Методическая статья

Одноступенчатое перекрывающееся ПЦР для быстрого синтеза шаблонов ДНК с одним проводом для системы CRISPR

193 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70369

⸱

24 апреля 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Cytology and Genetics, School of Basic Medical Sciences, Hengyang Medical School, University of South China, 2Translational Medicine Institute, the First People's Hospital of Chenzhou, Hengyang Medical School, University of South China, 3National Health Commission Key Laboratory of Birth Defect Research and Prevention & Ministry of Education Key Lab of Rare Pediatric Diseases, Institute of Cell Biology and Genetics, School of Basic Medical Sciences, Hengyang Medical School, University of South China

В этой статье

Краткое содержание

Одноступенчатый перекрывающийся метод ПЦР с использованием четырёх праймеров позволяет быстро и недорого создавать шаблоны ДНК для транскрипции in vitro sgRNA. Оптимизированное соотношение праймеров (50:5:1:50) обеспечивает высококачественные sgRNA в течение 5 часов, при этом функциональная валидация демонстрируется через in vitro анализы и редактирование в HEK293T клетках.

Аннотация

Система CRISPR–Cas произвела революцию в редактировании генома; однако традиционные методы генерации однопроводной РНК (sgRNA) часто требуют трудоёмкие этапы клонирования или дорогие коммерческие наборы для синтеза. Оптимизированная стратегия одноступенчатого перекрывающегося ПЦР представлена для быстрого и экономичного синтеза шаблонов ДНК для транскрипции in vitro sgRNA. Используя четыре частично перекрывающихся праймера, охватывающих промотор T7, целенаправленную последовательность и sgRNA каркас, полноразмерные шаблоны собираются в одну реакцию ПЦР без клонирования. Систематическая экспериментальная оптимизация установила оптимальное соотношение праймеров (AF1:AF2:AF3:Tracr-R = 50:5:1:50), минимизируя неспецифические побочные продукты и максимизируя полный выход продукта, что подтверждается электрофорезом агарозного геля. Этот подход был успешно расширен для получения шаблонов для Staphylococcus aureus Cas9 (saCas9) sgRNA, что продемонстрировало межсистемную применимость за пределами Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9). Хотя прямой химический синтез sgRNA обладает такими преимуществами, как высокая чистота, химические модификации для повышения стабильности и снижение внецелевых эффектов, он остаётся непосильно дорогим для приложений с высокой пропускной способностью или крупномасштабных скринингов, требующих множества sgRNA. Анализы расщепления in vitro показали, что направляющие РНК, полученные этим методом, достигают редактирования, сопоставимую с традиционным плазмидным клонированием. Кроме того, рибонуклеопротеиновые комплексы, собранные с помощью этих sgRNA и доставленные в HEK293T клетки посредством электропорации, приводили к обнаружению индел в целевом локусе, подтверждая функциональность in vivo. Анализ стоимости показывает, что этот метод значительно снижает затраты на подготовку шаблонов по сравнению с коммерческими наборами для синтеза, одновременно сокращая время выполнения с дней до часов, обеспечивая доступный и масштабируемый подход для лабораторий, занимающихся генетическими исследованиями.

Введение

Система CRISPR–Cas, основанная на адаптивном иммунном механизме бактерий и архей, произвела революцию в генетической инженерии, позволив точное редактирование генома различныхорганизмов 1,2. Ключевым компонентом является однопутная РНК (sgRNA) — химерная РНК, направляющая Cas-нуклеазы в определённые геномные локусы; её модульная конструкция позволяет ретаргетировать посредством модификации примерно 20-нуклеотидной протоспейсернойпоследовательности 3. Помимо SpCas9, другие нуклеазы Cas с отличительными свойствами широко приняты. Staphylococcus aureus Cas9 (saCas9) меньше, облегчает доставку аденоассоциированного вируса (AAV) и тем самым расширяет возможностидоставки 4. Каждая система требует специфических архитектур направляющей РНК, что делает универсальный метод синтеза крайнежелательным. 3.

