Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение одиночных ядер из коронарной эндартеректомии пациентов с шунтированием коронарных артерий

699 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70382

⸱

3 апреля 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Biotechnology, Gujarat Biotechnology University, 2U. N. Mehta Institute of Cardiology and Research Centre

В этой статье

Краткое содержание

Образцы коронарной эндартеректомии ткани были обработаны для выделения отдельных ядер с использованием оптимизированного протокола диссоциации. Целостность изолированных ядер была подтверждена тремя комплементарными методами: окрашивание с исключением трипана для оценки целостности мембраны, конфокальная микроскопия на основе DAPI для подтверждения морфологии ядра и проточная цитометрия для количественной оценки выхода и чистоты ядер.

Аннотация

Атеросклероз — это хроническое, прогрессирующее воспалительное состояние, характеризующееся накоплением бляшек в стенках артерий. В процессе формирования бляшек некоторые поражения становятся нестабильными, называемыми бляшеками высокого риска и могут привести к инфаркту миокарда (ИМ). Атеросклеротическая бляшка состоит из гладкомышечных клеток, эндотелиальных клеток, иммунных клеток, жировых и некротических клеток, любая из которых может вызвать разрыв бляшек. Крайне важно изучать клеточную гетерогенность внутри атеросклеротических бляшек, чтобы лучше понять механизмы, лежащие в основе нестабильности бляшек. Мы представляем легко воспроизводимый протокол для выделения и валидации ядер из человеческой коронарной эндартеректомии, полученный у пациентов, проходящих операцию шунтирования коронарных артерий (CABG). Все ткани хранятся на влажном льду в среде Мемориального института Росвелл-Парк (RPMI) для сохранения целостности клеток перед сбором. Образцы тканей мелко измельчаются, а затем аккуратно разбиваются микропестиком в буфере лизис, чтобы лизировать клетки и высвобождать ядра. Изолированные ядра затем оцениваются на целостность и выход с помощью теста исключения трипана синего в составном инвертированном микроскопе. Окрашивание DAPI позволяет визуализировать целые ядра с помощью конфокальной микроскопии, а потоковая цитометрия обеспечивает количественную оценку на основе флуоресценции для оценки выхода ядерной изоляции и валидации ядерной популяции. В отличие от традиционных методов изоляции через диссоциацию одной клетки, ядерная изоляция снижает клеточный стресс и сохраняет нативную транскриптомическую среду, тем самым предотвращая изменения экспрессии генов. Высококачественная ядерная подготовка, полученная этим методом, совместима с последующим применением, таким как секвенирование одноядерной РНК (snRNA-seq).

Введение

Атеросклеротическое сердечно-сосудистое заболевание (ASCVD) является ведущей в мире причиной смерти и инвалидности, и несмотря на значительные терапевтические достижения, их нагрузка остаётсянеизменной 1. Атеросклероз — это хроническое воспалительное заболевание стенки артерии, вызванное сложными и динамическими взаимодействиями между различными популяциями клеток, которые вместе координируют тихое развитие от раннего субклинического заболевания к судьбо-сосудистым(CV) событиям.

В средних и крупных артериях накопление холестериновых отложений в макрофагах является отличительной чертой атеросклероза3. Атеросклеротическая бляшка состоит из жирных кислот, холестерина, воспалительных клеток, кальция, фибрина, гладкомышечных клеток, эндотелиальных клеток и клеточных остатков внутрисубэндотелия 4. Атеросклеротические бляшки делятся на два типа: низкорисковые и высокого риска. Бляшки высокого риска определяются своей склонностью вызывать последующее сердечно-сосудистое событие, обычно через такие механизмы, как эрозия бляшек или разрыв5.

Характеристики бляшек с высоким риском включают крупные липидные ядра, несколько воспалительных клеток, меньшее количество гладкомышечных клеток, тонкую волокнистую шапочку, микрокальцификацию, кровоизлияние внутри бляшек, неососуды и некротическоеядро 6. Обнаружение бляшек высокого риска проводится клинически с использованием неинвазивных и инвазивных методов визуализации, а именно коронарной компьютерной томографии (CCTA) и оптической когерентной томографии (OCT) соответственно 7,8. Несмотря на многочисленные достижения в области сердечно-сосудистой визуализации, по-прежнему сложно предсказать разрыв атеросклеротической бляшки, вызывающей инфаркт миокарда (МИ), и это не всегда полезно в клиническихусловиях 9.

