Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Быстрое производство рекомбинантной человеческой рибонуклеазы SLFN14 и стехиометрический анализ с помощью массовой фотометрии

961 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70393

⸱

20 февраля 2026 г.

 ,  , 
1Department of Structural Biology, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo, SUNY, 2Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, Baylor College of Medicine, 3Therapeutic Innovation Center (THINC), Baylor College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает получение рекомбинантной человеческой рибонуклеазы SLFN14 и её стехиометрический анализ с помощью массовой фотометрии.

Аннотация

Рибонуклеазы — это специализированный класс белков, связывающих РНК, которые катализируют расщепление РНК и участвуют в различных биологических процессах, включая регуляцию генов. Тем не менее, структура, функция и регуляция многих человеческих рибонуклеаз остаются плохо изученными из-за трудностей с производством рекомбинантного белка. Этот метод описывает эффективный подход к экспрессии переходных веществ, очистке и стехиометрическому анализу человеческой рибонуклеазы Schlafen-14 (SLFN14). Рекомбинантный флаг-маркированный SLFN14 экспрессировался в суспензионных клетках HEK293 и изолирован с помощью быстрого двухэтапного процесса очистки, включающего хроматографию с аффинностью антифлага и хроматографию исключения размеров низкого разрешения. Масс-фотометрия, чувствительный метод с одной молекулы, показала, что в физиологических соляных условиях SLFN14 образует стабильный гомодимер, связанный с клеточной РНК, тогда как высокая соль способствует диссоциации РНК при сохранении гомодимерной структуры. Полученный рекомбинантный человеческий белок SLFN14 подходит для последующих структурных исследований и качественных биохимических анализов. Этот быстрый подход к рекомбинантному выделению человеческих белков и характеристике образцов широко применим для производства других рибонуклеаз у млекопитающих и РНК-связывающих белков, предназначенных для биофизической и биохимической характеристики.

Введение

Schlafen 14 (SLFN14) — недостаточно изученный фактор рестрикции рибонуклеазы и фактора рестрикции хозяина умлекопитающих 1,2,3. Человеческий белок SLFN14 относится к шестичленному семейству регуляторов генов SLFN, играющих роль в иммунитете, противовирусной активности, хемочувствительности и дифференцировкеклеток 4,5,6,7,8. Механистическое понимание роли регуляторов генов SLFN остаётся неполным; Однако многие члены обладают активностью рибонуклеазы, необходимой для трансляционногоконтроля 7,9. Рибонуклеазы SLFN активируются при гомодимеризации белка, образуя составную РНК-связывающую расщелину, способную расщеплятьсубстрат 10,11. Для защиты клеток от ложного распада РНК большинство рибонуклеаз SLFN преимущественно существуют как мономеры и ожидают активации молекулярными сигналами, специфичными для каждого членасемейства 5,7,11,12.

Рекомбинантное производство человеческого SLFN14 позволило провести комплексные молекулярные исследования этого ранее неизученного рибонуклеазы, что дало новые представления о её функции ирегуляции 2,13,14. Очищенный рекомбинантный белок SLFN14 ускорен характеристику своей структурозависимой активности расщепления переносной РНК с помощью in vitro тестов расщепленияРНК 2,14. Исследования очищенного белка SLFN14 с помощью криоэлектронной микроскопии (cryoEM) также выявили гомодимерную структуру SLFN14, при которой дуплексированная РНК загружается в центральную щель 2,13,14. Сборка SLFN14 высшего порядка дополнительно характеризулась масс-фотометрией — одномолекулярной техникой измерения молекулярной массы. Неожиданно, этот чувствительный метод демонстрирует, что SLFN14 преимущественно образует солестойкий гомодимер, но также может образовывать солечувствительный гомотетрамер неизвестнойфункции 2,13,14. В совокупности способность получать очищенный человеческий белок SLFN14 стала важной вехой, позволившей получить ранние молекулярные открытия, которые, несомненно, станут стимулом захватывающего нового этапа исследований в области трансляционного контроля, опосредованного SLFN14.

Рекомбинантная рибонуклеаза SLFN14 исторически была труднодоступна с помощью стандартных стратегий производства белка. В оригинальном отчёте, описывавшем ферментативную активность SLFN14, отмечалась его низкая выходность, снижение стабильности и низкаярастворимость 1. Белок SLFN14 человека характеризуется длинной полипептидной цепью, выраженной гидрофобностью и рибонуклеазно-зависимой цитотоксичностью, что вместе во многом затрудняет использование традиционных бактериальныхэкспрессийных систем 1,13,14. Однако сложные эукариотические трансляционные и шаперонные механизмы предлагают мощную альтернативу, эффективно производящую полноразмерный человеческий белокSLFN14 15. Для получения полноразмерного белка SLFN14 человека использовались как системы экспрессии бакуловируса-насекомых, так и млекопитающих для получения полноразмерного белка SLFN14 для исследований криоЭМ и биохимическихтестов 2,13,14. Однако в некоторых случаях белок SLFN14, полученный из насекомых, требовал стабилизирующих мутаций для предотвращения агрегацииобразца 2. Доставка генов, опосредованная бакуловирусом, также связана с значительной нагрузкой и длительным временем подготовки, что задерживает прогрессисследований 15,16. С другой стороны, рекомбинантный белок SLFN14, выделенный от экспрессионного хозяина млекопитающих, обеспечивает преимущество скорости и избегает необходимости в белковой инженерии для оптимизации образцов.

