Методическая статья

Картирование морфологии звёздчатых клеток печени в мышиных моделях фиброза печени

DOI:

10.3791/70396

⸱

13 февраля 2026 г.

 , 
1Division of Liver Diseases, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол представляет собой комплексный конвейер визуализации для визуализации и моделирования морфологии звёздчатых клеток печени в целостной ткани печени. Этот подход сочетает флуоресцентную маркировку фибробластов с использованием генетики мышей, подготовку тканей на основе перфузии печени in situ и модифицированный метод очищения тканей iDISCO для достижения оптической прозрачности.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Фибробласты, проживающие в тканях, являются клеточными драйверами фиброза в тканях. Внутри печени пепатичные звёздчатые клетки (ГСК), резидентные перициты с уникальной «звездообразной» морфологией, во время повреждения активируются в фиброгенные миофибобласты, образуя печеночный рубец. Хотя десятилетия исследований выясняли основные сигнальные пути, лежащие в основе активации HSC, функциональная значимость их уникальной дендритной морфологии остаётся неясной из-за технических ограничений в визуализации и анализе. Этот протокол представляет собой комплексный конвейер визуализации для визуализации и моделирования морфологии HSC в целостной ткани печени. Этот подход сочетает флуоресцентную маркировку HSC с использованием генетики мышей, препарат тканей на основе перфузии печени in situ и модифицированный метод очищения тканей iDISCO для достижения оптической прозрачности в образцах тканей толщиной в несколько сантиметров. Очищенные образцы снимаются с помощью оптимизированных платформ конфокальной микроскопии, а наборы данных изображений обрабатываются через индивидуальный аналитический рабочий процесс для трёхмерной реконструкции отдельных ГСК с разрешением одной ячейки. Вместе этот конвейер позволяет воспроизводимо картировать морфологию HSC в сложной микросреде печени, включая их дендритные процессы и пространственные связи с соседними клетками. Помимо печени, рабочий процесс адаптируется к фибробластам в других органах, таких как легкие, почки, кишечник и сердце, где местные мезенхимальные клетки проявляют схожие фиброгенные функции при заболеваниях. Таким образом, предлагаемая структура закладывает методологическую основу для сравнительных межорганных исследований с целью изучения взаимосвязей структуры и функций фибробластов и терапевтических уязвимостей при фиброзных заболеваниях.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Фиброз, или патологическое рубцование тканей, является последним общим путём почти всех хронических заболеваний органов и способствует примерно 40% смертей в индустриально развитых странах1. В печени фиброз возникает из-за хронических заболеваний, таких как вирусный гепатит, употребление алкоголя или всё чаще — стеатозное заболевание печени, связанное с метаболической дисфункцией (MASLD), которое в настоящее время поражает 30-40% взрослых в США. Хронические повреждения печени и связанный с этим прогрессирующий фиброз резко увеличивают риск терминальных заболеваний печени, таких как цирроз, печёночная недостаточность и гепатоцеллюлярнаякарцинома 2. 3,4,5.

Звёздообразные клетки печени (ГСК) являются центральными для гомеостаза и фиброгенеза печени. В здоровой печени ГСК находятся в спокойном, накапливающем состоянии витамина А и способствуют гомеостазу печеноцитов и, в целом, всейпечени 6,7. Это ясно демонстрируется исследованиями истощения ГСК, где удаление почти всех ГСК в здоровой печени снижает массу печени и сильно ограничивает регенерациюпечени 7,8. При повреждении ГСК активируются в клетки, похожие на миофибробласты, которые размножаются, мигрируют в повреждённые участки и образуют избыточный внеклеточный матрикс (ЭКМ), образуя фиброзные рубцы. Активированные HSC в фиброзной печени также являются источником афбробластов, связанных с раком, и играют роль стимулирующего опухоли при гепатоцеллюлярнойкарциноме 9,10,11,12. Покойные ГСК обладают уникальной нейроноподобной морфологией с малыми клеточными телами, из которых выходят дальний проекционный диапазон. HSC при активации прифиброзе 13 переходят в плоскую, похожую на слой форму миофибробласта. Хотя десятилетия исследований выяснили сигнальные пути, контролирующие производство ЭБ ГСК, функциональная значимость их уникальной нейронной морфологии, её регуляция, возможность способствовать взаимодействиям внутри ниши ГСК и способствовать фиброгенности и заболеванию ГСК остаются неясными.