Традиционные методы генерации функциональных направляющих РНК включают клонирование на основе плазмид, коммерческие наборы для синтеза sgRNA или прямой коммерческий синтезsgRNA 5,6. Клонирование на основе плазмидных процессов требует нескольких трудоёмких этапов — рестрикционное переваривание, лигирование, трансформация и скрининг колоний — обычно занимая более 48часов 2,4,6. Коммерческие наборы sgRNA, хотя и предлагают упрощённый рабочий процесс (<5 ч), остаются непомерно дорогими для приложений с высокой производительностью, обычно оценивая 35–45 долларов за реакцию. Прямой химический синтез sgRNA обладает такими преимуществами, как высокая чистота, химические модификации для повышения стабильности и снижение внецелевыхэффектов 7; однако он слишком дорог (обычно $200–$280 за sgRNA) для применений с высокой пропускной способностью или крупномасштабных скринингов, требующих сотен sgRNA.

В отличие от этого, одноступенчатый перекрывающийся метод ПЦР, описанный здесь, завершает синтез шаблона менее чем за 5 часов с использованием стандартных праймеров стоимостью примерно $5–8 за sgRNA, что означает значительное сокращение как времени, так и материальных затрат. Кроме того, sgRNA, полученные этим методом, достигают эффективности редактирования, сопоставимой с плазмидным клонированием, что подтверждается анализами расщепления in vitro . Сравнение этих подходов показано на рисунке 1.

Расширение перекрытия ПЦР (OE-PCR) обеспечивает быструю, независимую от лигазы стратегию сборки фрагментовДНК 8. Этот подход адаптирован для синтеза шаблонов sgRNA с использованием перекрывающихся праймеров. В одноступенчатой реакции с использованием четырёх частично перекрывающихся праймеров происходит конкурентное связывание: внешние праймеры (AF1 и Tracr-R) определяют границы амплификации, а внутренние праймеры (AF2 и AF3) должны быть разбавлены для обеспечения упорядоченного протяжения с обоих концов к центру. Несмотря на эту теоретическую основу, критический параметр, влияющий на эффективность сборки — оптимальное соотношение праймеров — не был систематически изучен. Кроме того, более широкое применение таких методов OE-PCR в различных системах CRISPR остаётся недостаточно изученным.

Для устранения этих ограничений было разработано исследование по оптимизации и валидации одноступенчатого перекрывающегося метода ПЦР для синтеза шаблонов sgRNA. Оптимальное соотношение праймеров было установлено с помощью структурированного экспериментального дизайна, с использованием агарозного гелевого электрофореза для выявления условий, приводящих к единому продукту правильного размера. После оптимизации универсальность метода была оценена на двух широко используемых системах CRISPR (SpCas9 и saCas9), с успешной амплификацией обоих шаблонов. Функциональная валидация с использованием in vitro анализов расщепления показала, что sgRNA, созданные с помощью этого метода, достигают эффективности, сопоставимой с теми, что достигаются при плазмидном клонировании.

Для дальнейшей оценки функциональности в клеточном контексте SpCas9 sgRNA была комплексирована с белком Cas9 для формирования комплексов рибонуклеопротеинов (RNP) и доставлена в HEK293T клетки посредством электропорации. Редактирование генома в эндогенном локусе оценивалось с помощью анализа T7 эндонуклеазы I (T7EI), при этом паттерны расщепления на агарозных гелях указывают на обнаруженное образование индел in vivo. В совокупности эти результаты демонстрируют, что этот метод надёжно производит высококачественные функциональные шаблоны sgRNA. Следующий протокол описывает подробную процедуру с использованием SpCas9 как репрезентативного примера с шаблонами праймеров для адаптации к другим нуклеазам Cas.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Использование коммерчески доступной HEK293T клеточной линии (ATCC CRL-3216) проводилось в соответствии с этическим комитетом Первой народной больницы города Чэньчжоу, Университетом Южного Китая по использованию клеточных линий, полученных от человека. Используемые реагенты, программное обеспечение и оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Проектирование последовательностей мишей sgRNA