Этот метод разработан для обеспечения относительно быстрого и малозатратного подхода к получению рекомбинантного белка дикого типа SLFN14, подходящего для молекулярных исследований последующих процессов. Использование клеток млекопитающих обеспечивает почти естественную среду для поддержания правильного сворачивания белка без необходимости инженерии белков SLFN1413. Химический метод доставки генов, в отличие от стратегии с вирусным вектором, также ускоряет сроки производства с нескольких месяцев до15 дней. Чтобы компенсировать относительно высокую стоимость культуры клеток млекопитающих, этот метод использует экономичный реагент для трансфекции полиэтиленимина (PEI) и трансфекционно-эффективные клетки человеческой эмбриональной почки 293 (HEK293), выращенные всуспензии 17,18. Для минимизации потерь белка при обработке образцов эта процедура также использует стратегии низкопотребления образцов для очистки белка SLFN14 и стехиометрического анализа для контроля качества образцов. Этот четырёхдневный протокол содержит конкретные детали о том, как выполнять 1) экспрессию временных генов в клетках HEK293, 2) двухэтапный хроматографический процесс с использованием спиновых колонок и 3) определение стехиометрии белков с помощью масс-фотометрии. Конечным продуктом этой процедуры является белок дикого типа человека SLFN14, содержащий двойной C-терминальный Myc-флаг метку (SLFN14Myc-Flag), который может использоваться для последующих криоЭМ-исследований и качественной биохимической характеристики13. Этот универсальный подход может быть применён для выделения и характеристики других малоизученных белков, связывающих человеческую РНК, особенно крупных и цитотоксических генов рибонуклеазы, которые часто трудно переэкспрессировать в гетерологичных системах экспрессии. Таким образом, этот протокол снижает барьер для всесторонней молекулярной характеристики человеческого протеома.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Эксперименты с культурой клеток HEK293 должны проводиться в условиях уровня биобезопасности 2 (BSL-2) в соответствии с утверждёнными институциональными протоколами биобезопасности.

1. Временная экспрессия SLFN14Myc-Flag в клетках млекопитающих

  1. Семена млекопитающих HEK293 суспензированные клетки размером 0,5 x 106 клеток/мл в предварительно подогревшуюся безсывороточную среду для роста для конечного объёма 320 мл в вентилируемой колбе на 1 л.
  2. Инкубировать клетки при 37 °C, 125 об/мин, 8%CO2, влажности 75-80% в течение 24-32 часов.
  3. Проверьте, что количество клеток составляет 1,2-1,8 x 106 клеток/мл, а жизнеспособность превышает 90%, используя трипан-синий окрашивание и счётчикклеток 19.
  4. Декант 40 мл посева в восемь конических трубок.
  5. Собирайте клетки центрифугированием при 400 х г в течение 5 минут при 20-25 °C.
  6. Отбросьте материал для роста.
  7. Аккуратно суспензируйте каждую клеточную гранулу в 38 мл предварительно нагретой безсывороточной среды для окончательного объёма 304 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оставшиеся 16 мл исходного объёма культуры, описанного на шаге 1.1, будут обеспечиваться трансфекционной смесью, описанной на шаге 1.12.
  8. Перенесите клетки в новую вентиляционную колбу на 1 Л.
  9. В конической трубке добавьте 320 мкг очищенной плазмидной ДНК, кодирующей рекомбинантный ген SLFN14Myc-Flag , к 8 мл среды без сыворотки и инкубировать в течение 5 минут при температуре 20-25 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация плазмиды обычно составляет 500 нг/мкл при конечном объёме 640 мкл.
  10. Параллельно с шагом 1.9 добавьте 960 мкг стерилизованного PEI с фильтром 0,22 мкм в 8 мл среды без сыворотки и инкубировать в течение 5 минут при 20-25 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий запас обычно составляет 1 мг/мл при итоговом объёме 960 мкл.
  11. Медленно добавляйте смесь PEI (см. шаг 1.10) по капле в раствор рекомбинантной плазмидной ДНК (см. шаг 1.9) и инкубировать 15 минут при 20-25 °C.
  12. Медленно добавляйте 16 мл смеси ДНК/PEI по капле в клетки, подготовленные на шаге 1.8.
  13. Инкубировать клетки при 37 °C, 125 об/мин, 8%CO2, влажности 75-80% в течение 48 часов.
  14. Декантировать 40 мл трансфектированных клеток в восемь конических трубок.
  15. Извлекайте трансфектированные клетки центрифугированием при 400 х г в течение 5 минут при 20-25 °C.
  16. Декантуйте супернатант и храните восьмиклеточные гранулы при -80 °C.