Современные методы визуализации морфологии ГСК ограничены двумерными (двумерными) изображениями как культивируемых клеток in vitro , так и сечений тканей in vivo , и редко охватывают всю морфологию ГСК с проекциями, простирающимися на несколько длин клеток во всех направлениях. Кроме того, наиболее часто используемый маркер HSC, десмин, не может полностью отразить уникальную нейронную морфологию HSC при иммунофлуоресцентном окрашивании, поскольку десмин — это цитоскелетный белок, который маркирует только промежуточные филаменты внутриHSC 16. Эти методологические сложности до сих пор затрудняли возможность полностью охватить морфологию HSC и их клеточные взаимодействия в трёхмерном (3D) виде в их естественном контексте с разрешением одной клетки. В результате фундаментальные вопросы о том, как морфология HSC связана с их функциональным состоянием и взаимодействием с соседними типами клеток, остались нерешёнными.

В этой статье представлен инновационный и комплексный процесс визуализации и анализа для визуализации и моделирования морфологии ГСК в целостной ткани печени. Этот метод интегрирует несколько ключевых инноваций: (1) флуоресцентное маркирование ГСК с использованием генетических репортерских моделей мышей, (2) оптимизировано перфузию и фиксацию печени in situ для сохранения нетронутой архитектуры тканей и клеточных отношений, (3) модифицированный протокол очищения тканей на базе iDISCO для достижения оптическойпрозрачности; (4) высокоразрешающую конфокальную микроскопию для глубокотканевого захвата изображений и (5) индивидуальный вычислительный рабочий процесс для реконструкции 3D-изображений и количественных данных анализ отдельных HSC. Протокол накладывает определённые ограничения на размер ткани и временные затраты, которые необходимо учитывать. В совокупности этот протокол обеспечивает надёжную и воспроизводимую основу для захвата сложной трёхмерной структуры HSC и для картирования их пространственных связей с соседними сосудистыми, иммунными и паренхимическими клетками. Стратегии и каналы, представленные здесь для печени, легко адаптируются и к другиморганам 17,18,19.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты на мышах, использованные в этом исследовании, были одобрены Медицинской школой Икана при Комитете по уходу и использованию животных Маунт-Синай. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Генерация мышей с HSC, маркированными tdTomato (TdT)

  1. Настройте заводчиков Tg(lox-stop-lox-TdTomato) x Tg(Lrat:Cre) (штамм Jackson Laboratories #00791420 и Mutant Mouse Resource & Research Centers (MMRRC) сорт #06959521-JAX соответственно).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидайте наполнитель через 3 недели. Используйте самок LratCre для размножения, так как в зародышевой линии самца обнаружена экспрессия Cre.
  2. Соберите хвосты и генотип помёт F1 для идентификации Tg(Lrat:Cre); Мыши Tg(LSL-TdT), селективно экспрессирующие флуорофор TdTomato в звёздчатых клетках печени.

