Получение опухолевых органоидных культур из линии аденокарциномы лёгких

Краткое содержание

Здесь мы представляем быстрый, чистый и экономичный метод установления опухолевых органоидов из клеточной линии A549, подходящий для предварительных тестов и образовательных целей.

Аннотация

Здесь мы описываем протокол для получения опухолевых органоидов (CDTOs), полученных от клеточной линии лёгких A549. Протокол предполагает встраивание 2D-расширенных клеток A549 в Matrigel и их поддержание в 3D-культурной среде для длительного культивирования. Рекомендованная плотность посева составляла 500 клеток/мкл для поддержания стабильного формирования органоидов. Полученные CDTO характеризовались окрашиванием гематоксилином и эозином (H&E), а также иммунофлуоресценцией (IF). Органоиды поддерживали высокую экспрессию маркеров аденокарциномы лёгких: фактора транскрипции щитовидной железы 1 (TTF-1), адгезионного белка E-Cadherin (ECAD) и цитоскелетного белка кератина 7 (KRT7). Кроме того, экспрессия белка узкого соединения Zona Occludens 1 (ZO-1) показала дисрегулированную полярность опухолевых органоидов. Этот протокол предлагает технически простую, экономичную и исключительно опухолевой органоидную платформу для исследований аденокарциномы легких. Его простота и воспроизводимость также делают его подходящим для лабораторного обучения на бакалавриате, где он помогает студентам освоить фундаментальные методы 3D-методов культуры органоидов опухолей в рамках ограниченного лабораторного графика.

Введение

Органоиды являются in vitro. самоорганизованными трёхмерными (3D) структурами, происходящими из стволовых клеток и способными в значительной степени воссоздавать биологические сложности реальных^{органов. 1}. Клетки, составляющие органоиды, могут происходить из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток или клеток, полученных из тканей, к которым относятся нормальные стволовые и прогениторные клетки, дифференцированные клетки и^{опухолевые клетки 2}. По сравнению с традиционными двумерными системами культуры и животными моделями, органоиды могут более точно имитировать физиологические характеристики человеческого тела, обеспечивая при этом большую экспериментальную гибкость. В результате органоидная технология широко применяется в разработке^{лекарственных средств 3}, персонализированной^{медицине 4} и моделировании^{заболеваний 5}.

Многочисленные исследования установили органоидные модели для широкого спектра рака, включая^{колоректальный 6},^{простату 7}, поджелудочную⁸,^{желудочную 9},^{печёночную 10}, желчную¹¹,^{молочную железу 12} и нейроэндокринные опухоли. Однако одной из основных задач в исследованиях органоидов опухолей является сохранение чистоты. Например, исследование немелкоклеточного рака лёгких показало, что только 17% установленных органоидов были исключительно опухоли, поскольку образцы опухолей часто содержат смесь нормальных и злокачественных клеток, которые трудно полностью отделить до^{культуры 13}. Эта проблема с примесями может привести к ликвидации опухолевых клеток путём роста неопухолевых клеток, мешать показаниям тестов на восприимчивость препаратов и привести к неточным молекулярным анализам, таким как RT-qPCR или Western blot, где РНК и белки из опухолевых клеток разбавляются неконтролируемыми пропорциями загрязняющих клеток.

Для решения этой проблемы исследователи исследовали проектирование селективных культурных сред, которые используют сниженную зависимость опухолевых клеток от определённых факторов роста, тем самым ингибируя нормальный рост клетки и способствуя их^{расширению 14}. Кроме того, разрабатываются такие методы, как сортировка клеток или моноклональная идентификация для создания чистых опухолевых органоидов.

Этот протокол описывает генерацию опухолевых органоидов (CDTOs) с использованием линии аденокарциномы человека A549, которая, как сообщается, частично проявляет свойства, похожие на стволовые клетки рака, а также повышенную клоногенность, пролиферативный потенциал и опухологенность in vitro.¹⁵. Полученные CDTO сохраняли экспрессию генеоспецифических биомаркеров — фактора транскрипции щитовидной железы 1 (TTF-1)¹⁶, адгезионного белка E-Cadherin (ECAD)¹⁷ и цитоскелетного белка Keratin 7 (KRT7)¹⁶, а также проявляли физиологические особенности, характерные для опухолевых органоидов. Эту модель легко установить и она содержит определённые компоненты раковых клеток, что делает её подходящей для исследователей, впервые знакомящихся с областью опухолевых органоидов, или для тех, кто сталкивается с потерей идентичности опухоли в первичных культурах опухолевого органоида. Потенциальные применения включают предварительное тестирование на восприимчивость к^{лекарствам 18}, микроопухолевое^{исследование 19} и образовательное обучение методам 3D-культуры.