  1. Определите целевой геномный регион с помощью проверенных онлайн-инструментов (например, CRISPRscan, CHOPCHOP или CRISPick от Broad Institute)3.
  2. Доступ к веб-серверу CHOPCHOP находится в https://chopchop.cbu.uib.no/ 3,9.
  3. Введите информацию о целевом гене и выберите соответствующую систему CRISPR/Cas (например, EGFR для CRISPR/Cas9) (рисунок 2A).
  4. Изучите таблицу выводов, включая ранг, целевой последовательность, геномное местоположение, цепь, содержание GC (%), самокомплементарность, прогнозируемые внецелевые участки (MM0, MM1, MM2, MM3) и показатель эффективности (рисунок 2B).
  5. Выберите последовательность направляющей РНК с высокой эффективностью по цели и низкой прогнозируемой внецелевой активностью.
  6. Запишите финальную последовательность мишени sgRNA для проектирования капсули (например, последовательность мишень EGFR: «CTTAATTCCTTGATAGCGACGG») (рисунок 2B).

2. Синтез и подготовка четырёх перекрывающихся праймеров

  1. Спроектировать четыре олигонуклеотидных праймера (AF1, AF2, AF3, Tracr-R) с перекрывающимися областями следующим образом (рисунок 3A):
    AF1: 5′–TTCTAATACGACTCACTCACTATAG
    [цель следует] ГТТТТАГТАГТАГТААГАГАГааг — 3′
    AF2: 5′–GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT
    TAAATAAAGGCTAGTCCGTTATCAAC–3′
    AF3: 5′–GGCTAGTCCGTTATCAACTTG
    AAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCT–3′
    Tracr-R: 5′–AAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC–3′
    ПРИМЕЧАНИЕ: Замените [target seq] в капсуле AF1 на последовательность, полученную на шаге 1.6.
  2. Синтезируйте праймеры на шкале 25 нмоль с помощью стандартной очистки по обезсолённой системе.
  3. Засохшие грунты повторно суспензируют в воде без нуклеазы до запасной концентрации 100 мкм. Центрифуга при 5000 × г в течение 1 минуты при комнатной температуре.

3. Оптимизация концентрации праймера и ПЦР с одноступенчатым перекрытием для синтеза шаблонов sgRNA

  1. Подготовьте смеси для праймеров с изменяющимися концентрациями AF2 и AF3 согласно таблице 1. Поддерживайте AF1 и Tracr-R при 10 мкм.
  2. Подготовьте ПЦР-реакции в пробирках без нуклеазы объёмом 0,2 мл согласно Таблице 2. Используйте высокоточную ДНК-полимеразу.
  3. Аккуратно перемешивайте, пипетируя пять раз. Не создавайте вихрь. Центрифугуйте при 5000 × г в течение 1 минуты.
  4. Проведите ПЦР с использованием условий циклирования, описанных в таблице 3.

4. Электрофорез и восстановление ДНК-шаблонов

  1. Приготовьте 2% агарозный гель, растворив 2 г агарозы в 100 мл буфера 1× TAE. Остудите до 50–60 °C, добавьте 5 мкл нуклеиновой кислоты и отлийте гель.
  2. Дайте гелю затвердеть 30 минут при комнатной температуре.
  3. Загрузить 10 мкл ПЦР-продукт, смешанный с 2 мкл буфера по 6× нагрузки. Включить лестницу ДНК на 100 б.п.
  4. Проведите электрофорез при 100 В в течение 30–40 минут.
  5. Визуализируйте под ультрафиолетовым освещением. Подтвердите, что условие 9 (AF1:AF2:AF3:Tracr-R = 50:5:1:50) создаёт одну полосу ~120 bp (рисунок 4A).
  6. Используйте оптимизированные концентрации грунтов: AF1 10 мкм, AF2 1 мкм, AF3 0,2 мкм, Tracr-R 10 мкм.
  7. Вырезать целевой полосу стерильным скальпелем. Ограничить воздействие ультрафиолета до ≤30 секунд.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Храните гелевые ломтики при −20 °C до 1 недели или начинайте немедленно.