2. Двухступенчатая рекомбинантная очистка SLFN14Myc-Flag

  1. Хроматография с аффинитетом антифлагов.
    Выполните протокол хроматографии с аффинностью антифлага в дубликате, используя четыре клеточные гранулы из шага 1.16 для каждого препарата.
    1. Подготовка смолы.
      1. Equilibrate антифлаговую агарозовую смолу до 20-25 °C в течение 15 минут.
      2. Аккуратно подвесьте смолу, перевернув бутылку непосредственно перед передачей 40 мкл 50% смоляной суспензии в микроцентрифугную трубку объемом 2 мл.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Отрежьте конец кончика пипетки, чтобы легко собирать вязкую суспензию.
      3. Смолу повторно суспензировать в 1 мл высокосолёного буфера для промывки (50 мМ Tris pH 7,4, 600 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2, 0,5 мМ β-ME, 0,1% Tween-20).
      4. Инкубировать 45 минут при 4 °C.
      5. Центрифугуйте смоляную суспензию при 8 000 х г в течение 2 минут при 4 °C.
      6. Аспирируйте и сбросьте буфер с высоким содержанием соли, осторожно не повредив смолу.
    2. Уточнение клеточного лизата.
      1. Повторно суспензировать каждую трансфектированную клеточную гранулу с помощью 225 мкл охлаждённого буфера реанимации (50 мМ Tris pH 7,4, 600 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2, 0,5 мМ β-ME, 0,5% Triton-X-100, 1 мМ PMSF, 5 мкг/мл Леупептин, 1 мМ бензамидина, 0,7 мкг/мл Пепстатина А, 0,25 Ед/мл Гений нуклеазы) для общего объёма 900 мкл на четыре клеточных гранулы.
      2. Переносите клетки в микроцентрифугную трубку объемом 2 мл, предварительно охлаждённую на льду.
      3. Инкубировать микроцентрифужную трубку горизонтально на нутаторе в течение 30 минут при 4 °C.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Храните 20 мкл аликвота общего лисата при -20 °C для устранения проблем в случае низкой экспрессии белка.
      4. Очистить лизат клетки центрифугой при 21 300 x g в течение 20 минут при 4 °C.
    3. Захват и промывания белков.
      1. Комбинировать очищенный лизат (см. шаг 2.1.2.4) с уравновешенной смолой против флага (см. шаг 2.1.1.6).
      2. Инкубировать смесь лизата и смолы в микроцентрифугной трубке, горизонтально расположенной на нутаторе, в течение 60 минут при 4 °C.
      3. Центрифугуйте смесь лизат-смола при 8 000 x g в течение 2 минут при 4 °C, чтобы получить смоловую гранулу.
      4. Отбросьте примерно 700 мкл супернатанта, чтобы не повредить смоловую гранулу.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Храните 20 мкл аликвота супернатанта при -20 °C после связывания смолы для устранения неполадок при низкой эффективности захвата.
      5. Суспензировать оставшуюся смесь с супернатированием смолы и перевести раствор в пустую спин-колонку ёмкостью 800 мкл, вставленную в пустую микроцентрифугу объёмом 2 мл.
      6. Центрифугуйте спин-колонку при 1000 x g в течение 2 минут при 4 °C и отбросьте сквозной поток.
      7. Промыйте пустую трубку микроцентрифуги с шага 2.1.3.5 с помощью 500 мкл буфера для промывки с высоким содержанием соли и переведите раствор в спин-колонку.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап помогает восстановить остатки смолы в пробирке микроцентрифуги.
      8. Центрифугуйте спин-колонку при 1000 x g в течение 2 минут при 4 °C и отбросьте сквозной поток.
      9. Добавьте 500 мкл буфера с высоким содержанием соли в спин-колонку. Центрифугуйте спин-колонку при 1000 x g в течение 2 минут при 4 °C и отбросьте сквозной поток. Повторите этот шаг — всего четыре промывания с высоким содержанием соли.
      10. Добавьте 500 мкл буфера с низким содержанием соли (50 мМ Tris pH 7,4, 150 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2, 0,5 мМ β-ME, 0,1% Tween-20) в спин-колонку. Центрифугуйте спин-колонку при 1000 x g в течение 2 минут при 4 °C и отбросьте сквозной поток. Повторите этот шаг для всего двух промывок с низким содержанием соли.
      11. Добавьте 500 мкл буфера промывания АТФ (50 мМ Tris pH 7,4, 150 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2, 0,5 мМ β-ME, 0,1% Tween-20, 10 мМ АТФ) в спин-колонку. Закрыйте нижнюю часть спин-колонки и инкубуйте 5 минут при 4 °C. Отключите спин-колонку и центрифугу при 1 000 x g на 2 минуты при 4 °C и отбросьте проток сквозного канала. Повторите этот шаг — всего получится четыре промывания с АТФ.
      12. Проведите финальную промывку, добавив 500 мкл буфера с низким содержанием соли в спин-колонку. Центрифугуйте спин-колонку при 1000 x g в течение 2 минут при 4 °C и отбросьте сквозной поток.
    4. Элюция белка с помощью пептида 3xFlag.
      1. Промокните нижнюю часть спин-колонки влажной салфеткой с низким количеством ворса, чтобы удалить лишнюю жидкость, и заблокируйте нижнюю часть спиновой колонны.