Протокол

Температура в комнате в лаборатории составляет 22–24 °C и называется RT. Рекомендуется использовать центрифугу с поворотным ведром. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Установление первичных органоидов A549

1. Подготовка и сбор ячеек A549
   1. Приготовьте тарелку диаметром 6 см с элементами A549 при 70% совпадении. Предварительное разогретие TrypLE и PBS до 37 °C. Рассчитайте количество ячеек и объём матригела согласно экспериментальному дизайну и таблице 1.
      1. Оттепель требовал матригельских аликвотов с резервированием как минимум для двух скважин на льду не менее 60 минут. Подготовьте пластины, обработанные полистиролом и TC, чтобы купола оставались полусферическими.
      2. Свежеприготовленная 2D-среда (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, содержащая 10% сыворотку плода бычьего скота) и 3D-среду (органоидная среда для аденокарциномы легких человека). 3D-среда может быть создана из коммерческих наборов или согласно работам Сакса, Н. и др. из^{лаборатории Ханса Клевера 20}.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Одна блюдо диаметром 6 см обычно может дать около 5 000 000 клеток после пищеварения. Уменьшить количество входных ячеек для экспериментального дизайна. Пластины, предназначенные для конфокальной визуализации с использованием стеклянного дна, не подходят для Matrigel для формирования правильной трёхмерной формы.
   2. Аспирируйте отработавшую 2D-среду и промывайте клетки один раз 1 мл PBS, чтобы удалить остатки сыворотки. Аспирируйте PBS, добавьте 1 мл предварительно нагретого TrypLE и инкубуйте пластину при 37 °C в течение 4 минут.
   3. Наблюдайте клетки под микроскопом. Когда цитоплазма отступает и клетки теряют межклеточные связи, добавляют равный объём (1 мл) свежей двумерной среды, чтобы прекратить ферментативную реакцию.
   4. Аккуратно отсоедините и снова подвесьте прилипшие клетки к поверхности культуры. Переместить суспензию клетки в центрифугные трубки объёмом 1,5 мл и центрифугировать при 300 × г в течение 3 минут при RT для гранулирования клеток.
   5. Отбросьте супернатант и снова подвесьте клеточную гранулу в 1 мл 2D среде. Разведите суспензию клеток 10 мкл до 100 мкл и подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра. Рассчитайте необходимый объём согласно шагу 1.1.1 и аспирируйте в центрифугную трубку объёмом 1,5 мл с предварительно промытыми наконечниками.
2. Посев собранных клеток в Matrigel
   1. Подготовьте наконечники для льда и предварительного охлаждения в холодильнике при -20 °C на 1 минуту и, если возможно, используйте наконечники с низким содержанием. Убедитесь, что в аликвотах Matrigel не осталось кристаллов и при входе кончика в раствор не образуются пузырьки.
   2. Центрифугуйте трубку с собранными клетками при 300 × г при RT и выбросьте супернатант. Поставьте трубку на лёд. Используйте предварительно охлаждённые наконечники пипетки, чтобы медленно впитывать необходимый объём Matrigel и добавлять его в гранулу на льду. Подвесьте только первый стоп пипетки, медленно на льду. Пожалуйста, не оставляйте лёд дольше 10 секунд, если требуется наблюдение.
   3. Используйте предварительно охлаждённые наконечники пипеток и держите смесь на льду. Высыпайте по одному аликвоту смеси в центр каждой колодцы. Медленно вынимайте пипетку во время отпуска, используя только первую остановку, чтобы избежать образования пузырей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь должна образовывать куполообразную трёхмерную структуру в центре. Суспензируйте смесь перед переходом к следующей колодцу. Если возможно, избегайте использования крайних скважин и добавляйте PBS в эти скважины.
   4. Инкубировать пластину при 37 °C в инкубаторе с 5% CO₂ в течение 40 минут, чтобы обеспечить полимеризацию геля. После того как матригель затвердеет, аккуратно добавьте 3D-среду вдоль стенки колодца и продолжайте культивирование при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте образования пузырьков во время отпуска. Если образуются пузырьки, избегайте использования этой части смеси.
   5. Во время посева меняйте 3D-среду каждые 3 дня или при смене цвета (с розового на жёлтый). Изучайте рост органоидов под перевёрнутым микроскопом при каждом изменении среды и фотографически документируйте морфологию для отслеживания структурного развития.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды должны быть плотными и свернутыми, с диаметрами более 30 мкм, а не распадаться или фрагментированы, как указано при 5000 клеток/мкл (рисунок 1D).