5. Очистка шаблонов ДНК

  1. Очистите ДНК с помощью набора для экстракции геля согласно инструкциям производителя10.
  2. Элютная ДНК в предварительно нагретой (60 °C) воде без нуклеазы объёмом 20–30 мкл.
  3. Измерить концентрацию ДНК. Типичный выход: 15–50 нг/мкл; A260/A280: 1,8–2,0.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Храните очищенную ДНК при −20 °C до 1 года.

6. Транскрипция in vitro и очистка sgRNA

  1. Собрать транскрипционную реакцию с помощью набора для синтеза РНК T7 (Таблица 4). Подготовить нальду 11.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте материалы без РНазы и очищайте все поверхности.
  2. Инкубировать при 37 °C в течение 16 часов.
  3. Добавьте 1 мкл ДНКазу I и инкубируете при 37 °C в течение 15 минут.
  4. Очистите sgRNA с помощью набора для очисткиРНК 12.
  5. Элюйте в воде без нуклеазы 30–50 мкл.
  6. Количественно оценить sgRNA. Ожидаемый выход: 700–900 нг/мкл; A260/A280: 1,9–2,1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Храните sgRNA при −80 °C до 1 года.

7. Анализ расщепления in vitro для подтверждения активности sgRNA

  1. Подготовьте и очистите целевую ДНК. Отрегулируйте концентрацию до 60 нг/мкл 13.
  2. Собрать реакцию расщепления (Таблица 5) — предварительно инкубировать без ДНК при 25 °C в течение 30 минут. Включить отрицательный контроль.
  3. Добавьте 1 мкл целевую ДНК.
  4. Инкубировать при 37 °C в течение 2 часов.
  5. Добавьте 4 мкл 6× буфера загрузки, чтобы остановить реакцию.
  6. Пропустите продукты на 2% агарозном геле при 100 В в течение 30–40 минут.
  7. Визуализируйте под ультрафиолетовым светом. Подтвердите расщепление (например, 617 bp → 414 bp + 203 bp) (рисунок 4C).

8. Клеточная валидация редактирования Cas9, управляемой sgRNA

  1. Подготовьте комплекс рибонуклеопротеина (RNP), смешав белок Cas9 и sgRNA в молярном соотношении 1:2. Объедините 10 мкл Cas9 (4 мг/мл), 280 мкл sgRNA (60 нг/мл) и 200 мкл DMEM. Инкубировать в течение 15 минут.
  2. Культура HEK293T клетки до ~80% совпадения. Собрать и скорректировать до 3 × 106 клеток на образец.
  3. Комбинировать комплекс RNP с клетками и инкубировать 10 минут при комнатной температуре.
  4. Перенесите на электропорационную кювету диаметром 2 мм. Электропорируйте при 115 В, 4 мс, один импульс (575 В/см). Немедленно добавьте 10 мл полной среды и переведите на пластину с 6 лунками.
  5. Инкубировать при 37 °C с 5%CO2 в течение 48 часов.
  6. Извлекать геномную ДНК из обработанных и контролируемых клеток. Измерять концентрацию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Храните ДНК при −20 °C до 6 месяцев.
  7. Усилить целевой локус с помощью ПЦР (Таблица 6 и Таблица 7).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемый размер продукта: 617 б.п. для EGFR.
  8. Проверьте ПЦР-продукты на 2% агарозном геле. Очистите правильную полосу и количественно оцените ДНК.
  9. Проведите формирование гетеродуплекса (таблица 8 и 9).
  10. Добавьте 1 мкл T7 эндонуклеазы I и инкубуйте при 37 °C в течение 15 минут. Инактивируйте при 85 °C на 10 минут.
  11. Добавьте загрузочный буфер и используйте 2% агарозный гель.
  12. Визуализируйте под ультрафиолетовым светом. Подтвердите образование инделя (617 п.п. → 414 п.п. + 203 п.п.) (Рисунок 4D).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Успешное применение одноступенчатого перекрывающегося протокола ПЦР позволяет получить одну чёткую полосу ДНК ожидаемого размера при анализе с помощью агарозного гелевого электрофореза.