Несмотря на десятилетия исследований, нам всё ещё не хватает надёжных циркулирующих биомаркеров, способных точно определить фенотипы бляшек с высоким риском, что оставляет критический пробел в клиническом лечении атеросклероза. Это подчёркивает необходимость молекулярных стратегий, которые могут характеризуть эти бляшки на более фундаментальном биологическомуровне 7,10. В этом контексте маркеры на основе РНК привлекли значительное внимание, поскольку они могут фиксировать сложную транскрипционную активность, происходящую в микросредебляшек 11. Недавние достижения в секвенировании одноклеточных РНК (scRNA-seq) оказались особенно эффективными, обеспечив беспрецедентное разрешение для профилирования отдельных клеток внутри атеросклеротических бляшек и выявления различных популяций клеток, паттернов экспрессии генов и молекулярных путей, лежащих в основе уязвимостибляшек 12,13. Несмотря на эти достижения, мало сведений о регуляторных процессах, взаимодействиях и функциональной важности различных типов клеток, участвующих в развитииатеросклероза 14.

Когда атеросклеротическая нагрузка выражена и рассеяна, хирургическая реваскуляризация становится окончательной стратегией лечения. Коронарная эндартерэктомия (КЭ) — это хирургическое дополнение к операции шунтирования коронарных артерий (АКШ), при котором атеросклеротический бляшок механически удаляется из диффузно больных коронарных артерий для проведения шунтирования и полной реваскуляризации миокарда15,16. Атеросклеротические бляшки и образцы эндартеректомии особенно сложны в работе, поскольку содержат обильное количество некротической ткани, липидных отложений, фибринов и кальцификации. Когда эти ткани разлагаются для анализа, они образуют значительный мусор, закупоряющий фильтры и микрофлюидные системы, что делает выделение жизнеспособных отдельных клеток чрезвычайнозатруднительным. Фактически, одно исследование сонного бляшек показало, что жизнеспособные клетки составляют менее 1% всех частиц после обработки тканей; Остальное — это просто обломки18-й таблички.

Усугубляя эту проблему, атеросклеротические бляшки находятся в состоянии хронического метаболического и окислительного стресса, когда клетки, подвергающиеся апоптозу, старению и другим дегенеративным процессам, делают мембраны клетки всё более хрупкими и подверженными разрушениям, что делает выделение жизнеспособных отдельных клеток чрезвычайносложным 18,19,20 . Механическое и ферментативное переваривание, необходимое для подготовки образцов к scRNA-seq, часто повреждает эти уже скомпрометированные клетки, что ещё больше снижает жизнеспособность и приводит к низким показателям захвата клеток. Этот процесс также склонен к селективной потере хрупких или редких клеточных популяций, что вносит значительное искажение как в транскриптомические данные, так и в типы клеток, представленные в итоговых результатах. Эта проблема становится ещё более выраженной в кальцифицированных или сильно больных бляшек, где жёсткие условия обработки, необходимые для разрушения ткани, наносят дополнительный ущерб жизнеспособностиклеток 18,21,22.

В отличие от этого, ядро остаётся структурно целым даже при таких неблагоприятныхусловиях 23. Это в первую очередь связано с ядерной оболочкой — двойным липидным бислоем, усиленным ядерными ламинами (Lamin A/C и Lamin B), который обеспечивает механическую жёсткость и устойчивость к осмотическим, ферментативным и физическим нагрузкам, легко нарушающим плазматическуюмембрану 24,25. Ядерная пластинка также сохраняет ядерную морфологию, даже если окружающая цитоплазма сильноповреждена 26. Это делает секвенирование одноядерной РНК (snRNA-seq) более практичной и надёжной альтернативой секвенированию одноклеточной РНК (scRNA-seq) для профилирования атеросклеротическойткани 27. Захватывая транскрипционную информацию из целостных ядер, а не целых клеток, snRNA-seq обходит ограничения, наложенные низкой жизнеспособностью клеток и высоким содержанием мусора, что позволяет более точно и всесторонне провести транскриптомическое профилирование микросредыбляшек 18.