2. Фиксация, вложение и секционирование органоидов

1. Подготовьте органоидные культуры на 6–9 день. Удалите культурную среду из клеточной культивирующей пластины. Аккуратно отсоедините органоиды, пипетируя 1 мл холодного PBS, и переместите их в трубку объемом 1,5 мл, предварительно промывшуюся 5% BSA, чтобы предотвратить склеивание. Позвольте органоидам естественным образом оседать под действием гравитации на льду и аккуратно удалите супернатант.
2. Добавьте 1 мл холодного PBS для повторной суспензии гранулы. Дайте органоидам естественным путём осесть под действием гравитации минимум 5 минут и аккуратно удалите супернатант. Если некоторые органоиды не откладываются, кратковременно центрифугайте при 200 × г в течение 1 минуты при 4 °C, чтобы собрать их. Этот этап выполняется несколько раз и называется «небольшим мойком».
3. Проведите небольшую промывку дважды, чтобы удалить остатки Matrigel. Если остатки Matrigel сохраняются, добавьте последнюю концентрацию 10 мМ EDTA в холодный PBS во время мытья.
   ВНИМАНИЕ: Перенесите образцы в вытяжку. Добавьте 4% параформальдегида (PFA), достаточного для покрытия органоидов, и зафиксируйте лёд на 1 час в выхлопчике. Отбросьте фиксатив и выполните небольшую промывку дважды. Переходите к шагу 4.1 для IF-окрашивания.
4. После того как органоиды оседают на дне пробирки, сбросьте супернатант и предварительно разогрейте образцы в металлической ванне при температуре 70–75 °C в течение 5 минут, чтобы избежать быстрого затвердевания агарозой на этапе 2.7.
5. Приготовьте 3% агарозы в 1× PBS и нагрейте смесь в микроволновой водяной бане до полного растворения и прозрачности. Избегайте кипячения, чтобы предотвратить потерю объёма или изменения концентрации агарозы.
6. Быстро суспензировать фиксированные органоиды в 30–50 мкл 3% агарозы, обеспечивая равномерное распределение, и охлаждать на льду 20–30 минут до затвердевания, избегая образования пузырьков.
7. Когда агарозо-органоидная смесь затвердеет, аккуратно вынимите агарозный блок из трубки с помощью иглы и перенесите его в кассету с маркировкой ткани.
8. Последовательно погружайте кассету с блоком агарозы в сортированные этаноловые растворы (30%, 50%, 70% [можно хранить ночью при 4 °C], 80%, 90%, 95%, 100% и 100%) для обезвоживания. Инкубировать каждый шаг на дрожащей платформе при 20 об/мин в течение 30 минут.
9. Предварительно расплавите парафиновые восковые блоки в духовке перед использованием при 65 °C. Перенесите обезвоженные агарозные органоиды в ксилол для очистки. Погрузите дважды, каждый раз на 15–20 минут, чтобы удалить остаточный этанол.
10. Последовательно перемещайте кассеты с тканями в парафиновую ванну 1 на 45 минут, а затем в ванну 2 ещё 45 минут.
11. Поместите кассеты с тканями и металлические формы в камеру расплавленного парафина на станции встраивания. Удалите органоид или образец ткани из кассеты и разместите его в центре металлической формы. Поставьте форму на холодную пластину, чтобы зафиксировать ориентацию образца.
12. Разместите кассету для салфетки поверх металлической формы, заполните дополнительным расплавленным парафином и дайте остыть на холодной пластине не менее 60 минут. Когда парафиновый блок полностью затвердеет, снимите металлическую форму и храните органоидный блок с парафином при 4 °C до разреза.
13. Разрезать органоидные блоки, вложенные в парафин, с помощью микротома. Убедитесь, что толщина каждого участка одинаковая для облегчения последующего окрашивания и визуализации.
14. Позвольте срезанным секциям плавать в водяной бане при температуре 40 °C для полного расширения парафиновых лент. Убедитесь, что каждая секция растянута в один слой без морщин; Убрать все сложенные или перекрывающиеся секции.
15. Расширенные секции закрепляют на клейких микроскопических стеклах, погружая стекло под небольшим углом под секцией и поднимая вертикально, чтобы захватить ткань. Маркируйте слайды карандашом, чтобы сохранить идентификацию образца при последующей обработке.

3. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E)

1. Запекать стекли с тканями или органоидными срезами в духовке при температуре 60 °C в течение 1–2 часов для правильной адгезии и удаления остатков парафина.
2. Последовательно обезвоживайте секции, погружая их в ксилол I на 15 минут, в ксилол II на 15 минут, а затем регидратировать через серию градированного этанола из 100%, 100%, 95%, 90%, 80% и 70% каждый в течение 5 минут. Затем прополосните слайды в двойной дистиллированной воде (ddH₂O) дважды, по 5 минут.
3. Покрасьте участки гематоксилином в течение 5 минут, затем прополосните в проточной воде из-под крана 1–2 минуты, а затем дифференцируйте 1% кислотным спиртом на 2 секунды. Снова постойте в водопроводной воде 1–2 минуты, затем отбелите ядра в воде с 1% аммиака в течение 5 секунд, после чего окончательно промывайте в водопроводной воде на 1–2 минуты.
4. Обезвоживайте срезы с помощью серии градированного этанола из 70%, 80%, 90% и 95% в течение 3 минут, а затем окрашивайте эозином в растворе эозина на спиртовой основе в течение 10 минут.
5. Промыйте секции дважды абсолютным этанолом, каждый по 5 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для спиртового эозина обязательно обезвоживайте до 95% этанола перед нанесением окрашиваний. Для водорастворимого эозина перед обезвоживанием проводите окрашивание.
6. Очистите секции, окунув их дважды в ксилол по 5 минут, и держите в ксилоле до установки.
7. Сразу после снятия из ксилола крепите стекли с помощью нейтрального смоляного крепежного материала, аккуратно избегая воздушных пузырьков.
8. Высушить установленные стекли на воздухе в RT в течение 30–60 минут, затем наблюдать под световым микроскопом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Немедленное крепление после очистки ксилолом предотвращает окисление и обеспечивает оптическую чистоту.

4. Целостное иммунофлуоресцентное окрашивание

1. Продолжайте с шага 2.4. Добавьте в гранулу 1 мл раствора блокировки и проницаемости (5% BSA + 0,3% Triton X-100) и инкубировать при RT в течение 60 минут или при 4 °C в качестве точки остановки в течение 1–2 дней.
2. Разбавить первичные и вторичные антитела в соответствии с рекомендованным производителем соотношением в растворе блокировки и проницаемости. Небольшое промывание один раз и добавляет 200 мкл разбавленных первичных антител в гранулу. Инкубировать при 4 °C ночью.
3. Проведите небольшую промывку три раза и добавьте 200 мкл разбавленных вторичных антител в гранулу. Инкубировать на RT 60 минут.
4. Далее выполните небольшую промывку три раза. Добавьте монтажную среду на 15 мкл для повторного подвески гранулы и опустите среду с органоидами на стеклянный затвор. Медленно нанесите покрытие на материал и запечатайте покрытие лаком для ногтей. Не сжимайте скольжение крышки вручную, позволяя монтажной среде распространяться за счёт поверхностного натяжения.

Результаты

Общий процесс этого протокола включает расширение 2D клеток A549 до экспоненциальной стадии (дополнительный рисунок 1A) и переход в 3D-матригель для образования органоидов (рисунок 1A). После инкапсуляции в Матригель клетки размножались и самособирались, преимущественно образуя моноклональные органоиды (рисунок 1B). Его плотная и запутанная морфология была равномерной по всему проходу (дополнительный рисунок 1C). Для сравнения, ...