2. Перфузия печени in situ и фиксация

  1. Подготовка до операции
    1. Приготовьте смесь кетамина и ксилазина для анестезии у мышей, смешав 2 мл кетамина, 1 мл ксилазина и 7 мл воды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кетамин является контролируемым веществом и требует надлежащей лицензии и регулирования для лабораторного использования.
    2. Приготовьте перфузионный раствор 4% параформальдегида (PFA) в 1x фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS).
    3. Настройте перистальтический насос, позволив 1x PBS пройти через трубку и установите расход на уровне 2 мл/мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что в трубке нет воздушных пузырьков.
  2. Взвесьте мышь, чтобы определить, сколько смеси кетамина и ксилазина нужно вводить.
  3. Введите смесь кетамина и ксилазина внутрибрюшно мыши.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вводите 200 мкл смеси на каждые 20 г массы мыши.
  4. Поместите мышь в контейнер с крышкой и подождите примерно 20 минут, пока она полностью унесется.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Зажмите палец, чтобы проверить отсутствие рефлекса. Убедитесь, что мышь жива, когда начинается перфузия.
  5. Перенесите мышь из стеклянной ёмкости на операционную платформу в положении лежа на спине.
    ВНИМАНИЕ: PFA токсична и летучая; Поэтому проводите процедуру перфузии в химическом капюшоне. Правильно собирать и утилизировать поток PFA в соответствии с институциональными рекомендациями по биобезопасности.
  6. Щипните ладони лапы мыши щипцем, чтобы у мыши не было рефлексов или спазмов.
  7. Проколите иглами 4 ладони, чтобы раздвинуть живот мыши.
  8. Распылите брюшную полость 70% этанолом, чтобы смочить шерсть.
  9. Используйте щипцы, чтобы поднять кожу в середине живота, выровнять с задними лапами и начать разрезать кожу (оба слоя), чтобы открыть живот.
  10. Используйте влажные ватные палочки PBS, чтобы сдвинуть кишечник и другие органы в сторону и поднять левую долю.
  11. Аккуратно разрежьте мембрану, прикреплённую между левой долей и хвостатой долями.
  12. Используйте шов, чтобы завязать верхнюю часть левой доли.
  13. Отрежьте левую долю ниже узла шва и отложите левую долю для сбора и обработки образцов ткани, в зависимости от экспериментальных потребностей (например, прямое замораживание в жидком азоте, вложение в оптическую температуру резки (OCT) или фиксация формалина).
  14. Используйте влажные ватные палочки PBS, чтобы переместить печень и показать портальную вену.
  15. Аккуратно введите иглу катетера в портальную вену примерно на середине длины воротной вены.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы помочь с введением катетера, поднимите тело мыши, подставив щипцы под тело для более ровной поверхности. Аккуратно выровняйте иглу катетера максимально параллельно воротной вене перед введением.
  16. Удалите иглу катетера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что кровоток обратного потока через катетер подтверждает успешное введение.
  17. Запустите перфузионный насос с расходом 2 мл/мин, соедините трубку с катетером и пропустите печень 20 мл 1x PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что катетер полностью заполнен кровью, а трубка полностью заполнена перфузионным буфером, прежде чем подключить их, чтобы в систему не попадали пузырьки воздуха.
  18. Зажмите легочную артерию над печенью гемостатом, чтобы остановить 1x PBS, проходящий через сердце.
  19. Перережьте нижнюю полую вену, чтобы освободить накопленное давление.
  20. Отрегулируйте скорость насоса на 5 мл/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дайте примерно 15 минут на завершение перфузии.
  21. Остановите насос, чтобы заменить резервуар на 4% PFA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что не попадайте в трубку пузырьки воздуха, останавливая насос, когда в резервуаре ещё есть жидкость.
  22. Перфузируйте печень с 25 мл 4% PFA.
  23. После завершения перфузии удалять печень из окружающих органов, разрезав соединяющие ткани.
  24. Поместите печень в коническую трубку объёмом 50 мл, заполненную 25 мл 4% PFA.
  25. Поставьте трубку горизонтально на платформу для качки на 1 час при комнатной температуре при 1,5 об/мин, чтобы обеспечить движение раствора.
  26. Промой печень три раза в 1x PBS на платформе для качки по 30 минут при комнатной температуре при 1,5 об/мин.
  27. Храните печень в 20 мл 1x PBS с 0,02%NaN 3 при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе храните печень в долгосрочной перспективе, как минимум до одного года.

3. Очищение тканей на основе iDISCO+.