      2. Добавьте 55 мкл буфера элюции 3xFlag (50 мМ Tris pH 7,4, 150 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2, 0,5 мМ β-ME, 0,1% Tween-20, 300 мкг/мл 3xFlag пептида) непосредственно на смолу.
      3. Герметизируйте отверстие спиновой колонны парапленкой и поместите её в микроцентрифугную трубку объёмом 1,7 мл.
      4. Инкубировать спин-колонку вертикально на нутаторе в течение 60 минут при 4 °C.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы удержать спин-колонку вертикально, на нутатор установите трубчатый рельс микроцентрифуги с помощью резинок.
      5. Удалите парапленку и пробку из вращающейся колонны. Собрать элюированный рекомбинантный белок SLFN14Myc-Flag в чистую микроцентрифугную трубку объёмом 1,7 мл путём центрифугирования при 1000 x г в течение 2 минут при 4 °C.
      6. Сохранять 50 мкл антифлаговой смолы для последующей хроматографии исключения размеров и 5 мкл для анализа SDS-PAGE.
  2. Хроматография исключения размеров.
    Проведите протокол хроматографии исключения размера, используя буфер для обезсоления с низким содержанием соли (150 мМ NaCl) для стандартного анализа белка SLFN14Myc-Flag или буфер для обезсоления с высоким содержанием соли (500 мМ NaCl) для характеристики APO SLFN14Myc-Flag .
    1. Объедините две 50-мкл анти-флаг-смолы из шага 2.1.4.6 для получения всего 100 мкл образца.
    2. Подготовьте колонку для десоляции спинов объёмом 0,5 мл с отсечением молекулярной массы 40 кДа, ослабив крышку, сняв нижнюю крышку и вставив её в микроцентрифугную трубку объемом 2 мл.
    3. Центрифугуйте колонку спин-десолизации при 700 x g в течение 1 минуты при 4 °C, чтобы удалить раствор для хранения колонны. Отбросьте поток от прохождения.
    4. Добавьте 300 мкл буфера для обезсоления с низким или высоким содержанием соли (20 мМ Tris pH 7,4, 150/500 мМ NaCl, 1 мМ MgCl2, 1 мМ TCEP) в колонку спин-десолизации. Центрифугуйте спин-колонку при 700 x g в течение 1-2 минут при 4 °C и отбросьте проток сквозного канала. Выполните этот шаг три раза, чтобы полностью уравновесить столбц.
    5. Промокните нижнюю часть колонки для обезсоления сна влажной салфеткой с низким количеством ворса.
    6. Перенесите спиновую колонку для обезсоли в чистую микроцентрифугную трубку объёмом 1,7 мл.
    7. Добавьте 100 мкл комбинированной смолы против флага (см. шаг 2.2.1) в центр столба, не нарушая смолу.
    8. Элюируйте рекомбинантный белок SLFN14Myc-Flag , центрифугировав спин-десольную колонку при 700 x g в течение 2 минут при 4 °C.
    9. Сохранить 95 мкл восстановленного рекомбинантного белка для молекулярной характеристики и 5 мкл для анализа SDS-PAGE.
  3. Характеристика очищенного рекомбинантного белка SLFN14Myc-flag .
    1. Проведите электрофорез гель-электрофорезом натрия додецилсульфата полиакриламида (SDS-PAGE).
      1. Комбинировать 5 мкл 2x буфера образца Laemmli с 5 мкл аликвотами, собранными на отдельных этапах протокола очистки.
      2. Проба тепла при 95 °C в течение 5 минут.
      3. Разрешить широкодиапазонную белковую лестницу вместе с 10 мкл буферной смеси образца и Laemmli при 4-15% SDS-PAGE при 200 В в течение 30 минут.
      4. Визуализируйте белковые полосы, окрашивая гель раствором краски Coomassie G-250 в течение 30 минут на орбитальном шейкере и очищайте гель деионизированной водой на орбитальном шейкере, пока фон не станет чистым.
      5. Проверьте полученные белковые полосы, чтобы убедиться, что полученный образец с шага 2.2.9 представляет собой одну белковую зону, соответствующую теоретической молекулярной массе SLFN14Myc-Flag — 107,5 килодальтон (кДа).
    2. Количественная оценка белков и нуклеиновых кислот с помощью ультрафиолет/виз-спектрофотометрии.
      1. Опустите микрообъёмный спектрофотометр с 2 мкл буфера для обезсоления с низким или высоким содержанием соли, соответствующего буферу хранения белка.
      2. Измерьте поглощение на 260 нм и 280 нм от 2 мкл восстановленного рекомбинантного белка SLFN14Myc-Flag (см. шаг 2.2.9) с помощью микрообъёмного спектрофотометра.
      3. Рассчитайте концентрацию рекомбинантного белка SLFN14Myc-Flag , используя зафиксированную поглощённость на 280 нм и коэффициент вымирания (93330 M-1 см-1) с использованием закона Беера-Ламберта20.
      4. Вычислите коэффициент поглощения образца A260/280, деля значение поглощения, зафиксированное на 260 нм, на значение поглощения, измеренное на 280 нм, чтобы определить, коочищается ли нуклеиновая кислота с рекомбинантным белком SLFN14Myc-Flag .
        ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение A260/280 выше 0,7, вероятно, указывает на наличие нуклеиновойкислоты 21.
    3. Количественно измерить клеточную РНК с помощью флюорометрии.
      1. Количественно измерить содержание РНК с помощью 1-3 мкл восстановленного рекомбинантного белка с шага 2.2.9 с помощью высокочувствительного РНК-специфического флуоресцентногокрасителя 22.

