и глубина анализа делают мультиплексные анализы ценными инструментами для продвижения исследований и разработки CAR T-клеток^3,4,5.

Представленный в этом исследовании мультиплексный анализ использует перлы-улавливатели, которые демонстрируют определенные флуоресцентные профили в каналах флуоресцеина изотиоцианат (FITC) и фикоэритрина (PE) и покрыты специфическими антителами против растворимых анализируемых веществ. Во время инкубации с образцом эти перлы селективно связываются с целевыми анализируемыми веществами из раствора. После улавливания анализируемых веществ добавляются антитела для обнаружения для образования специфичных для анализируемых веществ сэндвич-комплексов. Эти антитела либо напрямую связываются с аллофикоцианином (APC) (прямое обнаружение), либо с биотином (непрямое обнаружение). Для непрямого обнаружения требуется последующая инкубация с антителом, связанным с APC, против биотина (Рисунок 1). Полученные комплексы, включающие перлы-улавливатели, анализируемые вещества и антитела для обнаружения, анализируются с помощью анализа потоков для определения концентрации анализируемых веществ. Мультиплексный анализ является технологией на основе пластинки, включающей предопределенные стандарты, используемые для создания специфичных для анализируемых веществ стандартных кривых^1,2.

Рисунок 1: Принцип цитокиновой технологии и рабочий процесс анализа. Анализ основан на 12 флуоресцентно-кодированных популяциях перлов-улавливателей, связанных с антителами, специфичными для анализируемых веществ. После инкубации образца формируются комплексы перл-анализируемые вещества, которые могут быть обнаружены с помощью анализа потоков с использованием специфичных антител для обнаружения. Рабочий процесс анализа включает 1) подготовку стандартов анализируемых веществ и образцов, представляющих интерес, на фильтровальной пластинке, 2) инкубацию с перлами-улавливателями, 3) инкубацию с биотин-маркированными антителами против анализируемых веществ для формирования сэндвич-комплексов, 4) инкубацию с антителами против биотина, маркированными APC, 5) взвешивания в буфере для измерения и 6) регистрацию образцов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть большую версию этого рисунка.

Описанный в этом исследовании мультиплексный анализ совместим со стандартными анализаторами потоков, оснащенными синим (например, 488 нм; каналы FITC и PE) и красным лазером (например, 635 нм; канал APC). Поскольку анализаторы потоков широко доступны в исследовательских лабораториях, клинических условиях и средах контроля качества, эта совместимость облегчает внедрение без необходимости дополнительного специализированного оборудования⁵. В контексте тестирования функциональности CAR T-клеток этот подход позволяет многопараметрическую оценку функциональных реакций в рамках обычно доступных аналитических рабочих процессов⁶. Анализ обеспечивает значительные преимущества для исследований CAR T-клеток, позволяя одновременно определять ключевые анализируемые вещества, включая GM-CSF, Гранзим B, интерферон (IFN)-γ, интерлейкин (IL)-2, IL-4, IL-6

Protocol

Все образцы человеческих клеток были взяты от здоровых анонимных добровольцев после получения письменного информированного согласия. Все процедуры были одобрены Комитетом по этике медицинской палаты Северного Рейна-Вестфалии (#2020272) и проведены в соответствии с необходимыми этическими и биоразностными правилами.

1. Кокультивирование клеток CAR T

1. Приготовьте клеточную культуру инженерных клеток CAR T человека в отсутствие и в присутствии собственного антигена, например, опухолевые клетки, представляющие антиген, в соотношении 2,5:1 (эффектор : целевые клетки).
2. Определите один или несколько временных моментов для сбора супернатанта для анализа секретируемых цитокинов один раз или кинетику цитокинов в течение определенного временного интервала, например, через 4, 8, 16, 24 и 48 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Супернатанты могут быть использованы непосредственно или заморожены для последующего использования.

2. Стандартная и образцовая подготовка

1. Восстановите стандартный аналит, добавив 200 мкл буфера или среды клеточной культуры к пеллету и аккуратно перемешайте. Приготовьте шесть реактивных пробирок и выполните серию разбавления 1:5 восстановленного стандарта, до 3,2 пг/мл или 0,6 пг/мл (в зависимости от анализируемого вещества), и приготовьте бланк.
2. Собирайте супернатанты кокультивирования CAR T, например, через 16 ч или 24 ч после кокультивирования. Необязательно, но можно собрать клетки CAR T для параллельного фенотипирования с помощью цитометрии в потоке.
3. Центрифугируйте образцы при 10 000 × g в течение 10 минут при 4 °С. Используйте супернатанты в чистом виде или разбавьте их, чтобы соответствовать диапазону стандартной кривой.

3. Рабочий процесс анализа

1. Вортексуйте смесь захватывающих перликов, чтобы тщательно их ресуспендировать. Добавьте 50 мкл стандарта или образца вместе с 20 мкл предварительно разбавленных перликов в колодцы 96-лункового фильтрованного блока.
2. Инкубируйте в течение 2 ч при комнатной температуре, встряхивая при 450 об/мин, во тьме. Промойте колодцы дважды по 200 мкл буфера с помощью вакуумного манипулятора или центрифуги.
3. Добавьте 100 мкл 1:50 предварительно разбавленного реагента обнаружения 1 (в буфере). Инкубируйте в течение 1 ч при комнатной температуре, встряхивая при 450 об/мин, во тьме. Промойте дважды.
4. Добавьте 100 мкл 1:50 предварительно разбавленного реагента обнаружения 2 (в буфере). Инкубируйте в течение 30 мин при комнатной температуре, встряхивая при 450 об/мин, во тьме. Промойте один раз.
5. Для получения данных, ресуспендируйте образцы в 200 мкл буфера. Обзор рабочего процесса анализа показан в Рисунке 1.

4. Получение данных и анализ

1. Получите данные на цитометре в потоке, оснащенном синим и красным лазерами (требуются каналы PE, FITC и APC). При работе с цитометрами в потоке MACSQuant используйте шаблоны Режима Express для полностью автоматизированной установки ворот и анализа данных.
2. В качестве альтернативы загрузите файлы данных FSC или MQD в веб-инструмент InspectoR, который выполняет автоматизированное количественное измерение цитокинов и предоставляет готовые к экспорту результаты независимо от используемого инструмента.
3. Убедитесь, что правильно разделяются 12 различных популяций захватывающих перликов в канале FITC по сравнению с PE.
4. Примените стандартную кривую для расчета концентраций цитокинов, экспортируйте и визуализируйте результаты.
5. Для получения данных на цитометре в потоке MACSQuant используйте 2D-штрихкод флакона с захватывающими перликами, который содержит все необходимые параметры получения данных.
   1. После входа в программное обеспечение выберите MACSPlex Filter Plate в качестве рейки образцов и нажмите кнопку Штрихкод на панели инструментов, чтобы активировать считыватель 2D-кодов.
   2. Поднесите флакон к считывателю, убедитесь, что код смотрит на мигающую лампочку на оптимальном расстоянии от 0,5 до 2,5 см.
   3. На вкладке Автометка присвойте Capture Beads (MPx Cyt T-NK,h) и NoLabel. Для сериальных разбавлений стандарта цитотоксических Т/НК-клеток определите позиции групп, а на вкладке Параметры выберите Режим Express с Тип: Ан

Results

Идентификация представительных популяций микрогранул, кодирующих 12 растворимых анализируемых веществ

Популяции микрогранул были идентифицированы с помощью каналов FITC и PE цитометра. Отдельные кластеры микрогранул, представляющие индивидуальные анализируемые вещества, были четко разделены на двухосевом графике, включая IL-10, Гранзим B, МКП-1, IL-17A, Перфорин, IL-2, IL-6, IFN-γ, TNF-α, IL-21, IL-4 и GM-CSF (Рисунок 2). Каждая популяция демонстрировала уникальную флуоресцентную сигнатуру, подтверждая успешное множественное обнаружение и четкую дифференциацию измеренных цитокинов и эффекторных молекул.