Субоптимальные соотношения праймеров, особенно при чрезмерных концентрациях внутренних праймеров (AF2 и AF3), приводят к появлению дополнительных полос, превышающих ожидаемый продукт, что указывает на неспецифическое усиление или формирование праймер-димера, а также слабые поло...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Описан упрощённый, экономичный протокол синтеза шаблонов sgRNA ДНК с помощью одноступенчатой перекрывающейся ПЦР-стратегии. Этот метод устраняет необходимость в создании и клонировании плазмид, сокращая время подготовки шаблона с нескольких дней до примерно 5 час. Ключевым аспектом этого подхода является систематическая оптимизация коэффициента праймеров, определяемого как 50:5:1:50 (AF1:AF2:AF3:Tracr-R), соответствующего рабочим концентрациям 10 мкм, 1 мкМ, 0,2 мкм и 10 мкм соо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана проектом по исследованию здоровья Хунаньской провинциальной комиссии здравоохранения (грант номер W20243264), Фондом естественных наук провинции Хунань (номер гранта 2023JJ50368), ключевым исследовательским проектом Департамента образования провинции Хунань (грантовый номер 24A0607) и Инновационным командным проектом Первой народной больницы Чэньчжоу (грант номер CX202103).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
100 bp DNA LadderTIANGENMD109Маркер размера ДНК для электрофореза
2Taq Plus MasterMixCWBIOCW2849MРеагент для ПЦР-амплификации
50 bp DNA LadderTIANGENMD108Маркер размера ДНК для малых фрагментов
6DNA loading bufferTIANGEN1109565Буфер для загрузки образцов для электрофореза
Agarose Gel DNA Recovery KitTIANGENDP219Набор для очистки ДНК из агарозного геля
Agarose I Thermo Scientific 17850Приготовление агарозного геля
Broad Institute CRISPickhttps://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/publicИнструмент для проектирования sgRNA
CentrifugeHENGNUO2-16RЦентрифугирование образцов
Certified Copper Fetal Bovine SerumUmedium, Beijing BioTopped Technology Co., Ltd3023AДобавка для культуры клеток
CH3CO2HShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdA758682Реактивы для приготовления буферного раствора TAE
CHOPCHOPhttps://chopchop.cbu.uib.no/Инструмент для проектирования sgRNA
CO2 incubatorThermo Scientific51032874Инкубация культур млекопитающих
CRISPRscanhttps://www.crisprscan.org/Инструмент для проектирования sgRNA
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)KeyGEN BioTECHKGL1211-500Среда для культуры клеток
dsDNaseThermo Scientific EN0771Удаление ДНК-шаблона после транскрипции
ECM 830 Square Wave Electroporation SystemBTXECM830Электропорация клеток
EDTA Na2BioSharpBS108Реактивы для приготовления буферного раствора TAE
Electric thermostatic water bathSHANGHAI SUMSUNG LABORATORY INSTRUMENT CO.,LTDDKD8Инкубация с контролем температуры
Electrophoresis Apparatus TrophoresisLIUYIDYCP-31BNЭлектрофорез в агарозном геле
Gel Imaging analysis systemShanghHai JiaPengZF-258Визуализация и изображение геля
GenCRISPR SpCas9GenScriptZ03624-GMP-2.5Кас9 нуклеаза для редактирования генома
Genomic DNA extraction kitTIANGENYDP304Изоляция геномной ДНК
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis KitNEBE2040SИн витро транскрипция sgRNA
MiniAmp ThermocyclerThermo Scientific A37834ПЦР-амплификация
NanoDrop 2000c SpectrophotometerThermo Scientific 2000cКоличественное определение нуклеиновых кислот
Nucleic acid stain (e.g., GeneRed)TIANGENRT211Визуализация ДНК в агарозном геле
PCR Using Q5 Quick-Load High-Fidelity 2X Master MixNEBM0578ПЦР-амплификация с высокой точностью
Primers (AF1, AF2, AF3, Tracr-R)GenScriptОлигонуклеотиды для сборки матрицы sgRNA
Tris-baseBioSharpBS083Реактивы для приготовления буферного раствора TAE
VAHTS RNA Clean BeadsVAHTSN412-01Очистка РНК