3. Анализ молекулярной массы SLFN14Myc-Flag с помощью массовой фотометрии

  1. Установка приборов масс-фотометра.
    1. Включите лазер с помощью переключателя на задней панели масс-фотометра.
    2. Включите изоляционный дек и нажмите кнопку «изоляция», чтобы минимизировать вибрации приборов.
    3. Откройте программное обеспечение AcquireMP.
    4. Подождите 1 час, пока прибор достигнет теплового равновесия.
  2. Подготовка к слайду для обложки.
    1. Держите стеклянную крышку вертикально с помощью мягкого пинцета.
    2. Промыйте обе стороны стеклянного стекла водой Type I Ultra Pure и затем изопропиловым спиртом. Повторите этот шаг всего три раза.
    3. Промойте обе стороны стеклянной крышки в последний раз водой Type I Ultrapure в течение 45 секунд.
    4. Аккуратно удаляйте лишние капли воды из стеклянной крышки с помощью аспирации с помощью чистого наконечника пипетки, подключённой к пылесопроводной линии.
    5. Храните стеклянный стеклянный затвор в пластиковой коробке, выстланной бумагой для объективов для транспортировки к масс-фотометру.
  3. Закрепите крышку на инструменте.
    1. Поставьте кремниевую прокладку с 6 лунок на инструмент для выравнивания металла с помощью мягких пинцетов.
    2. Положите стеклянную крышку с шага 3.2.5 поверх кремниевой прокладки и используйте мягкие пинцеты, чтобы слегка прижать на силиконовую прокладку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикладывайте давление на скважины.
    3. Капните каплю погружного масла на окулюс масс-фотометра.
    4. Поверните стеклянную крышку так, чтобы силиконовая прокладка была направлена вверх, и аккуратно положите стеклянную крышку на окул с помощью мягкого пинцета.
    5. Закрепите верхний левый и нижний правый углы стеклянной крышки с помощью магнитов.
    6. Под боковым управлением выберите верхний левый угол в программном обеспечении AcquireMP, чтобы выровнять лазер с центром ямы.
  4. Анализируйте стандарты белка широкого диапазона.
    1. Приготовьте раствор калибра 50x широкого диапазона (90 кДа до 1 МДа), разбавляя 1 мкл приклада 500x в 9 мкл 1x фосфатно-буферный физиологический раствор.
    2. Подготовьте рабочий приклад калибра 5x с помощью смеси 2 мкл раствора широкого диапазона калибра 50x с шагом 3.4.1 в 18 мкл 1x фосфатно-буферный физиологический раствор.
    3. Добавьте 10 мкл фильтрованного буфера с низким или высоким содержанием соли в пустую яду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно сопоставить фильтрованный буфер на этом этапе с буфером, используемым для подготовки образца SLFN14Myc-Flag на шаге 2.2.9.
    4. Закрой крышку.
    5. В разделе «Найти фокус» нажмите «капельное разбавление» в программном обеспечении AcquireMP, чтобы определить правильный фокус пробной ямы.
    6. Добавьте 10 мкл 5-кратного рабочего приклада в буферную каплю (см. шаг 3.4.3) и аккуратно пипетируйте вверх-вниз, чтобы перемешать раствор.
    7. Закрой крышку.
    8. Проверьте настройки прибора, чтобы убедиться, что значения движения, сигнала, насыщенности и резкости стабильны и оптимальны.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальные значения будут выглядеть синими, а выбросы — оранжевым.
    9. Нажмите «записать» в программном обеспечении AcquireMP, чтобы записать видео длительностью 60 секунд.
    10. Сохраните файл результата (.mpr) с описательным заголовком и временной меткой.
  5. Создайте кривую калибровки.
    1. Откройте программу DiscoverMP.
    2. В разделе измерений нажмите кнопку «+ open» и перейдите к файлу результатов калибра из шага 3.4.10.
    3. Дважды кликните по перечисленному файлу стандартов белка, чтобы увидеть результаты.
    4. При конфигурации графика отрегулировать границы контраста на 0,00000 и -0,03000 соответственно.
    5. Ручно определите гауссовскую кривую для первых четырёх стандартных пиков белка, перетаскивая курсор по каждой отдельной пике.