Рисунок 2: Обнаружение представительных множественных популяций микрогранул. Микрогранулы содержат ингиренные интенсивности флуоресценции, которые могут быть использованы для различения различных популяций, специфичных к анализируемому веществу. На графике рассеивания показано разделение сигналов, специфичных для анализируемых веществ, на основе интенсивности флуоресценции в каналах FITC (B1) и PE (B2). На изображении представлен профиль 12 популяций микрогранул, кодирующих GM-CSF, Гранзим B, IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21, МКП-1 (CCL2), Перфорин и TNF-α. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этого рисунка.

Представительный профиль концентрации цитокинов клеток CAR T после сокультивации с опухолевыми клетками

После сокультивации клеток CAR T с опухолевым объектом-мишенью концентрации цитокинов были определялись с использованием панели человеческой цитотоксичности множественного анализа (Рисунок 3). Клетки CAR T секретировали высокие уровни Гранзима B (49 950,2 пг/мл), IFN-γ (48 367,8 пг/мл), TNF-α (7 055,2 пг/мл) и GM-CSF (6 653,5 пг/мл), что указывает на сильную активацию и цитотоксическую эффекторную функцию в ответ на взаимодействие с опухолью. Уровни IL-2 превысили верхний предел обнаружения (>10 000 пг/мл), что соответствует сильной пролиферативной сигнализации. Образец не разбавлялся и не повторно измерялся. Напротив, цитокины, ассоциированные с регуляторными или альтернативными реакциями вспомогательных Т-клеток, включая IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21 и МКП-1, были присутствовали на низких или почти необнаруживаемых уровнях. Эти результаты предполагают, что клетки CAR T проявляли преимущественно тип 1 (Th1/цитотоксический) иммунный ответ, характеризующийся высокой эффекторной активностью и ограниченным производством иммуноподавляющих цитокинов.

Рисунок 3: Представительный профиль цитокинов клеток CAR T после сокультивации с опухолевыми клетками. Инженерные клетки CAR T были сокультивированы в течение ночи с опухолевыми клетками JeKo-1. Супернатанты клеточной культуры собирались после 16 часов инкубации и центрифугировались для удаления частиц. Разбавленные образцы анализировались с использованием панели человеческой цитотоксичности множественного анализа. Были проведены две стандартные кривые, и были определены концентрации всех 12 анализируемых веществ. Показан представительный вывод данных для анализа и расчета концентраций, специфичных для анализируемых веществ, с использованием Express Mode цитометра. График и сопровождающая таблица показывают рассчитанные уровни (пикограмм/миллилітр) 12 эффекторных молекул. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этого рисунка.

Кинетика секреции цитокинов клеток CAR T после антиген-специфической стимуляции

После сокультивации клеток CAR T с клетками-мишенью, выражающими (Антиген⁺) или не имеющими (Антиген⁻) соответствующего антигена, секреция цитокинов мониторирулась со временем с использованием панели человеческой цитотоксичности множественного анализа. Клетки CAR T демонстрировали

Discussion

Мультиплексный анализ использовался для определения профиля растворимых реакций иммунных медиаторов в культурах CAR-T-клеток. CAR-T-клетки, культивированные совместно с антиген-положительными клетками-мишенями, показали увеличенное выделение ИФН-γ, ТНФ-α, ГМ-КСФ, Гранзима В и ИЛ-2, что соответствует активации эффекторов и цитотоксической функции^4,5,8. Напротив, антиген-отрицательные контроли демонстрировали низкое производство цитокинов, что подтверждает способность анализа дифференцировать антиген-специфические реакции в тестируемых условиях^5,8. Эти результаты подтверждают применимость анализа для оценки функциональности CAR-T-клеток, включая его использование в анализах, связанных с потенциальностью, профилированием безопасности и механистическими исследованиями.

Хотя фиксированная 12-анализаторная панель обеспечивает широко охватывающий обзор иммунной активности CAR-T-клеток, она может быть непрактичной для захвата полного спектра аналитиков во всех применениях. Для целевых рабочих процессов, таких как валидация анализа или контроль качества (QC) продуктов CAR-T-клеток, панель можно сократить до сокращенного подмножества (например, ИЛ-2, ИФН-γ и ТНФ-α), чтобы упростить анализ, сохраняя функциональную чувствительность^1,2.

Критические шаги в протоколе включают разработку культуры CAR-T-клеток и соответствующий выбор условий выборки. В частности, длительность культуры и количество эффекторных клеток (соотношение E:T) прямо определяют амплитуду цитокинов и должны быть определены при настройке анализа^5,6. Кроме того, разбавление образца должно быть корректировано, чтобы убедиться, что концентрации аналитиков попадают в динамический диапазон анализа^1,2. Поэтому отладка должна сосредоточиться на проверке производительности стандартной кривой и корректировке условий культуры или факторов разбавления, если сигналы выходят за пределы измеряемого диапазона^1,2.

По сравнению с традиционными однокомпонентными ELISA, мультиплексная платформа на основе проточной цитометрии создает наборы данных с высокой плотностью и множеством аналитиков из минимальных объемов образцов. Обеспечивая одновременное измерение нескольких аналитиков в одном образце, мультиплексирование может сократить общее потребление реагентов, увеличить пропускную способность образцов и сократить время анализа по сравнению с выполнением нескольких однокомпонентных анализов^1,2. Автоматизированные варианты сбора и стандартизированного анализа могут потенциально сократить зависимость от пользователя и поддерживать воспроизводимость и масштабируемость в экспериментальных или производственных условиях^5,8. Типичная чувствительность обнаружения в стандартных ELISA варьируется от 16 до 2000 пг/мл (может быть ниже для высокочувствительных комплектов)⁷. В представленной в этом исследовании платформе наименьшие обнаруживаемые концентрации варьируются от 0,05 пг/мл для самых чувствительных аналитиков до примерно 93,8 пг/мл для тех, у которых исконная чувствительность анализа ниже. В рамках внутренних оценок более 74% измеренных аналитиков демонстрировали пределы обнаружения ниже 5 пг/мл, а 38% были обнаружены ниже 1 пг/мл, подчеркивая общую чувствительность системы. Так как мультиплексная чувствительность может варьироваться для разных цитокинов, потенциальное соревнование эпитопов остается важным аспектом. Чтобы минимизировать такие помехи, анализ использует непересекающиеся эпитопи для захвата и обнаружения каждого анализируемого вещества, тем самым сокращая предвзятость, связанную с конкуренцией, и улучшая надежность измерений в мультиплексных условиях.

Производительность мультиплексного анализа может варьироваться в зависимости от аналитиков в зависимости от чувствительности анализа и биологического контекста, и при определенных условиях концентрации аналитиков могут приближаться к верхнему пределу обнаружения, поэтому их следует оценивать при настройке анализа. Напротив, некоторые аналитики (например, МКП-1 и ИЛ-4 в этом исследовании) могут оставаться необнаружимыми в зависимости от экспериментальных условий. Кроме того, преданалитические факторы, такие как обработка образцов, могут влиять на измерения цитокинов, и должны поддерживаться согласованные условия обработки, чтобы обеспечить сравнимость.

В целом, это

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MACSPlex Cytotoxic T/NK Cell Kit, human	Miltenyi Biotec	130-125-800	Мультиплексный анализ цитокинов на основе микрочастиц для проточной цитометрии
MACSPlex InspectoR Tool	Miltenyi Biotec	\	Веб-инструмент для автоматического выбора и анализа данных MACSPlex
MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer	Miltenyi Biotec	130-096-343	Прибор для проточной цитометрии с измерением мультиплексных данных
MACSQuant Analyzer 16 Flow Cytometer	Miltenyi Biotec	130-109-803	Прибор для проточной цитометрии с измерением мультиплексных данных
MACSQuant Express Mode	Miltenyi Biotec	\	Программное обеспечение для автоматического выбора и анализа
TexMACS Medium	Miltenyi Biotec	130-097-196	Оптимизированная безсывороточная среда для культивирования и размножения человеческих и мышьих Т-клеток