Оценка влияния триптолидов на гиппокампальный гефирин, коллибистин и аутофагию в модели мышей Aβ1-42

Краткое содержание

Этот протокол описывает создание агрегированной модели мышей, похожей на болезнь Альцгеймера, индуцированной Aβ1-42, и оценку влияния триптолидов на белки, связанные с синапсами, ингибиторные синапсы гиппокампа, сигнализацию PI3K/Akt/GSK-3β и маркеры, связанные с аутофагией.

Аннотация

Болезнь Альцгеймера связана с дисфункцией синапса, однако стандартизированные процедуры оценки того, как патология, индуцированная Aβ, влияет на ингибиторные синапс-ассоциированные белки, а также сигнализация, связанная с аутофагией, после кандидатного вмешательства остаются ограниченными. Этот протокол описывает рабочий процесс по созданию модели мышей, похожей на болезнь Альцгеймера, индуцированной Aβ1-42, и оценки влияния триптолида на гиппокампальный гефирин, коллибистин, сигнализацию PI3K/Akt/GSK-3β и маркеры, связанные с аутофагией. Взрослые мыши C57BL/6J получают двустороннюю интрацеребровентрикулярную инъекцию Aβ1-42, приготовленную в условиях, вызывающих агрегацию, после чего ежедневно внутрибрюшнически вводят триптолид с или без ингибитора PI3K LY294002. Пространственное обучение и память оцениваются с помощью тестирования водного лабиринта Морриса. Повреждение нейронов гиппокампа и отложение Aβ оцениваются с помощью окрашивания гематоксилина и эозина, а также иммуногистохимии Aβ, а лизаты гиппокампа анализируются с помощью Western blotting для количественной оценки гефирина, фосфорилированного гефирина, коллибистина, сигнальных белков PI3K/Akt/GSK-3β, LC3-II/I и p62. Ключевые процедурные аспекты включают стандартизированную подготовку Aβ1-42, точную стереотаксическую инъекцию, последовательные условия поведенческого тестирования, слепой выбор интересующих областей и стандартизированный анализ изображения и денситометрии. Используя этот рабочий процесс, введение Aβ1-42 вызвало нарушения пространственного обучения и памяти, повреждение нейронов гиппокампа, накопление Aβ, снижение экспрессии гефирина и коллибистина, изменение сигнализации PI3K/Akt/GSK-3β, а также увеличение накопления LC3-II/I и p62. Триптолид частично обратил эти поведенческие, гистологические и молекулярные изменения, тогда как LY294002 ослабил его воздействие. Этот протокол может использоваться для оценки молекулярных изменений гиппокампа, вызванных Aβ, и кандидатских вмешательств, при этом признавая, что эта модель не воспроизводит хроническое многофакторное прогрессирование болезни Альцгеймера у человека.

Введение

Болезнь Альцгеймера (ХА) — это прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, характеризующееся когнитивным снижением, нарушением памяти и поведенческими нарушениями, и является одной из ведущих причин деменции у пожилых людей. Хотя осаждение амилоидного β (Aβ), тау патология, синаптическая дисфункция, нейровоспаление и нарушение гомеостаза белков широко связаны с патогенезом АД, молекулярные механизмы, связывающие токсичность, ассоциированную с Aβ, с ингибиторным нарушением синаптического белка, остаются неполностью^{изучены} 1,2,3,4 . Ингибиторная синаптическая дисфункция может нарушать баланс между возбуждением и торможением в нейронных цепях, что способствует нестабильности сети и когнитивным нарушениям. Однако внутриклеточные сигнальные события, регулирующие ингибиторные синапс-ассоциированные белки-каркасы при патологических состояниях, похожих на AD, вызываемые Aβ, требуют дополнительного^{уточнения 5}.