ПРИМЕЧАНИЕ: Оригинальное описание протокола iDISCO+ доступно на странице 17

День 1: Образец обезвоживания

  1. Разрежьте образцы печени на кусочки размером примерно 0,5–1см 3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разрежьте разные образцы в разные формы для облегчения обнаружения во время процесса съёмки.
  2. Подготовьте разбавления метанола 20% (объём/объём), 40%, 60% и 80% метанола в воде в отдельных стеклянных бутылках.
  3. Размещайте образцы печени в стеклянные флаконы с крышками с винтовыми крышками (например, 4-7 мл).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите до 6 образцов печени в один стеклянный флакон объёмом 7 мл.
  4. Сушите образец с помощью разбавления метанола в серииH 2O, 20% (об/об), 40%, 60% и 80% в течение 1 часа при комнатной температуре на вращательном колесе при 8 об/мин, без проведения центрифуга.
  5. Промой образец ещё одним 100% метанолом на вращательном колесе при 8 об/мин, при этом центрифугирование не происходит в течение 1 часа при комнатной температуре.
  6. Охлаждайте образец при 4 °C на 30 минут — 1 час.
  7. Приготовьте 66% (объём/объём) разбавления ДКМ в метаноле в стеклянной бутылке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый раз готовьте новые разбавления. Используйте стеклянные цилиндры для приготовления раствора, так как ДКМ способен растворять пластик, например полистирол.
  8. Инкубировать образцы в растворе 66% DCM/метанола за ночь на колесном вращателе при 8 об/мин при комнатной температуре без центрифуга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны с образцами, которые поднимаются наверх после добавления раствора.

День 2: Образец отбеливания

  1. Промыйте образец дважды 100% метанолом на вращательном колесе при 8 об/мин, при этом центрифугирование не происходит по 1 час при комнатной температуре.
  2. Охлаждайте образец при 4 °C на 30 минут — 1 час.
  3. Отбеливайте образец в охлаждённом 5%H 2O2 в метаноле (1 объём 30%H 2O2–5 объёмов метанола) на вращательном колесе при 8 об/мин, без центрифугации, при 4 °C ночью.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый раз готовьте новое решение.

День 3-5: Проницаемость образца

  1. Регидратировать с помощью метанола/Hсерии 2O: 80%, 60%, 40%, 20%, 1x PBS в течение 1 часа при комнатной температуре на вращательном колесе при 8 об/мин, без центрифуга.
  2. Промыть образец дважды в PTx.2 (Таблица 1) по 1 час при комнатной температуре на колеском вращателе при 8 об/мин без центрифуга.
  3. Инкубировать образцы в растворе проницаемости (Таблица 1) при 37 °C в течение 2 дней.

День 5-17: Иммуномаркировка

  1. Заблокировать образцы в блокирующем растворе (Таблица 1) на 2 дня при 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый раз готовьте новый раствор для блокировки из-за нестабильности сыворотки «осли». Храните остатки блокирующего раствора при 4°C до месяца.
  2. Инкубировать образцы в первичных антителах, разбавленных в PTwH (Таблица 1), с 5% DMSO и 3% сывороткой «Осла» при 37 °C на вращательном колесе при 5 об/мин, без центрифугирования в течение 4 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Начните с первичного разбавления антител 1:500.
  3. Промывайте образцы в PTwH 4-5 раз по 1 час при комнатной температуре на колесном вращателе при 8 об/мин, без центрифуга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: По желанию оставьте образцы на стирку на ночь.
  4. Инкубировать образцы в вторичных антителах и йодиде пропидия, разбавленный в PTwH с 3% Donkey Serum при 37 °C на вращательном колесе при 5 об/мин, без центрифугирования в течение 4 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Начните с вторичного разбавления антител 1:500. Используйте разбавление йодида пропидия 1:250 из стандартного раствора йодида пропидия с концентрацией 5 мг/мл.
  5. Промывайте образцы в PTwH 4-5 раз по 1 час при комнатной температуре на колесном вращателе при 8 об/мин, без центрифуга.
  6. Оставьте промывку образца в PTwH на ночь, при комнатной температуре на колесном вращателе при 8 об/мин, без центрифуга.