Поэтому в этом исследовании мы представляем оптимизированный протокол изоляции ядер, специально разработанный для коронарной эндартеректомии, включающий лизис на основе неионных детергентов и эмпирически скорректированную продолжительность лизиса на основе степени кальцификации тканей, чтобы стабильно получать высококачественные ядра с сохраненной структурной и РНК-целостностью, подходящие для дальнейшего анализа snRNA-seq.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Настоящее исследование было проведено с одобрения и в соответствии с руководящими принципами Комитета по этике человека Института кардиологии и исследований имени ООН Мехты (EC/Approval/26/Cardio/14/12/2024) и Гуджаратского биотехнологического университета (GBU_IHEC/2023/006). До начала выборки все участники получили информированное согласие. Пациенты, проходящие шунтирование коронарных артерий с коронарной эндартеректомией, были отобраны для текущего исследования. После хирургического удаления ткань эндартерэктомии немедленно помещалась в безсывороточную RPMI-среду, поддерживалась при 4 °C и транспортировалась в лабораторию примерно через 12 часов в криовиальном виде. См. Таблицу материалов для получения подробностей обо всех материалах, используемых в следующем протоколе.

1. Изоляция ядер

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все этапы на льду и используйте стерильные материалы. Подготовьте все буферы заново.

  1. Промыйте ткань один-два раза безсывороточной средой RPMI, чтобы удалить пятна и фрагменты крови. Используя стерильные щипцы, перенесите ткань на стерильную чашку Петри и запишите вес.
  2. С помощью хирургического лезвия (No 10) измельчите ткань на мелкие кусочки размером ∼1мм 3 дюйма.
  3. Подготовьте буфер лизиса 1 мл, смешивая 10 мМ Tris-HCl, pH 7,4, 10 мМ NaCl, 3 мМ MgCl2 (используя стандартные растворы по 1 М для каждого компонента), 0,1% (v/v) Nonidet P-40 в воде без нуклеазы. Добавляйте компоненты последовательно в следующем порядке: сначала вода без нуклеаз, затем Tris-HCl, NaCl, MgCl₂ и NP-40, чтобы избежать пенения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер для лизиса должен быть подготовлен свежим в день использования и хранить на льду в постоянном состоянии. Не замирайте.
  4. Добавьте охлаждённый буфер лизиса объемом 1 мл в ткань в микроцентрифугной трубке объемом 5 мл.
  5. Лизируйте ткань на льду с помощью микропестика, приложив мягкое, равномерное усилие и поочерёдно вращая микропестик по часовой стрелке и против часовой стрелки. Продолжайте лизис примерно 30 минут, чтобы образец оставался холодным на протяжении всего процесса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проанализируйте ткань, пока она не станет мутной. Используйте наконечник объёмом 1000 мкл, чтобы аккуратно перемешивать с помощью пипетирования.
  6. Фильтруйте раствор с помощью сита диаметром 100 мкм поры в центрифугную трубку на 15 мл для удаления мусора и кусков тканей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтрат должен выглядеть менее мутным, при этом на сито остаются видимые мусоры.
  7. Центрифугуйте ядра при 500 x g в течение 5 минут при 4 °C с помощью качающегося ротора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На дне трубки должна образоваться видимая гранула.
  8. Удалите супернатант с помощью кончика пипетки обычного диаметра, не нарушая гранулу.
  9. Подготовьте промывку ядер и буфер для ресуспензии, смешивая 1% бычий сывороточный альбумин (BSA) (с использованием 10% стандартного раствора), ингибитор РНазы 0,2 U/μL (с использованием раствора 20 U/μL) в 1X фосфатный буферный раствор Dulbecco (DPBS). Составляйте компоненты последовательно в следующем порядке: сначала DPBS, затем BSA, и наконец ингибитор РНаз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер должен быть подготовлен свежим в день использования и всегда хранить охлаждённым на льду. Не замирайте.
  10. Суспензируйте гранулу в промывке ядра и буфере для ресуспензии. Охлаждайте буфер на льду перед использованием.
  11. Оценить эффективность лизиса и жизнеспособность клеток, окрашивая 5 мкл трипана синим и подсчитывая в гемоцитометре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если жизнеспособные клетки всё ещё присутствуют, центрифугуйте при 500 x g в течение 5 минут при 4 °C, затем повторите разделы 3-10.
  12. Фильтруйте раствор с помощью сита размером с пору 30 мкм в центрифугную трубку на 15 мл для удаления мусора и комков.
  13. Центрифугуйте ядра при 500 x g в течение 5 минут при 4 °C с помощью качающегося ротора.
  14. Удалите супернатант с помощью наконечника пипетки обычного диаметра, затем взвешивают гранулу в 1 мл промывки ядер и буфера для ресуспензии.