Гефирин — это основной постсинаптический белок каркасов, который закрепляет и стабилизирует ингибиторные нейромедиаторные рецепторы, включая глициновые рецепторы и рецепторы γ-аминомасляной кислоты типа A, в постсинаптических^{участках 6}. Коллибистин, кодируемый ARHGEF9, — это фактор обмена гуаниновых нуклеотидов, который взаимодействует с гефирином и способствует кластеризации и локализации мембран ингибирующих синаптических^{компонентов 7}. Функциональное взаимодействие между гефирином и коллибистином имеет решающее значение для организации, поддержания и пластичности ингибирующих синапсов. Нарушение этого белкового комплекса может ухудшить ингибиторную нейротрансмиссию и способствовать когнитивным нарушениям. В частности, стабильность гефирина и синаптическое кластерирование регулируются механизмами, зависящими от фосфорилирования. Сообщается, что сигнализация, ассоциированная с Aβ олигомерами, влияет на киназы, такие как гликогенсинтаза-киназа-3β (GSK-3β), что может способствовать фосфорилированию гефирина на серине 270 и, следовательно, влиять на кластеризацию и деградацию гефирина. Эти результаты свидетельствуют о том, что регуляция гефирина, опосредованная киназой, может представлять собой важную молекулярную связь между патологией, ассоциированной с Aβ, и ингибиторной синаптической^{дисфункцией 8,9}.

Путь PI3K/Akt является ключевым внутриклеточным сигнальным путём, участвующим в выживании нейронов, синаптической пластичности, гомеостазе белков и регуляции аутофагии. Активность Akt может подавлять GSK-3β через ингибиторное фосфорилирование, тем самым модулируя нижние субстраты, участвующие в работе нейронов и синаптической стабильности. Дисрегуляция сигнальной передачи PI3K/Akt/GSK-3β связана с нейронным повреждением, связанным с АД, и может способствовать как нарушению синапса, так и аномальному разрушению^{белка 10,11}. Параллельно аутофагия — это важный внутриклеточный путь деградации, который удаляет повреждённые органеллы и неправильно свернутые белки. Аутофагично-лизосомная дисфункция тесно связана с накоплением Aβ, тау патологией и повреждением нейронов в¹² году н.э. Однако одни изменения LC3-II/I не могут отличить усиленное формирование аутофагосом от нарушенной аутофагической деградации; Поэтому для более точной оценки изменений, связанных с аутофагией, требуются дополнительные маркеры, такие как p62. В совокупности эти наблюдения подтверждают необходимость изучения активности PI3K/Akt, GSK-3β-опосредованной регуляции гефирина и маркеров, связанных с аутофагией, в рамках одной экспериментальной системы.

Триптолид, биоактивный триепоксид дитерпена, выделенный из Tripterygium wilfordii, оказывает противовоспалительные, иммуномодуляторные и нейропротекторные^{эффекты 13}. Предыдущие исследования предполагали, что триптолид может улучшать когнитивные функции и сохранять ингибиторные синапс-ассоциированные белки в моделях, подобных АД. Тем не менее, механистическая связь между лечением триптолидами, активацией путей PI3K/Act, фосфорилированием гефирина с помощью GSK-3β, экспрессией коллибистина и изменениями белков, связанных с аутофагией, до сих пор не была полностью определена. Регулирует ли триптолид экспрессию гиппокампального гефирина и коллибистина с помощью механизма, ассоциированного с PI3K/Akt/GSK-3β, в модели мышей, подобной AD, индуцированной Aβ1-42,^{остаётся неясным 14,15}.