День 18: Очищение

  1. Сушить образец с помощью разбавления метанола в серииH 2O, 20% (объём/объём), 40%, 60%, 80% в течение 1 часа при комнатной температуре на колесном вращателе при 8 об/мин, без центрифуга.
  2. Промыйте образец дважды с 100% метанолом на вращении в течение 1 часа при комнатной температуре на колесном вращателе при 8 об/мин, без центрифуга.
  3. Инкубировать образец в 66% (объём/объём) разбавлении ДКМ в метаноле в течение 3 часов при комнатной температуре на вращательном колесе при 8 об/мин без центрифуга.
  4. Промыйте образец дважды в 100% DCM в течение 15 минут при комнатной температуре на вращательном колесе при 8 об/мин, без центрифуга.
  5. Инкубировать образец в DBE ночью при комнатной температуре перед визуализацией.
  6. Храните образцы в DBE длительное время до 1 года без влияния на сигнал окрашивания.

4. Конфокальная микроскопия визуализации

  1. Поместите очищенный образец в чашку с стеклянным дном 35 мм и дном #1.5.
  2. Наполните блюдо этил-циннаматом, чтобы полностью погрузить образец.
  3. Поставьте антенну на конфокаль и отрегулируйте фокус, чтобы определить лучшую плоскость, которая даёт самый яркий сигнал.
  4. Получите изображение плитки на самой яркой плоскости, чтобы захватить большую часть образца, используя формат 1024 x 1024 и скорость 600.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте более низкий объектив (10x или 20x) для изображения плитки, чтобы уменьшить время съёмки и размер файла.
  5. На основе изображения плитки выберите интересующие области для сбора z-скана с более высоким разрешением.
  6. Зафиксируйте z-скан через очищенную ткань, охватывая всю глубину ткани с наилучшим разрешением микроскопа, используя формат 1024 x 1024 и скорость 600.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте объектив 40x в масляном погружении для лучшего разрешения для HSC.
  7. Сохраняйте файлы изображений в формате LIF и просматривайте файлы с помощью Fiji или ImarisViewer 11.0.0.

5. Анализ изображений для 3D-реконструкции и количественный анализ отдельных HSC

  1. Конвертируйте файлы изображений в формат IMS с помощью ImarisFileConverter 10.2.0.
  2. Используйте модель Surface на Imaris 10.2.0 для обнаружения объекта на изображениях.
  3. Используйте мастер Create, чтобы провести анализ выбранной 3D-области, затем примените его ко всему изображению.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте это, чтобы ускорить процесс анализа.
  4. Выберите исходный канал, абсолютную интенсивность и снимите кнопку «сгладить», чтобы определить порог интенсивности для всего изображения.
  5. Модифицируйте порог, чтобы захватить все объекты на изображении.
  6. Используйте количество вокселей, чтобы фильтровать объекты-обломки.
  7. Завершите мастера, нажмите кнопку статистики, чтобы получить все статистические измерения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Успешная перфузия и фиксация печени мыши характеризуются однородным бледно-бежево-жёлтым цветом, что отражает эффективное удаление крови и проникновение фиксатива (рисунок 1A,B). Неправильная перфузия приводит к появлению тёмно-красных или коричневых областей тромбов, что снижает оптическую прозрачность и приводит к высокому фоновому сигналу в этих областях образца (рисунок 1C).

Во вр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает воспроизводимый и адаптируемый конвейер подготовки образцов, ведущий к трёхмерной визуализации и количественному анализу морфологии ГСК в целостной ткани печени. Интеграция генетической флуоресцентной маркировки клеток, перфузии печени in situ и модифицированного метода очищения iDISCO+ позволяет визуализировать большие объёмы тканей с одноклеточным разрешением, сохраняя пространственную архитектуру микросреды печени.