Обсуждение

Этот протокол описывает метод создания органоидов опухоли, полученных по линии клеток A549 с аденокарциномой легких, оптимизированный для технической простоты, воспроизводимости и образовательного использования. Три ключевых параметра определяют успех: начальное состояние клетки, состав среды и состав матрицы. Кроме того, продолжительность посева не превышает 14 дней. Ниже приведены ключевые параметры и устранение неполадок.

Начальное состояние ячейки<...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1.5 мл микроцентрифужная пробирка	Biofil	CFT003015
A549 [A-549]клетки человеческого немелкоклеточного рака легкого	ZQXZbio	ZQ0003	STR: Amelogenin: X,Y; CSF1PO: 10,12; D13S317: 11; D16S539: 11,12; D5S818: 11; D7S820: 8,11; TH01: 8,9.3; TPOX: 8,11; vWA: 14. Mycoplasma было отрицательным при покупке и тестировалось каждые 2 недели. Номер пересадки в пределах 10 пересадок от аликотов P1 купленной партии был использован.
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634010
Анти-E Cadherin антитело	Abcam	ab231303
Анти-Fade монтажное средство	YEASEN	36307ES08
Анти-HIF-1 альфа антитело	Abcam	ab51608
Биологический лабораторный шкаф	Nuaire LABGARD	NU-540
Машина для встраивания биологических тканей	KEDEE	KD-BM
БСА	Sigma	A1933
Cell-Grade BSA	Sigma	A1933-100G
Центрифуга	Eppendorf	Centrifuge 5702 R	Косоугольный; Средняя до низкой скорости.
Центрифужная пробирка	Biofil	CFT920150
Цитратное растворение антигена (рН 6.0)	ZSGB-BIO	ZLI-9065
Криостадион	KEDEE	KD-BL
Cytation 5 Cell Imaging Multimode  Читатель	Biotek	Cytation 5
Цитокератин 7 (KRT7) Кроликовый mAb	Abclonal	A4357
DMEM	Gibco	11965092
DMSO	Solarbio	D8371
Сыворотка лошади	Solarbio	SL050
Дульбекко модифицированная среда орла	Gibco	11965118
Eclipse Ts2 Инвертированный микроскоп	Nikon	Eclipse Ts2
Эозиновое окрашивание (раствор спирт растворимый)	Servicebio	G1001
FBS	Nobimpex	B118-500
Forma Steri-Cycle i160 CO2 Инкубатор	Thermo Scientific	i60
Гематоксилиновое окрашивание синевой	Servicebio	G1040
Гематоксилиновое дифференцирующее средство	Servicebio	G1040
Гематоксилиновое окрашивание	Servicebio	G1004
Гемоцитометр	Solarbio	YA0810
Среда органоидов легочного аденокарциномы человека (3D среда)	PMO Bio	HC1001
Иммуногистохимическая (IHC) ручка	ZSGB-BIO	ZLI-9305	Хранить при 4°C
Лазерный конфокальный микроскоп FV3000	Olympus	FV3000	Обычный диапазон параметров: напряжение PMT: 500 ± 200 В; Пропускная способность лазера: 5 ± 3%; Смещение: 3 %
Ручной вращающийся микротом	Leica	RM2235
Металлическая ванна	ALLSHENG	MK-3000
Микроволновая печь	Galanz
Лак для ногтей	Lete
Нейтральный бальзам (монтажное средство для микроскопии)	Beyotime	C0173
Специфический для органоидов внеклеточный матрикс гель	PMO Bio	BM1001
PBS	WISENT	311-010-CL
Перекисное блокирующее средство	Beyotime	P0100A
Пипетки	Eppendorf	312300063/312300020/312400083
Наконечники для пипеток	Axygen	14-222-692/14-222-723/14-222-869	Рассмотрите возможность использования наконечников с низким удержанием, если это возможно.
Трехмерный шейкер	SCILOGEX	SK-D3309-Pro	Низкая скорость.
Водяная ванна для плавучести тканей	KEDEE	KD-P
Тритон X-100	VWR	92046-34-9
Трипан-синий	Gibco	15250061
TryPLE	Gibco	12605028
TTF1 рекомбинантное моноклональное антитело	HUABIO	HA720067