    6. Нажмите «Создать» и выберите «калибровка массы».
    7. В заголовке калибра присвоите каждому пику подходящего калибра с шага 3.5.5 к известной молекулярной массе 86, 172, 258 и 344 кДа соответственно.
    8. Проверьте, что калибровочная кривая имеет R2 , близкое к 1.0, и максимальную массовую ошибку (MME) менее 2%.
    9. Нажмите «подтвердить калибровку» и сохраните файл кривой калибровки (.mc).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Масс-фотометр следует перекалибровать каждый час.
  6. Анализировать рекомбинантный белок SLFN14Myc-flag в условиях с низким и высоким содержанием соли.
    1. Приготовьте раствор 50 мкл рекомбинантного белка SLFN14Myc-Flag с концентрацией 50 мкл (см. шаг 2.2.9) с использованием буфера для обезсоления с низкой солью для стандартного анализа образцов в физиологических соляных условиях или буфера с высоким содержанием соли для характеристики образца образцов апо-белка.
    2. Центрифугуйте рекомбинантную белковую смесь SLFN14 Myc-Flag с массой 50 нм в 21 300 x г в течение 10 минут при 20-25 °C для удаления потенциального белкового агрегата и пыли.
    3. Под боковым управлением нажмите «следующая скважина» в программном обеспечении AcquireMP.
    4. Загрузите в скважину 10 мкл фильтрованного буфера с низким или высоким содержанием соли с низким или высоким содержанием соли и закройте крышку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно сопоставить фильтрованный буфер на этом этапе с буфером, используемым для подготовки разбавления образца SLFN14Myc-Flag на шаге 3.6.1.
    5. В разделе «найти фокус» нажмите «капельное разбавление», чтобы определить правильный фокус новой пробной ямы.
    6. Загрузите 10 мкл 50 нМ рекомбинантного раствора белка SLFN14Myc-Flag с шага 3.6.2 в буферную каплю и аккуратно пипетить для смешивания образца.
    7. Закройте крышку и убедитесь, что оптимальные настройки прибора, как описано в шаге 3.4.8.
    8. Нажмите «записать» в программном обеспечении AcquireMP, чтобы записать видео длительностью 60 секунд.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное массовое разрешение достигается на 60-секундном видео с примерно 1 000-4 000 общих подсчётов.
    9. Сохраните файл результата (.mpr) с описательным заголовком и временной меткой.
  7. Рассчитайте молекулярную массу и стехиометрию рекомбинантного белка SLFN14Myc-Flag .
    1. В разделе измерений в программном обеспечении DiscoverMP нажмите кнопку «+ open», чтобы выбрать файл результата из шага 3.6.9.
    2. В разделе калибровки двойной клик по файлу кривой калибровки, созданном на шаге 3.5.9, чтобы применить калибровку.
    3. Вручную определите гауссову кривую для каждого наблюдаемого вида SLFN14Myc-Flag , проведя курсор по каждому пику, чтобы получить рассчитанное молекулярное значение.
    4. Вычислите среднюю молекулярную массу для каждого олигомерного вида по трём независимым измерениям вместе с соответствующим стандартным отклонением.
    5. Определить стехиометрию рекомбинантного белка SLFN14Myc-Flag , оценив среднюю рассчитанную молекулярную массу с целыми числами теоретического массового значения протомера SLFN14Myc-Flag .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Теоретическая масса мономера SLFN14Myc-Flag составляет 107,5 кДа, димера — 215 кДа, тримера — 322,5 кДа, а тетрамера — 430 кДа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 1 иллюстрируется вектор млекопитающих, разработанный для экспрессии временных генов полноразмерного рекомбинантного белка человека SLFN14Myc-Flag. Двухэтапный процесс очистки показывает выделение белка SLFN14Myc-Flag из клеток HEK293 (рисунок 2A). Успешный представительный денатурирующий гель очищенного белка SLFN14Myc-Flag показан на рисунке 2B. Этап аффи...