Критическ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа поддерживается грантами 1R01 DK136016-01 и 5P30CA196521 (грант центра NCI). Микроскопия и/или анализ изображений проводились в Microscopy and Advanced Bioimaging CoRE при Медицинской школе Icahn в Маунт-Синай. Это исследование было частично поддержано Институтом рака Тиш в Маунт-Синай, P30 CA196521 — грантом поддержки онкологического центра.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Анти-RFP-антитела, кролик, предварительно адсорбированныйРокленд600-401-379
Стеклянная чаша с 4-камерным дном 35 мм с микроколодцем 20 мм, крышкой #1.5CellvisD35C4201.5N
Инъекция AnaSed (инъекция ксилазина)Akorn, Inc.NDC 593990110-2020 мг/мл
Конические центрифугные трубки: 50 мл Falcon352098
Ватные палочкиMedlineMDS202000
Изогнутое замковое замыкание  ГемостатыFisher Scientific16-100-117
Cy3-конъюгированный AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch712-165-153
Нежные рабочие ножницы 4.75" изогнутые/тупыеХирургический инструмент Roboz
728501
Дибензилэфир (DBE), 98%Сигма Олдрич108014
Дихлорметан (DCM),   ≥ 99.8%Сигма Олдрич270997
Диметилсульфоксид (DMSO), ≥ 99.9%Сигма ОлдричD8418
Высоко адсорбированное вторичное антитело против кроликов IgG (H+L), Alexa Fluor 647ThermoFisher ScientificA31573
Ослиная сывороткаEMD МиллипорS30
Этиловый циннамат — 99%Сигма Олдрич112372
Extra Fine Micro Dissecsors Scissors; Лезвие калибра 24 ммFisher ScientificNC9232515
Крыса с моноклональными антителами F4/80ThermoFisher Scientific14-4801-82
ФиджиNIH
ЩипцыFisher ScientificNC9214139
ГлицинБио-Рад1610718
Соль гепарина натрияChem-Impex29984
Гибридизационная печь HybaidTriad ScientificMaxi 14
Перекись водорода, 30 %Сигма Олдрич31642
Программное обеспечение Imaris 10.2.0Oxford Instruments
Программное обеспечение ImarisFileConverter 10.2.0Oxford Instruments
ImarisViewer 11.0.0Oxford Instruments
IV катетерExel International Inc.EXE 26751
Кетамин, инъекция гидрохлоридаДехраB8U4100 мг/мл
Программное обеспечение LAS X 4.4.0.24861Leica
Конфокальный микроскоп Leica Stellaris 8Leica
Метанол, HPLC классаФишерA452-2
Многоцелевой ротаторScientific Industries, Inc.Модель 151
Иглы (27G x 1/2'')BD305109
Параформадгильд, порошок, 95%Сигма Олдрич158127
Перистальтический насосГилсонМодель Minipuls 3
Трубка перистальтического насоса, MasterFlexThermo Scientific96400-163,1 мм диаметр диаметра x 7,6 м L/S Силиконовая трубка с точностью с пероксидом, размер L/S 16, 1/8 дюйма шланг
Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS)ЦитиваSH30256.01Стерильный, pH 7,0 - 7,2, без кальция, магния
Йодид пропидия, ≥ 94,0% (HPLC)Сигма ОлдричP4170
Лезвия бритвыAmerican Line66-0362
Качающаяся платформаVWRМодель 200
Натрий, азид, ≥ 99.5%Сигма ОлдричS2002
ШвыEthiconJ109T
Шприц (1 мл)BD309628
TritonX-100SigmaT9284
Tween-20Thermo ScientificJ20605-AP
Флаконы, крышка с винтом и сплошной крышкой и алюминиевым вкладышом, предварительно собраныСигма Олдрич27470-Uтом 7 мл, ампула янтарного стекла, доз и часы; H 17 мм и раз; 60 мм, резьба на 15-425 мм