Ссылки

  1. Tamura, R., Kamiyama, D. CRISPR-Cas9-mediated knock-in approach to insert the GFP(11) tag into the genome of a human cell line. Methods Mol Biol. 2564, 185-201 (2023).
  2. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  3. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  4. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  5. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  6. Graf, R., Li, X., Chu, V. T., Rajewsky, K. sgRNA sequence motifs blocking efficient CRISPR/Cas9-mediated gene editing. Cell Rep. 26 (5), 1098 (2019).
  7. Hendel, A., et al. Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells. Nat Biotechnol. 33 (9), 985-989 (2015).
  8. Brunetti, L., et al. Highly efficient gene disruption of murine and human hematopoietic progenitor cells by CRISPR/Cas9. J Vis Exp. (134), e57278 (2018).
  9. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Res. 47 (W1), W171-W174 (2019).
  10. Bien, H. . Qiagen QIAquick gel extraction kit (28704 and 28706), centrifuge processing. , (2015).
  11. MalagodaPathiranage, K., Banerjee, R., Martin, C. T. A new approach to RNA synthesis: immobilization of stably and functionally co-tethered promoter DNA and T7 RNA polymerase. Nucleic Acids Res. 52 (17), 10607-10618 (2024).
  12. Xiao, G., et al. Direct detection from sputum for drug-resistant Mycobacterium tuberculosis using a CRISPR-Cas14a-based approach. BMC Microbiol. 25 (1), 188 (2025).
  13. Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions. Nucleic Acids Res. 16 (15), 7351-7367 (1988).
  14. Hu, Z., et al. Customized one-step preparation of sgRNA transcription templates via overlapping PCR using short primers and their application in vitro and in vivo gene editing. Cell Biosci. 9 (1), 25 (2019).
  15. Pan, C., et al. A new method to synthesize multiple gRNA libraries and functional mapping of mammalian H3K4me3 regions. Nucleic Acids Res. 51 (9), e52 (2023).
  16. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  17. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  18. Nageshwaran, S., et al. CRISPR guide RNA cloning for mammalian systems. J Vis Exp. (140), e57998 (2018).
  19. Basila, M., Kelley, M. L., Smith, A. V. B. Minimal 2'-O-methyl phosphorothioate linkage modification pattern of synthetic guide RNAs for increased stability and efficient CRISPR-Cas9 gene editing avoiding cellular toxicity. PLoS One. 12 (11), e0188593 (2017).
  20. Kratschmer, C., Levy, M. Effect of chemical modifications on aptamer stability in serum. Nucleic Acid Ther. 27 (6), 335-344 (2017).
  21. Maio, G., et al. Systematic optimization and modification of a DNA aptamer with 2'-O-methyl RNA analogues. ChemistrySelect. 2 (7), 2335-2340 (2017).
  22. Pasternak, A., et al. A chemical synthesis of LNA-2,6-diaminopurine riboside, and the influence of 2'-O-methyl-2,6-diaminopurine and LNA-2,6-diaminopurine ribosides on the thermodynamic properties of 2'-O-methyl RNA/RNA heteroduplexes. Nucleic Acids Res. 35 (12), 4055-4063 (2007).
  23. Shang, Z., et al. CRISPR/Cas12a with Universal crRNA for Indiscriminate Virus Detection. Molecules. 29 (24), 5842 (2024).
  24. Wang, Z., et al. crRNA scaffold remodeling controls CRISPR–Cas12a activity for enhanced performance. Nucleic Acids Res. 54 (5), 2310-2325 (2026).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

in vitro

Похожие статьи