2. Характеристика изолированных ядер

  1. Трипан-синяя окрашивание для оценки целостности ядер.
    1. Возьмём 15 мкл суспензии изолированных ядер в микроцентрифуге объёмом 1,5 мл.
    2. Добавьте 5 мкл трипан-блю красителя (0,4% с воды) и аккуратно перемешайте пипеткой.
    3. Инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут для правильного окрашивания.
    4. Загрузите 10 мкл окрашенной смеси на гемоцитометр.
    5. Наблюдайте под составным инвертированным микроскопом, чтобы изучить морфологию и подсчитать количество ядер.
  2. Анализ потоковой цитометрии суспензии отдельных ядер
    1. Возьмите 1 мл суспензии изолированных ядер и центрифугуйте суспензию ядер при 500 x g в течение 5 минут при 4 °C с помощью ротора с поворотным ведром.
    2. Удалите супернатант с помощью наконечника пипетки обычного диаметра и снова подвесьте гранулу в буфере FACS на 200 мкл (1X PBS и 1% BSA).
    3. Разделите 200 мкл восстановленных ядер на два аликвота: оставьте 100 мкл в качестве неокрашенного контроля и используйте 100 мкл в качестве окрашённого образца.
    4. Добавьте 1 мкл 4', 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) (1 мг/мл) в окрашенный образец для достижения конечной концентрации 10 мкг/мл. Аккуратно перемешайте и инкубуйте при комнатной температуре в темноте в течение 5 минут перед проточным цитометрическим анализом.
    5. В проточном цитометре, используемом для этого исследования, используйте фиолетовый лазер с частотой 405 нм и обнаружите с помощью 448/45 нм. Сначала проведите неокрашенный контрольный образец и соберите минимум 10 000 событий из общей популяции.
    6. Установите напряжение на 183 В для прямого рассеяния (FSC), 300 В для бокового рассеяния (SSC) и 400 В для V450 (DAPI лазер). Установите порог на уровне 10 000 для FSC.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все настройки напряжения и усиления приборов постоянны по сэмплам для поддержания стабильности.
    7. Постройте площадь прямого рассеяния (FSC-A) и высоту прямого рассеяния (FSC-H), чтобы отличить синглеты от дублетов и агрегатов. Нарисуйте элемент вокруг событий, показывающих линейную зависимость, чтобы сохранить только синглетные ядра.
    8. Сгенерируйте двумерный график FSC-A и площади бокового рассеяния (SSC-A). Примените широкий элемент, охватывающий всю популяцию рассеяния, поскольку изолированные ядра обычно имеют гетерогенный профиль рассеяния без отдельных субпопуляций.
    9. Создайте двумерный плотный (псевдоцветный) график SSC-A против фиолетового 450 нм (V450-A). Используйте неокрашенный регулятор для определения фоновой флуоресценции и точного расположения затвора. Идентифицировать и зарегистрировать отдельную популяцию DAPI⁺, соответствующую целостным ядрам.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку используется один флуорохром (DAPI), компенсация флуоресценции не требуется.
  3. Визуализация изолированных ядер с помощью конфокальной микроскопии
    1. Возьмите 50 мкл суспензии ядер и добавьте 1 мкл DAPI (1 мг/мл) в окрашенный образец для получения конечной концентрации 10 мкг/мл, аккуратно перемешайте и инкубуйте при комнатной температуре 5 минут в темноте перед конфокальной визуализацией.
    2. Закрепите 5 мкл окрашенной суспензии ядра на чистый стеклянный затвор и накройте его с помощью накладки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте фиксации для сохранения ядерной морфологии.
    3. Визуализируйте ядра с помощью инвертированного конфокального микроскопа. Откройте программу конфокального микроскопа и сначала наблюдайте в ярком поле 10x, затем переключитесь на яркое поле 40x.
    4. Получение конфокальных изображений с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа с спектральным детектором и объективами PLAN APO λD 40X (NA 0.95, RI 1.0). Возбуждайте DAPI с помощью лазера 405 нм и собирайте излучение от 429 до 474 нм.
    5. Параметры визуализации были следующими:
      1. Режим детектора: многоканальный (GaAsP)
      2. Сканер: Гальвано однонаправленный
      3. Режим сканирования: Диапазон
      4. Среднее количество строк: 2X
      5. Разрешение: 1024 × 1024 пикселя
      6. Время пребывания: 2,0 мкс.
      7. Размер отверстия: 47,7 мкм
      8. Мощность лазера: 0,1-9,3% (в зависимости от интенсивности поля)
      9. Усиление детектора: 37,8-45,9%
      10. Зум: 1.0X
      11. Калибровка: 0,43-0,58 мкм/пиксель
    6. Получайте все изображения с помощью камеры AX с минимальным режимом перекрёстных помех при идентичных оптических конфигурациях, и идеальная система фокусировки (PFS) должна быть активна во время съёмки для поддержания стабильности в z-плоскости.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Человеческая коронарная эндартеректомическая ткань была собрана у пациентов, проходящих операцию по удалению АКШ. Ткань была взвещена и обработана для выделения ядер, а дальнейшие выделения ядер подтверждены с помощью проточной цитометрии и конфокальной микроскопии (см. рисунок 1).

Оценка качества изоляции ядер с помощью трипанового синего
Ткань, содержащаяся в среде RPMI, взвешивалась и составляла 247,8 мг. Ткань была измельчена, а затем гомог...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В текущем протоколе описан оптимизированный рабочий процесс для выделения ядер из коронарной эндартеректомии человека. Протокол ядерной изоляции, описанный здесь, был специально разработан для преодоления критических ограничений получения жизнеспособных, целостных клеток из развитых коронарных атеросклеротических бляшек. В отличие от традиционных подходов scRNA-seq, основанных на жёстком ферментативном переваривании и механической диссоциации21,30

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, которые можно было бы раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Индийским советом по медицинским исследованиям (ICMR) (EM/Dev/SG/34/01106/2024) и сотрудничеством с Институтом кардиологии и исследовательского центра ООН Мехты, Ахмедабад. Хуши Джани благодарит Университетскую грантовую комиссию (UGC) и Совет по научным и промышленным исследованиям (CSIR) правительства Индии за присвоение совместной квалификации CSIR-UGC NET (NTA REFERENCE NO: 241620143543).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
100 & MU; М-ситоMiltenyi Biotech 130-098-463
30 & MU; М-ситоMiltenyi Biotech 130-098-458
Бычий сывороточный альбуминHiMediaTC546-25G
ЦентрифугаMPWNAhttps://mpw.pl/en/offer/mpw-352r
Составный микроскопNikonNA Инвертированный микроскоп Nikon Eclipse Ts2 (https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_AOM/products/inverted-microscopes/eclipse-ts2)
Конфокальный микроскоп и bbsp;NikonNAИнвертированный конфокальный микроскоп Nikon Ti2-E (https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_AOM/products/inverted-microscopes/eclipse-ti2-series)
КоверслипыHiMediaBG011C
CRYOCHIL Широкий флакон образцаТарсоны883191
DAPISigmaD9542-5MG
DPBSGibco (Thermofischer)10010-023
Центрифуга (15 мл)Тарсоны546021
Потоковый цитометр и bbsp;BD Biosciences663029BD FACSLyric (3L12C Instrument CEIVD)
ГемоцитометрАксибиоCCB 100
Микроцентрифугальная трубка (1,5 мл)Тарсоны500010C
Микроцентрифугная трубка (5 мл)Тарсоны500050
MgCl2SigmaM1028-100ML
МикропестикТарсоны160020
NaClSigmaS9888-500G
NP-40HiMediaMB143-100ML
Вода без нуклеазыGibco (Thermofischer)W4502-1L
Ингибитор РНазыSigma333540201
RPMI 1640Gibco (Thermofischer)11875093
Slide Ривьера72910135
Tris-HClSigmaT2194-100ML
Трипан синий Sigma302643-25G

Ссылки

  1. Roth, G. A., et al. Global burden of cardiovascular diseases and risk factors- 1990-2019. J. Am. Coll. Cardiol. 76 (25), 2982-3021 (2020).
  2. de Winther, M. P. J., et al. Translational opportunities of single-cell biology in atherosclerosis. Eur. Heart J. 44 (14), 1216-1230 (2023).
  3. Mohebbati, R., Momeni-Moghaddam, M. A. The role of red blood cells in cholesterol accumulation and atherosclerotic plaque instability: a perspective on atherosclerosis. Curr. Cardiol. Rev. 21 (5), (2025).
  4. Ajoolabady, A., et al. Inflammation in atherosclerosis: pathophysiology and mechanisms. Cell Death Dis. 15 (11), 817(2024).
  5. Dawson, L. P., Layland, J. High-risk coronary plaque features: a narrative review. Cardiol. Ther. 11 (3), 319-335 (2022).
  6. Tong, W., et al. Highly sensitive magnetic particle imaging of vulnerable atherosclerotic plaque with active myeloperoxidase-targeted nanoparticles. Theranostics. 12 (17), 7641-7641 (2022).
  7. Lu, G., et al. Coronary computed tomography angiography assessment of high-risk plaques in predicting acute coronary syndrome. Front. Cardiovasc. Med. 8, (2021).
  8. Kinoshita, D., et al. High-risk plaques on coronary computed tomography angiography. JACC Cardiovasc. Imaging. 17 (4), 382-391 (2024).
  9. Canu, M., et al. Non-invasive multimodality imaging of coronary vulnerable patient. Front. Cardiovasc. Med. 9, (2022).
  10. Liu, X., et al. Assessment of coronary computed tomography angiography-derived plaque features in the diagnosis of optical coherence tomography-defined vulnerable plaques. Quant. Imaging Med. Surg. 15 (3), 2029-2041 (2025).
  11. Chiorescu, R. M., et al. Vulnerable atherosclerotic plaque: is there a molecular signature. Int. J. Mol. Sci. 23 (21), 13638(2022).
  12. The applications of single-cell RNA sequencing in atherosclerotic disease. Front. Cardiovasc. Med. Slenders, L., Tessels, D. E., van der Laan, S. W., Pasterkamp, G., Mokry, M. 9, (2022).
  13. Adam, C. A., et al. Novel biomarkers of atherosclerotic vascular disease-latest insights in the research field. Int. J. Mol. Sci. 23 (9), 4998(2022).
  14. Ye, W., Chen, Z., Xia, Z., Li, D. Single-cell RNA sequencing in human atherosclerotic plaques reveals a novel smooth muscle cell subtype that possesses multi differentiation potential and shapes the microenvironment. Clin. Exp. Med. 25 (1), 251(2025).
  15. Kelly, J. J., et al. Coronary endarterectomy: analysis of the society of thoracic surgeons adult cardiac surgery database. Ann. Thorac. Surg. 114 (3), 667-674 (2022).
  16. Ghatanatti, R. Coronary endarterectomy: recent trends. J. Clin. DIAGNOSTIC Res. , (2017).
  17. Li, Y., et al. Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic cell populations and differential gene expression patterns in control and aneurysmal human aortic tissue. Circulation. 142 (14), 1374-1388 (2020).
  18. Alsaigh, T., Evans, D., Frankel, D., Torkamani, A. Decoding the transcriptome of calcified atherosclerotic plaque at single-cell resolution. Commun. Biol. 5 (1), 1084(2022).
  19. Iqbal, F., Lupieri, A., Aikawa, M., Aikawa, E. Harnessing single-cell RNA sequencing to better understand how diseased cells behave the way they do in cardiovascular disease. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 41 (2), 585-600 (2021).
  20. Ahmad, H., et al. Single cell RNA sequencing of haematopoietic cells in fresh and frozen human atheroma tissue. Cardiovasc. Res. 121 (3), 396-404 (2025).