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Henderson, N. C., Rieder, F., Wynn, T. A. Fibrosis: from mechanisms to medicines. Nature. 587 (7835), 555-566 (2020).
  2. Wang, S., Friedman, S. L. Found in translation-Fibrosis in metabolic dysfunction-associated steatohepatitis (MASH). Sci Transl Med. 15 (716), eadi0759(2023).
  3. Amini-Salehi, E., et al. Global prevalence of nonalcoholic fatty liver disease: An updated review meta-analysis comprising a population of 78 million from 38 countries. Arch Med Res. 55 (6), 103043(2024).
  4. Ekstedt, M., et al. Fibrosis stage is the strongest predictor for disease-specific mortality in NAFLD after up to 33 years of follow-up. Hepatology. 61 (5), 1547-1554 (2015).
  5. Hagström, H., et al. Fibrosis stage but not NASH predicts mortality and time to development of severe liver disease in biopsy-proven NAFLD. J Hepatol. 67 (6), 1265-1273 (2017).
  6. Geng, Y., Schwabe, R. F. Hepatic stellate cell heterogeneity: Functional aspects and therapeutic implications. Hepatology. , (2025).
  7. Trinh, V. Q. -H., et al. Hepatic stellate cells maintain liver homeostasis through paracrine neurotrophin-3 signaling that induces hepatocyte proliferation. Sci Signal. 16 (787), eadf6696(2023).
  8. Sugimoto, A., et al. Hepatic stellate cells control liver zonation, size and functions via R-spondin 3. Nature. 640 (8059), 752-761 (2025).
  9. Bataller, R., Brenner, D. A. Liver fibrosis. J Clin Invest. 115 (2), 209-218 (2005).
  10. Gäbele, E., Brenner, D. A., Rippe, R. A. Liver fibrosis: Signals leading to the amplification of the fibrogenic hepatic stellate cell. Front Biosci. 8 (4), 69-77 (2003).
  11. Marra, F. Hepatic stellate cells and the regulation of liver inflammation. J Hepatol. 31 (6), 1106-1119 (1999).
  12. Milani, S., et al. Procollagen expression by nonparenchymal rat liver cells in experimental biliary fibrosis. Gastroenterology. 98 (1), 175-184 (1990).
  13. Sato, M., Suzuki, S., Senoo, H. Hepatic stellate cells: Unique characteristics in cell biology and phenotype. Cell Struct Funct. 28 (2), 105-112 (2003).
  14. Du, K., Jun, J. H., Dutta, R. K., Plasticity Diehl, A. M. heterogeneity, and multifunctionality of hepatic stellate cells in liver pathophysiology. Hepatol Commun. 8 (5), e0411(2024).
  15. Trivedi, P., Wang, S., Friedman, S. L. The power of plasticity-Metabolic regulation of hepatic stellate cells. Cell Metab. 33 (2), 242-257 (2021).
  16. Niki, T., et al. Comparison of glial fibrillary acidic protein and desmin staining in normal and CCl4-induced fibrotic rat livers. Hepatology. 23 (6), 1538-1545 (1996).
  17. Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  18. Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T., Ertürk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Mol Syst Biol. 17 (3), e9807(2021).
  19. Scott, G. D., Blum, E. D., Fryer, A. D., Jacoby, D. B. Tissue optical clearing, three-dimensional imaging, and computer morphometry in whole mouse lungs and human airways. Am J Respir Cell Mol Biol. 51 (1), 43-55 (2014).
  20. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).
  21. Mederacke, I., et al. Fate tracing reveals hepatic stellate cells as dominant contributors to liver fibrosis independent of its aetiology. Nat Commun. 4, 2823(2013).
  22. Slater, T. F., Cheeseman, K. H., Ingold, K. U. Carbon tetrachloride toxicity as a model for studying free-radical mediated liver injury. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 311 (1152), 633-645 (1985).
  23. Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. iScience. 24 (4), 102387(2021).
  24. Shrirao, A. B., et al. Autofluorescence of blood and its application in biomedical and clinical research. Biotechnol Bioeng. 118 (12), 4550-4576 (2021).
  25. Croce, A. C., Bottiroli, G. Lipids: Evergreen autofluorescent biomarkers for the liver functional profiling. Eur J Histochem. 61 (2), 2808(2017).
  26. Jafree, D. J., Long, D. A., Scambler, P. J., Moulding, D. Tissue clearing and deep imaging of the kidney using confocal and two-photon microscopy. Methods Mol Biol. , 103-126 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи