Механизм применения порошка эрмяо при лечении простатита: исследование, основанное на сетевой фармакологии и экспериментальной верификации

Краткое содержание

Используя подход сетевой фармакологии, это исследование показало, что порошок Эрмяо оказывает терапевтическое действие при простатите, подавляя воспалительные факторы и связанные с ними сигнальные пути. Последующие эксперименты in vitro дополнительно показали, что его водный экстракт значительно подавляет экспрессию ключевых воспалительных цитокинов в модели, индуцируемой LPS, эпителиальных клеток простаты.

Аннотация

Этот протокол представляет собой комбинированный подход к сетевой фармакологии и экспериментальной валидации для изучения механизма действия порошка Эрмяо (ЭМИ) в лечении простатита. Рабочий процесс выполнен поэтапно: (i) скрининг активных соединений и целей на базе данных, (ii) построение и анализ сетей взаимодействия, и (iii) экспериментальная валидация in vitro . Во-первых, активные компоненты ЭМИ и соответствующие им мишени были извлечены из базы данных TCMSP, а связанные с простатитом мишени — из базы данных GeneCards. Для выявления ключевых терапевтических целей использовалось пересечение ЭМИ-мишень и заболеваний. Во-вторых, с использованием Cytoscape была создана сеть «Лекарство–Активное вещество–Цель–Заболевание». Анализ взаимодействия белков и белков (PPI) и обогащение путей Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG) были проведены на ключевых целях, что показало, что воспалительные факторы, такие как IL6 и TNF, служат основными мишенями, а пути, включая PI3K/AKT и MAPK, были значительно обогащены. Наконец, валидация in vitro проводилась с использованием индуцированной LPS-индуцированной воспалительной модели эпителиальных клеток простаты. Лечение ЭМП значительно снизило выделение провоспалительных факторов IL-6 и TNF-α по сравнению с группой, обработанной ЛПС (p < 0,05), что подтвердило противовоспалительную эффективность ЭМП. Этот интегративный подход предоставляет воспроизводимую основу, которую можно адаптировать для изучения других многокомпонентных терапевтических систем. В заключение это исследование предварительно выясняет, что ЭМИ оказывает свои антипростатитные эффекты с помощью многокомпонентного, многоцелевого и многопутного механизма, тесно связанного с подавлением воспалительных реакций, что предоставляет научную основу для его клинического применения.

Введение

Простатит, особенно хронический небактериальный простатит, представляет собой распространённое урологическое заболевание, характеризующееся сложной этиологией и отсутствием высокоэффективных методов лечения, что создаёт значительную нагрузку на качество жизни^{пациентов 1,2,3}. Современное клиническое лечение простатита использует интегрированный подход, включающий антибиотики, блокаторы α-рецепторов и нестероидные противовоспалительные^{препараты 4,5,6}. Основные проблемы включают отсутствие этиологически специфических терапий и сложное взаимодействие между психологическими факторами и физическими симптомами, что в совокупности способствует неудовлетворительным результатам лечения и частому^{рецидиву 7}. В последние годы интегративные медицинские подходы, такие как акупунктура и фитотерапия, широко применяются в лечении простатита и демонстрируют многообещающую эффективность. Безопасность и эффективность этих терапевтических подходов подтверждены серией высококачественных научных доказательств 8,9,10,11,12.

В этом контексте формулы традиционной китайской медицины (ТКМ), такие как порошок Эрмяо (ЭМИ), известные своими противовоспалительными и детоксикационными свойствами, предлагают перспективный альтернативный терапевтический^подход 13,14,15. Однако точные фармакологические механизмы, лежащие в основе эффективности ЭМИ против простатита, остаются неполностью прояснены, главным образом из-за его многокомпонентного характера. Появление сетевой фармакологии предоставляет мощный инструмент для расшифровки сложного режима действия «многокомпонентного, многоцелевого, многопутного», характерного для формул ТКМ^16,17. Наша стратегия заключалась в выявлении активных компонентов ЭМИ и её потенциальных целей, а затем в анализе сети для определения ключевых целей и путей. Последующие эксперименты были проведены для биологической проверки противовоспалительных эффектов и основных механизмов с целью создания научной основы применения ЭМИ. Это исследование вводит комбинированную рамку валидации сетевой фармакологии и экспериментов, которая улучшает механистическую интерпретацию многокомпонентных терапий

Протокол

Этическое одобрение для этого исследования не требовалось, так как оно не включало участников человека или клинических образцов. Все процедуры, связанные с клетовыми линиями, проводились в соответствии с институциональными рекомендациями и нормативами по биобезопасности. Клеточная линия эпителиальной клетки предстательной железы, использованная в этом исследовании, была получена у сертифицированного коммерческого поставщика.

ПРИМЕЧАНИЕ: Все реагенты, приборы и программное обеспечение, использованные в этом исследовании, перечислены в Таблице материалов. Блок-схема этого исследования представлена на рисунке 1.

1. Отбор активных ингредиентов

1. Получите доступ к базе данных TCMSP.
2. Выберите «Название травы» в поле поиска, введите «Huangbo» и нажмите «Поиск».
3. Нажмите фильтр «OB», установите «≥30» и подайте заявку.
4. Нажмите фильтр «DL», установите «≥0.18» и подайте заявку.
5. Скопируйте отфильтрованные результаты в таблицу Excel.
6. Применяйте тот же метод скрининга для получения активных компонентов «Цанчжу».
7. Удалите дублирующиеся активные компоненты, импортировав все наборы данных в Microsoft Excel (версия 2019) и объединив составные списки в формате Excel.
8. Удалять дублирующиеся активные компоненты, стандартизируя названия соединений и выявляя идентичные записи. Когда несколько записей соответствовали одному и тому же соединению, сохранялась только одна представительная запись.
9. Установите ассоциации между «хуанбо», «цанчжу» и активными ингредиентами.

2. Получить целевые компоненты, соответствующие активным компонентам

1. Получите доступ к базе данных TCMSP.
2. Выберите «Химическое имя» в поисковой строке, введите активные ингредиенты и нажмите «Поиск».
3. Скопируйте имя Target, соответствующее каждому активному ингредиенту.
4. Удалить дублирующиеся имена целевых компонентов и установить ассоциации между активными ингредиентами и названиями целевых целей.
5. Получите доступ к базе данных UniProt (https://www.uniprot.org/)¹⁸, получите официальные символы гена для каждого имени Target и систематически заменяйте их.

3. Приобретение целей для заболеваний

1. Доступ к базе данных GeneCards (https://www.genecards.org)¹⁹.
2. Введите «Prostatitis» в поле поиска и нажмите на иконку поиска, чтобы получить соответствующий список генов.
3. Сортируйте гены в убывающем порядке по показателю релевантности.
4. Экспортируйте соответствующие гены в формате Excel.
5. Мишени с показателем ≥1 были выбраны как цели, связанные с простатитом.

4. Подготовка к созданию сети регулирования активного вещества и мишеней заболеваний

1. Определите пересечение мишеней, связанных с активными ингредиентами, и мишенями, связанными с простатитом, и определите их как цели ЭМП для лечения простатита.
2. Установите связь между активными ингредиентами и терапевтическими целями ЭМИ при простатите.
3. Создайте файл Excel с названием «Network» с первыми тремя столбцами «Node1», «Node2» и «Net».
4. Вставьте ассоциации между ЭМИ и препаратом в столбцы «Node1» и «Node2», при этом введите «drug» в столбце «Net» для всех строк.
5. Вставьте ассоциации с активным веществом в столбцы «Node1» и «Node2», введя «ингредиент» в столбце «Net» для всех строк.
6. Заполните столбцы «Node1» и «Node2» ассоциациями активного ингредиента и мишени для целей ЭМИ при лечении простатита, при этом в столбце «Net» введён «target».
7. Вставьте терапевтические цели ЭМП при простатите в столбец «Node1», введя «prostatitis» в столбце «Node2» и «disease» в столбце «Net» для всех строк.
8. Сохраните файл Excel «Network» в формате txt.
9. Создайте файл Excel с названием «Type» с первыми двумя столбцами «Node» и «Type».
10. Заполните столбец «Node» словом «EMP», а в столбце «Type» введите «formula».
11. Введите в колонку «Узел» «Хуанбо» и «Цанчжу»; Введите «drug» в столбце «Type» для всех строк.
12. Введите активные ингредиенты в столбец «Узел », а также «ингредиент» в столбце «Тип» для всех соответствующих строк.
13. Заполните столбец «Узел» терапевтическими целями ЭМП при простатите, при этом «цель» введётся в колонку «Тип».
14. Введите мишени, связанные с простатитом, в столбец «Узел», а в столбце «Тип» — «заболевание» для всех соответствующих строк.
15. Сохраните файл Excel «Type» в формате .txt.

5. Визуализация регуляторной сети «Активное вещество-лекарство — таргет-болезнь» компанией Cytoscape

1. Запусти Cytoscape.
2. Перейдите в «File > Import > Network from File System» и откройте файл «network.txt».
3. Откройте панель «Стиль». Выберите «Форма», выберите «Тип» в выпадающем меню «Столбца» и установите «Тип отображения» на «Дискретное отображение».
4. Присваивать различные формы узлов следующим категориям: формула, лекарство, ингредиент, мишень, болезнь.
5. Выберите «Цвет заполнения», выберите «Тип» в выпадающем меню «Столбец» и установите «Тип отображения» на «Дискретное отображение».
6. Определите различные цвета узлов по следующим категориям: смесь, лекарство, ингредиент, мишень, заболевание.
7. Выберите «Высота» и «Ширина», выберите «Тип» из выпадающего меню «Столбца» и установите «Тип отображения» на «Дискретное отображение».
8. Определите размеры узлов по следующим категориям: смесь, лекарство, ингредиент, мишень, заболевание.
9. Выберите «Label Font Size», выберите «Type» в выпадающем меню «Column» и узначите «Typping Type» на «Discrete Mapping».
10. Назначьте разные размеры шрифтов на этикетах следующим категориям: формула, лекарство, ингредиент, цель, заболевание.
11. Ручное перемещение узлов для оптимизации структуры сети.
12. Перейдите в «File > Export > Network Image to File» и сохраните сеть как образ.

6. Анализ и визуализация сетей PPI

1. Получите доступ к https://cn.string-db.org/ и перейдите в модуль «Множественные белки».
2. Введите список целевых генов в поисковую строку, выберите «Homo sapiens» как организма и нажмите «Поиск».
3. После загрузки результатов нажмите «Продолжить».
4. Откройте панель «Настройки», установите «минимально требуемый балл взаимодействия» на «high confidence (0.700)» и отметьте «скрыть отключённые узлы в сети».
5. Нажмите «Update», затем экспортируйте данные ассоциации PPI в формате TSV через меню «Экспорт».
6. Запустите Cytoscape, перейдите в меню «Файлы» и выберите «Импортировать сеть из файловой системы», чтобы открыть ваш TSV-файл.
7. Перейдите в меню «Инструменты», затем выберите «NetworkAnalyzer > Network Analysis > Network Interpretation > Считать сеть ненаправленной».
8. Перейдите в меню «Файл», выберите систему «Экспортировать таблицу в файл» и экспортировать сетевые данные.
9. Перейдите в панель «Стиль» и настройте атрибуты «Форма», «Цвет заполнения», «Высота» и «Ширина».
10. Скорректируйте структуру сети PPI, переместив узлы.
11. Перейдите в меню «Файл», выберите «Экспортировать изображение сети в файл» и экспортируйте визуализированную сеть как изображение.
12. Откройте экспортированные данные сети PPI с помощью WPS и отсортируйте их в убывающем порядке по столбцу «Степень».
13. Выберите топ-20 отсортированных целей, сгенерируйте столбчатую диаграмму и сохраните график в виде изображения.

7. Анализ обогащения путей KEGG

1. Откройте терминал или командную строку, введите R и нажмите Enter.
2. В консоли R выполняйте следующие команды одну за другой:
   install.packages(c("RSQLite", "colorspace", "stringi", "BiocManager"))
   BiocManager::install(c("org. Hs.eg.db", "DOSE", "clusterProfiler", "pathview"))
3. Преобразовать генные символы целей ЭМИ для лечения простатита в Entrez ID с помощью org. Hs.eg.db.
4. Читайте идентификаторы Entrez и проведите анализ обогащения KEGG с помощью пакета clusterProfiler с параметрами: organism = "has", pvalueCutoff = 0,05, qvalueCutoff = 0,05.
5. После удаления человеческих заболеваний и связанных с метаболизмом путей из полученных результатов анализа обогащения KEGG оставшиеся пути сортируйте по количеству обогащённых генов.
6. Установите связь между 15 лучшими сигнальными путями и целями.
7. Подготовьте двухстолбочный файл с ассоциациями «путь» и «цель», затем импортируйте его в Cytoscape через «File > Import > Network from File».
8. Задайте формы и цвета узлов, чтобы отличать пути от целей с помощью панели «Стиль».
9. Корректируйте макет вручную и экспортируйте сеть в виде изображения.

8. Фармацевтическая подготовка

ПРИМЕЧАНИЕ: Формула EMP состоит из 15 г коры Phellodendri Chinensis (Хуанбо) и 15 г ризомы Atractylodis (Cangzhu). Для получения экстракта в последующих экспериментах на клетках использовался метод экстракции воды и осадки^{спирта 20}.

1. Погрузите препарат в 10-кратную массу воды на 1 час.
2. Декокт в течение 1 часа, затем фильтруйте через марлю, чтобы получить напой.
3. Добавьте в препарат 10-кратную массу воды снова, отварите 30 минут и профильтруйте через марлю, чтобы получить напой.
4. Добавьте в препарат 10-кратную массу воды ещё раз, проварите 30 минут и профильтруйте через марлю, чтобы получить напой.
5. Комбинируйте три фильтрованных навари, затем фильтруйте смесь через фильтрующую бумагу.
6. Концентрируйте напой под пониженным давлением до 10% от исходного объёма.
7. Охладите концентрат, медленно добавьте этанол до 75% при помешиваниях, затем запечатайте и храните при 4 °C в течение 12 часов.
8. Центрифугуйте смесь и соберите супернатант.
9. Продолжайте дистилляцию под пониженным давлением.
10. Наконец, лиофилизируйте продукт с помощью вакуумной сублиозационной сушилки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лиофилизированный порошок можно хранить при –20ºC до 3 месяцев, что служит безопасной точкой паузы. В продолжение — по мере необходимости восстанавливайте порошок в соответствующем растворителе.

9. Оттаивание клеток и культивирование

ПРИМЕЧАНИЕ: Купленные элементы доставлялись в лабораторию на сухом льду. Перед началом эксперимента заранее подготовили Keratinocyte Serum Free Medium (K-SFM) путём дополнения к нему рекомбинантного эпидермального фактора роста человека (rEGF) до конечной концентрации 5 нг/мл, экстракта гипофиза крупного рогатого скота до конечной концентрации 50 мкг/мл и 1% пенициллин-стрептомицина.

1. Активируйте водяную баню и отрегулируйте температуру до 37 °C.
2. Вынимите клетки из сухого льда и немедленно перемешайте их в водяной бане, пока они полностью не оттают.
3. Добавьте 5 мл K-SFM к ячейкам. Аккуратно перемешайте, затем центрифугуйте смесь (4 °C, 500 × г, 5 минут).
4. Удалите супернатант и снова подвесьте гранулу в полном K-SFM.
5. Перенесите клетки в термофлягу T-25 и поместите их в инкубатор для клеточной культуры.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Экологические параметры инкубатора клеточной культуры поддерживались на уровне 37 °C, 5% CO₂ и относительной влажности ≥ 95%.

10. Клеточная субкультура

ПРИМЕЧАНИЕ: Субкультурирование проводилось, когда слияние клеток достигало 80–90% с соотношением субкультуры 1:2 к 1:3.

1. Аспирируйте субкультурную среду в супернатате, затем дважды промывайте клетки с помощью PBS без кальция и магния.
2. Введите 2 мл трипсин-ЭДТА и дайте клеткам постоять 3 минуты для ферментативной диссоциации.
   ВНИМАНИЕ: Этот протокол включает использование опасных реагентов, включая липополисахарид (LPS), хлороформ, этанол и реагент TRIzol. Все процедуры, связанные с опасными химикатами, должны проводиться в сертифицированной вытяжке с химическими выбросами при ношении соответствующих средств индивидуальной защиты (лабораторный халат, перчатки и защитные средства для глаз). Биологические материалы должны обращаться в соответствии с институциональными рекомендациями по биобезопасности.
3. Добавьте K-SFM среду с 10% сывороткой из плода для прекращения пищеварения.
4. Перенесите смесь в центрифугу на 15 мл в центрифугу (4 °C, 500 × г, 5 минут) и удалите супернатант.
5. Клеточная гранула была вновь суспендирована в полном K-SFM и впоследствии перемещена в новые колбы для культуры.

11. Определение максимальной концентрации медикаментозного лечения с помощью анализа МТС

ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая концентрация препарата была протестирована с помощью 5 технических репликатов.

1. Переваривать клетки RWPE-1 в логарифмической фазе роста.
2. Суспензировать клетки в полной K-SFM-среде, затем определить концентрацию клетки с помощью подсчёта.
3. Отрегулировать суспензию ячейки до плотности 1 × 10⁵ элементов/мл при полном K-SFM среде.
4. Введите суспензию ячейки в пластину на 96 лунок с 100 мкл на каждую скважину.
5. Пластина на 96 лунок была помещена в инкубатор для культивирования клеток.
6. Через 24 часа, когда клетки полностью приклеились, культурная среда аспирировала и выбросилась.
7. Замените среду на полную K-SFM среду с разными концентрациями раствора ЭМИ.
8. Поставьте пластину обратно в инкубатор для клеточной культуры ещё на 24 часа инкубации.
9. Аспирируйте среду, затем дважды промывайте клетки с помощью PBS.
10. Добавьте 100 мкл полной среды K-SFM в каждую яму, затем инкубировать пластину в инкубаторе клеточной культуры ещё 4 часа.
11. Впустите 10 мкл раствора MTS в каждую скважину и определите OD на 490 нм после 1 часа инкубации.
12. Используя пустую контрольную группу (клетки, культивируемые в полной среде без стимуляции ЛПС или медикаментозного лечения) в качестве исходного уровня, была рассчитана пролиферация клеток при каждой концентрации лечения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Самая высокая концентрация, не проявившая значимого влияния на пролиферацию клеток, была определена как лечение с высокими дозами, за которой следовала половина концентрации как средняя доза, а четвертная концентрация — как лечение низкой дозы.

12. Клеточное вмешательство

1. Переваривать клетки RWPE-1 в логарифмической фазе роста.
2. Клетки были вновь суспендированы в полной среде K-SFM, а концентрация клеток определялась с помощью подсчёта клеток.
3. Суспензия ячейки была отрегулирована до плотности 5 × 10⁵ элементов/мл с использованием полной среды K-SFM.
4. Ячейка-суспензия была засеяна в пластину с 6 лунками по 2 мл на каждую скважину.
5. Пластину помещали в культурный инкубатор и инкубировали 12 часов для обеспечения клеточной адгезии.
6. Клетки обрабатывались с низкой (150 мкг/мл), средней (300 мкг/мл) и высокой дозой (600 мкг/мл) соответственно с концентрациями ЭМИ.
7. Через 1 час в культурную среду добавляли раствор 10 мкг/мл LPS.
8. После 24 часов лечения супернатант был собран для ELISA, а клетки были взяты для RT-PCR-анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: LPS был выбран для индуцирования воспалительного ответа благодаря хорошо зарекомендовавшей способности активировать провоспалительные сигнальные пути в эпителиальных клетках простаты; концентрация (10 мкг/мл) была выбрана на основе предыдущих исследований, демонстрировавших устойчивую индукцию цитокином.

13. Выделение общей РНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить деградацию РНК, на протяжении всей экспериментальной процедуры носили перчатки и маски, а также использовали наконечники пипеток без РНазы и центрифугные трубки.

1. После вмешательства промыйте клетки дважды с помощью PBS.
2. Добавьте 1 мл реагента Тризола в клетки и многократно смешивайте его пипеткой для обеспечения гомогенизации.
   ВНИМАНИЕ: Выполнять все процедуры в вытяжке с химическим дымом при ношении соответствующих средств индивидуальной защиты.
3. Перенесите лизат в микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл и дайте ему инкубироваться при комнатной температуре в течение 15 минут.
4. Затем добавьте 0,2 мл хлороформ и энергично завихрьте образец.
5. После того как образец настоялся при комнатной температуре 5 минут, центрифугуйте образец при 10 000 × г в течение 15 минут при 4 °C.
6. После центрифугирования аккуратно перенесите верхнюю бесцветную водную фазу в свежую микроцентрифугную трубку.
7. Введите равный объём предварительно охлаждённого изопропанола, тщательно перемешайте, затем инкубуйте при комнатной температуре в течение 10 минут.
8. Центрифугуйте образец ещё раз (4 °C, 10 000 × г, 10 мин), затем сбросьте жидкую фазу и удержите осадок.
9. Прополосните гранулу 1 мл предварительно охлаждённого этанола 75% и аккуратно подвесьте с помощью пипетирования.
10. Проведите финальную центрифугу при 4 °C и 7 500 × г в течение 10 минут, затем удалите супернатант и дайте РНК-грануле высохнуть на воздухе в биобезопасном шкафу.
11. Растворить очищенную РНК в 50 мкл воды, обработанной DEPC.
12. Определите концентрацию РНК, соотношение A260/A280 и соотношение A260/A230 с помощью спектрофотометра NanoDrop для оценки чистоты РНК и обеспечения минимального загрязнения белками и растворителями перед последующим анализом.

14. RT-PCR

1. Используйте 1 мкг общей РНК для подготовки системы обратной транскрипции объёмом 20 мкл.
2. Инкубировать реакционную систему при 42 °C в течение 15 минут, затем при 95 °C в течение 5 минут, затем остыть до 4 °C.
3. Разведите полученную кДНК в 10 раз с помощью дистиллированной воды.
4. Подготовьте систему ПЦР-реакции объёмом 20 мкл с использованием разбавленной кДНК.
5. Запрограммируйте термический циклер и установите начальное удержание на 95 °C в течение 60 секунд, затем 40 циклов по 95 °C в течение 15 с и 60 °C на 60 секунд.
6. Проведите анализ кривой плавления и запишите значения КТ для всех целевых и референсных генов после завершения.
7. Используйте метод 2^(-ΔΔCT ) для определения нормализованных уровней экспрессии целевых генов.

15. Анализ ELISA

ПРИМЕЧАНИЕ: Достаньте набор ELISA из хранилища и оставьте его уравновеситься при комнатной температуре в течение 30 минут перед использованием.

1. Подготовьте стандартный раствор согласно инструкции производителя и выполните соответствующие разведения для стандартов, биотинилированных антител, конъюгатов ферментов и буфера для промывки.
2. Центрифугуйте собранный субнатант клеточной культуры (4 °C, 10 000 × г, 10 минут) и собирайте супернатант.
3. Перенесите 100 мкл стандартных разбавлений и тестовых образцов в предварительно покрытые скважины.
4. Запечатайте колодцы клейкой лентой и инкубуйте пластину при 37 °C в течение 90 минут.
5. Сбросьте жидкость из колодец и помойте пластину с помощью автоматической мойки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Установите параметры автоматической шайбы на: 350 мкл буфера промывки на колодцу, 15-секундное время замачивания между дозированием и аспирацией, 5 полных циклов.
6. В каждую скважину введите 100 мкл рабочего раствора биотинилированных антител. Дайте инкубации при 37 °C в течение 60 минут.
7. Сбросьте раствор и помойте тарелку, как описано в статье 15.5.
8. Пипетка — 100 мкл фермента, конъюгированного рабочего раствора на скважину, затем инкубируют при 37 °C в течение 60 минут.
9. Сбросьте раствор и помойте тарелку, как описано в статье 15.5.
10. В каждую скважину добавьте 100 мкл хромогенного субстрата. Поддерживайте температуру 37 °C в течение 15 минут, защищая от света.
11. Пипетить 100 мкл стоп-раствора на каждую скважину, затем аккуратно перемешивать.
12. Немедленно измерьте оптическую плотность (OD) на 450 нм.
13. Установите стандартную кривую, построив средние значения OD по сравнению со стандартными концентрациями с помощью программного обеспечения Curve Expert.
14. Определите концентрацию каждого образца с помощью интерполяции из стандартной кривой с использованием её значения OD.

16. Статистический анализ

1. Управление программным обеспечением SPSS (версия 20.0).
2. Импортируйте набор данных в SPSS Statistics и правильно определите переменные. Используйте Analyze > Descriptive Statistics> Explore для вычисления среднего и стандартного отклонения (SD).
3. Используйте Analyze > Compare Means > односторонний ANOVA для сравнения нескольких групп.
4. Получите p-значения напрямую из таблиц выходных тестов и соответствуйте их отчёту.
5. Представить все результаты как среднее ± SD и рассмотреть различия статистически значимыми, когда p < 0,05.

Результаты

Идентификация активных соединений и прогнозирование целей

Эти результаты демонстрируют эффективность нашей интегрированной сетевой фармакологии и подхода in vitro для выявления и валидации терапевтических целей ЭМИ при простатите. Поиск в базе данных TCMSP выявил 46 биоактивных компонентов из составляющих трав ЭМИ, что соответствует 178 потенциальным целям. Из базы данных Genecards было получено 13 960 мишеней, связанных с простатитом...

Обсуждение

Этот протокол интегрирует сетевую фармакологию с экспериментальной валидацией, обеспечивая систематическую основу для изучения многокомпонентных терапевтических механизмов. Критически важные этапы включают точное скринингование активных соединений с использованием установленных порогов (OB ≥ 30%, DL ≥ 0,18), надёжную структуру сети и правильный выбор экспериментальных моделей валидации. Тщательный выбор параметров в биоинформатике и строгий контроль экспериментальных условий необходимы д...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Человек IL-6 ЭЛИЗА КИТ	4Abio	CHE0009
Человеческий TNF и альфа; ЭЛИЗА КИТ	4Abio	CHE0019
Дополнения K-SFM	Процелл	CM-0200
Липополисахариды	Solarbio	L8880
MTS	Promega	G1111
Система обратной транскрипции	Promega	A3500
RWPE-1	Процелл	CL-0200	RRID:CVCL_EQ24
Полная среда ячейки RWPE-1	Процелл	CM-0200
SYBR Green Realtime PCR мастер-микс	Тойобо	QPK-201
Реагент тризола	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	15596026
трипсин-ЭДТА	Gibco (Термо Фишер)	25200072