  21. Depuydt, M. A. C., et al. Microanatomy of the human atherosclerotic plaque by single-cell transcriptomics. Circ. Res. 127 (11), 1437-1455 (2020).
  22. Williams, J. W., et al. Single cell RNA sequencing in atherosclerosis research. Circ. Res. 126 (9), 1112-1126 (2020).
  23. Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. -A., Lee, H. -O. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues. J. Pathol. Transl. Med. 57 (1), 52-59 (2023).
  24. Gruenbaum, Y., Foisner, R. Lamins: Nuclear intermediate filament proteins with fundamental functions in nuclear mechanics and genome regulation. Annu. Rev. Biochem. 84 (1), 131-164 (2015).
  25. Zwerger, M., Ho, C. Y., Lammerding, J. Nuclear mechanics in disease. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13 (1), 397-428 (2011).
  26. Dechat, T., et al. Nuclear lamins: major factors in the structural organization and function of the nucleus and chromatin. Genes Dev. 22 (7), 832-853 (2008).
  27. Oh, J. -M., et al. Comparison of cell type distribution between single-cell and single-nucleus RNA sequencing: enrichment of adherent cell types in single-nucleus RNA sequencing. Exp. Mol. Med. 54 (12), 2128-2134 (2022).
  28. Nott, A., Schlachetzki, J. C. M., Fixsen, B. R., Glass, C. K. Nuclei isolation of multiple brain cell types for omics interrogation. Nat. Protoc. 16 (3), 1629-1646 (2021).
  29. Gulko, A., et al. Protocol for flow cytometry-assisted single-nucleus RNA sequencing of human and mouse adipose tissue with sample multiplexing. STAR Protoc. 5 (1), 102893(2024).
  30. Fernandez, D. M., et al. Single-cell immune landscape of human atherosclerotic plaques. Nat. Med. 25 (10), 1576-1588 (2019).
  31. Galvis, A. E., Fisher, H., Camerini, D. NP-40 fractionation and nucleic acid extraction in mammalian cells. BIO-PROTOCOL. 7 (20), (2017).
  32. Wirka, R. C., et al. Atheroprotective roles of smooth muscle cell phenotypic modulation and the TCF21 disease gene as revealed by single-cell analysis. Nat. Med. 25 (8), 1280-1289 (2019).
  33. Pan, H., et al. Single-cell genomics reveals a novel cell state during smooth muscle cell phenotypic switching and potential therapeutic targets for atherosclerosis in mouse and human. Circulation. 142 (21), 2060-2075 (2020).
  34. Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), e0209648(2018).
  35. Litviňuková, M., et al. Cells of the adult human heart. Nature. 588 (7838), 466-472 (2020).
  36. Hu, P., et al. Single-nucleus transcriptomic survey of cell diversity and functional maturation in postnatal mammalian hearts. Genes Dev. 32 (19-20), 1344-1357 (2018).
  37. Rani, U., et al. Evaluation of use of RPMI Medium to preserve cell morphology for pleural/peritoneal fluid cytology. J. Cytol. 39 (1), 26-29 (2022).
  38. Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. Stress relief: emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts. Trends Cell Biol. 31 (11), 888-897 (2021).
  39. Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat. Med. 26 (5), 792-802 (2020).
  40. Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nat. Protoc. 11 (3), 499-524 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

DAPI
Выделение одиночных ядер из коронарной эндартеректомии пациентов с шунтированием коронарных артерий
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.