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Несколько ключевых шагов подчеркивают эффективность и универсальность этого протокола производства белка. Для максимизации выхода рекомбинантного белка мы используем клетки HEK293, которые высоко поглощают инопланетную плазмидную ДНК и могут культивироваться в суспензии для максимизации плотности клеток по всему объёмусреды 23. Реагент трансфекции PEI используется в этом крупномасштабном протоколе доставки трансгенов, поскольку он может обеспечивать высокую эффект...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим сотрудников лаборатории Пиллона за их критическое прочтение этой рукописи. Эта работа была поддержана Программой внешних исследований Национального института здравоохранения США, Национальным институтом общих медицинских наук (NIGMS; R35GM147123 в M.C.P.) выдан в Медицинский колледж Бэйлора и передан в Государственный университет Нью-Йорка в Буффало.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-меркаптоэтанол (b-Me)SigmaM3148-500ML14,3 M solutions tock
AcquireMP 2024 R2Рефейн/Программное обеспечение для сбора данных
Тригидрат аденозин-5'-трифосфат динатрия соли (АТФ)Chem-Impex International00015-100Gскорректировать решение до pH 7.0
Гель для аффинности M2 против флагаМиллипорA2220Антифлаговая смола с аффинитетом
Бензамидин гидрохлоридгидратSigmaB6506-25GИнгибитор протеазы
Стандарты белка широкого диапазона (10-250 кДа)Био-РадP7719SСтандарты предварительно окрашенных белков
Графиня 3ИнвитрогенA49862Автоматический счётчик ячеек
DiscoverMP v2024 R2Рефейн/Программное обеспечение для анализа данных
Физиологический раствор, буферированный фосфатом ДульбеккоКорнинг21-031-CV1x раствор приклада
Пептид DYKDDDDKТермо Фишер СайентификA36805Пептид 3xFlag
Ячейки FreeStyle 293-FТермо Фишер СайентификR79007Клетки суспензии млекопитающих
Geniust M nuclease DMF подалСанта-КрусSC-391121Bуниверсальная нуклеаза
HyClone CDM4HEK293 медиаЦитиваSH3085802Среда роста без сыворотки
Медиа HyClone SFM4Transfx-293ЦитиваSH3086002Переходная трансфекционная среда
Immersol 518FZeiss4Y00-R0DY-1007-3BF3Погружное масло
Изопропиловый спиртMacron Fine Chemicals3032-02
Laemmli sample bufferБио-Рад1610737Приклад с 2x раствором
ЛеупептинVWRJ580-25MGИнгибитор протеазы
Гексагидрат хлорида магния (MgCl2)Fisher ScientificM33-500
MassFerence P1 РефейнMP-CON-41033Приклад калибра 500x
Набор для подготовки образцов MassGlass UCРефейнMP-CON-21022затвор и прокладка
Микро-биоспин-колоннаБио-Рад7326204Пустой спин-колонна из полипропилена
Система Milli-Q IQ 7000МиллипорZIQ7000T0CУльтрачистая вода типа I
Гели Mini-Protean TGX без пятенБио-Рад45680864-15% SDS-PAGE
Минитрон с влажностью, охлаждением и CO2Инфомеры72175Шейкер инкубатора
Комплект для развал-схождения MPРефейнMP-CON-21019инструмент для выравнивания, пинцет с мягким наконечником, магнит
НанофотометрИмпленNP80УФ-виз-спектрофотометр
НутаторКлей Адамс Бранд421105
Пепстатин АСанта-Крусsc-45036BИнгибитор протеазы
Фенилметилсульфонилфторид (ПМСФ)Research Products InternationalP20270-25.0Ингибитор протеазы
Поликарбонатная встряхивающая фляга Дуран Уитон КимблWPFBC1000SВентиляционный запутанный базовый флакон
Полиэтиленимин (ПЭИ) МВт 40 000Полинауки24765Трансфекционный реагент
Флуорометр Кубит-4Термо Фишер СайентификQ33226
Набор для анализа кубитной РНК высокой чувствительностиТермо Фишер СайентификQ32852Количественная оценка с помощью РНК-специфического красителя
SimplyBlue SafeStainТермо Фишер СайентификLC6065Coomassie G-250
ДНК плазмиды экспрессии SLFN14ОридженRC226257Клон ORF с человеческим тегом
Хлорид натрия (NaCl)Миллипор1.37017
Трис, pH 7,4Термо Фишер СайентификJ60202. K21 м буферизованного материала
Трис (2-карбоксиэтил) фосфингидрохлорид (TCEP)Gold BiotechnologyTCEP10TCEP
Triton X-100VWRM143-1LМоющее средство
Трипан-синяя морилкаТермо Фишер СайентификT102820,4% раствора
Tween 20VWR0777-1LМоющее средство
TwoMPРефейнMP-PRO-00001Масс-фотометр
Zeba 40K Desaltin ColumnТермо Фишер СайентификA57759Хроматография исключения размеров

Ссылки

  1. Pisareva, V. P., Muslimov, I. A., Tcherepanov, A., Pisarev, A. V. Characterization of novel ribosome-associated endoribonuclease slfn14 from rabbit reticulocytes. Biochemistry. 54 (21), 3286-3301 (2015).
  2. Li, M., et al. Human schlafen 14 cleavage of short double-stranded rnas underpins its antiviral activity. Adv Sci (Weinh). 12 (37), e01727(2025).
  3. Seong, R. K., et al. Schlafen 14 (slfn14) is a novel antiviral factor involved in the control of viral replication. Immunobiology. 222 (11), 979-988 (2017).
  4. Jo, U., Pommier, Y. Structural, molecular, and functional insights into schlafen proteins. Exp Mol Med. 54 (6), 730-738 (2022).
  5. Lee, S., et al. Velcrin-induced selective cleavage of trna(leu)(taa) by slfn12 causes cancer cell death. Nat Chem Biol. 19 (3), 301-310 (2023).
  6. Murai, J., Thomas, A., Miettinen, M., Pommier, Y. Schlafen 11 (slfn11), a restriction factor for replicative stress induced by DNA-targeting anti-cancer therapies. Pharmacol Ther. 201, 94-102 (2019).
  7. Zhang, P., et al. Schlafen 11 triggers innate immune responses through its ribonuclease activity upon detection of single-stranded DNA. Sci Immunol. 9 (96), eadj5465(2024).
  8. Li, M., et al. Codon-usage-based inhibition of hiv protein synthesis by human schlafen 11. Nature. 491 (7422), 125-128 (2012).
  9. Valenzuela, C., Saucedo, S., Llano, M. Schlafen14 impairs hiv-1 expression in a codon usage-dependent manner. Viruses. 16 (4), (2024).
  10. Metzner, F. J., et al. Mechanistic understanding of human slfn11. Nat Commun. 13 (1), 5464(2022).
  11. Garvie, C. W., et al. Structure of pde3a-slfn12 complex reveals requirements for activation of slfn12 rnase. Nat Commun. 12 (1), 4375(2021).
  12. Kugler, M., Metzner, F. J., Witte, G., Hopfner, K. P., Lammens, K. Phosphorylation-mediated conformational change regulates human slfn11. Nat Commun. 15 (1), 10500(2024).
  13. Van Riper, J., et al. Cryoem structure of the slfn14 endoribonuclease reveals insight into rna binding and cleavage. Nat Commun. 16 (1), 5848(2025).
  14. Luo, M., et al. Structural and functional characterization of human slfn14. Nucleic Acids Res. 53 (10), (2025).
  15. Schellenberg, M. J., Maheshwari, S., Pillon, M. C. Encyclopedia of cell biology. Vol. 1, Elsevier. 57-73 (2022).
  16. Hutchinson, A., Seitova, A. Production of recombinant prmt proteins using the baculovirus expression vector system. J Vis Exp. (173), e62510(2021).
  17. Ojha, R., Timin, E., Szirovicza, L., Xu, W., Hepojoki, J. A systematic comparison of in-house prepared transfection reagents in the delivery of mrna or DNA to a wide range of cultured cells. J Biol Chem. 301 (12), 110742(2025).
  18. Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of hek293 cells in suspension. J Vis Exp. (106), e53568(2015).
  19. Piccinini, F., Tesei, A., Arienti, C., Bevilacqua, A. Cell counting and viability assessment of 2d and 3d cell cultures: Expected reliability of the trypan blue assay. Biol Proced Online. 19, 8(2017).
  20. Pace, C. N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G., Gray, T. How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. Protein Sci. 4 (11), 2411-2423 (1995).
  21. Glasel, J. A. Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios. Biotechniques. 18 (1), 62-63 (1995).
  22. Li, X., Ben-Dov, I. Z., Mauro, M., Williams, Z. Lowering the quantification limit of the qubittm rna hs assay using rna spike-in. BMC Mol Biol. 16, 9(2015).
  23. Swiech, K., et al. Transient transfection of serum-free suspension hek 293 cell culture for efficient production of human rfviii. BMC Biotechnol. 11, 114(2011).
  24. Gu, J., et al. Correction: Advances in the structures, mechanisms and targeting of molecular chaperones. Signal Transduct Target Ther. 10 (1), 117(2025).
  25. Bernhard, H., et al. Structural basis of spliced leader rna recognition by the trypanosoma brucei cap-binding complex. Nat Commun. 16 (1), 685(2025).
  26. Lai, S. H., Tamara, S., Heck, A. J. R. Single-particle mass analysis of intact ribosomes by mass photometry and orbitrap-based charge detection mass spectrometry. iScience. 24 (11), 103211(2021).
  27. Liu, H., May, K. Disulfide bond structures of igg molecules: Structural variations, chemical modifications and possible impacts to stability and biological function. MAbs. 4 (1), 17-23 (2012).
  28. Marenchino, M., Armbruster, D. W., Hennig, M. Rapid and efficient purification of rna-binding proteins: Application to hiv-1 rev. Protein Expr Purif. 63 (2), 112-119 (2009).
  29. Smith, L. M., et al. The human proteoform project: Defining the human proteome. Sci Adv. 7 (46), eabk0734(2021).
  30. Carrasco-Zanini, J., et al. Mapping biological influences on the human plasma proteome beyond the genome. Nat Metab. 6 (10), 2010-2023 (2024).
  31. Adhikari, S., et al. A high-stringency blueprint of the human proteome. Nat Commun. 11 (1), 5301(2020).
  32. Liao, J. Y., et al. Rbpworld for exploring functions and disease associations of rna-binding proteins across species. Nucleic Acids Res. 53 (D1), D220-D232 (2025).
  33. Gebauer, F., Schwarzl, T., Valcarcel, J., Hentze, M. W. Rna-binding proteins in human genetic disease. Nat Rev Genet. 22 (3), 185-198 (2021).
  34. Poodts, J., et al. Improved expression of sars-cov-2 spike rbd using the insect cell-baculovirus system. Viruses. 14 (12), (2022).
  35. Mckenzie, E. A., Abbott, W. M. Expression of recombinant proteins in insect and mammalian cells. Methods. 147, 40-49 (2018).
  36. Shi, X., Jarvis, D. L. Protein n-glycosylation in the baculovirus-insect cell system. Curr Drug Targets. 8 (10), 1116-1125 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Производство рекомбинантных белковРНК-связывающие белкисуспензионные клетки HEK293аффинная хроматографияэксклюзионная хроматографиястехиометрия белковэлектрофорез в ПААГ с SDSбиохимическая характеристика
Быстрое производство рекомбинантной человеческой рибонуклеазы SLFN14 и стехиометрический анализ с помощью массовой фотометрии
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.