По сравнению с хроническими трансгенными моделями АД, такими как мыши APP/PS1 или 5xFAD, а также моделями на основе тауопатии, инъекция агрегированного Aβ1-42 в мозговой бровенулочек обеспечивает относительно быстрый и технически доступный подход к индуцированию травмы гиппокампа, ассоциированного с Aβ, и когнитивных нарушений. Этот протокол уместен, когда цель эксперимента — оценить кратковременную нейротоксичность, вызванную Aβ, молекулярные изменения гиппокампа и связанные с вмешательством влияние на очерченные сигнальные пути. Однако эта модель не воспроизводит хроническую выработку амилоида, патологию тау, сосудистые изменения, нейроиммунную сложность или возрастно-зависимое прогрессирование при АД у человека. Поэтому результаты, полученные с использованием этого протокола, следует интерпретировать как патологию, вызванную Aβ, подобную АД, и, в идеале, валидироваться в хронических трансгенных моделях, моделях, связанных с тау, или нейронных системах, полученных от человека. Несмотря на предыдущие данные, связывающие патологию Aβ, сигнализацию PI3K/Akt/GSK-3β, ингибиторные синапс-ассоциированные белки и аномалии, связанные с аутофагией, с патологией, похожей на AD, немногие протоколы интегрируют поведенческое тестирование, гистологическую оценку гиппокампа, иммуногистохимию Aβ, анализ ингибиторных синапс-ассоциированных белков, оценку сигнализации киназой и выявление маркеров, связанных с аутофагией в рамках одной модели вмешательства, индуцированной Aβ1-42. Этот методологический разрыв ограничивает воспроизводимую оценку того, модулируют ли кандидатные соединения изменения в белках, связанных с ингибиторными синапсами, через определённые внутриклеточные сигнальные пути.

Цель этого протокола — предоставить воспроизводимый рабочий процесс для оценки экспрессии гиппокампа гефирина и коллибистина и связанных с ними регуляторных механизмов в модели мышей, подобной AD, индуцированной Aβ1-42, обработанной триптолидом, с или без ингибитора PI3K LY294002. Первоначальный вклад этой работы — интеграция стереотаксичного введения Aβ1-42, фармакологической модуляции сигнальных путей, тестирования водного лабиринта Морриса, гистологической и иммуногистохимической оценки, а также анализа Western blot ингибиторных синапсов-ассоциированных белков, сигнализации PI3K/Akt/GSK-3β и маркеров, связанных с аутофагией. Рабочая гипотеза заключалась в том, что патология, похожая на AD, индуцированная Aβ1-42, будет связана с нарушением сигнализации PI3K/Act, изменением фосфорилирования гефирина, ассоциированной с GSK-3β, снижением экспрессии гиппокампа гефирина и коллибистина, а также аномальным накоплением белков, связанных с аутофагией, тогда как лечение триптолидом частично обратит эти поведенческие и молекулярные аномалии.

Протокол

Все процедуры на животных были одобрены Комитетом по медицинской этике Медицинского университета Хубэй и проводились в соответствии с институциональными рекомендациями по уходу и использованию животных (No SYXK2019-0031.). Все процедуры с участием животных, Aβ1-42, триптолид, LY294002, параформальдегид, ксилол, этанол и хемилюминесцентные реагенты должны выполняться с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты, включая лабораторный халат, перчатки и защитные очки. Туши животных, ткани мозга, расходники, загрязнённые Aβ, параформальдегидные отходы, ксилоловые отходы и материалы, загрязнённые ECL, должны собираться отдельно и утилизироваться в соответствии с институциональными нормами по биобезопасности и химическим утилизации. Анализ изображений проводился с помощью ImageJ. Для иммуногистохимического анализа изображения преобразовывались в 8-битные оттенки серого или подвергались цветовой деконволюции для выделения DAB-положительного окрашивания. Одинаковый порог применялся ко всем изображениям в одном эксперименте. Измерялись площадь положительного окрашивания, общая область интереса и интегрированная плотность. При западном блотинге интенсивность полос измерялась с помощью инструмента гелевого анализа после фонового вычитания. Уровни целевых белков нормализовались до β-актина, тогда как фосфорилированные белки — до соответствующих их общих уровней.

Реагенты и оборудование, использованные в этом исследовании, перечислены в Таблице материалов, включая названия товаров, производителей, номера каталога или моделей, а также общие описания.

Животные и экспериментальная группировка
Сорок восемь взрослых мышей C57BL/6J, включая 24 самцов и 24 самок, возрастом 10-12 недель и весом 22-28 г, были приобретены в Центре экспериментальных животных Медицинского университета Хубэй. Мыши содержались в определённых условиях, свободных от патогенов, при температуре 22 ± 2 °C, с свободным доступом к автоклавной воде и стандартному корму грызунов. После 1 недели акклиматизации мыши были случайным образом распределены на четыре группы: контрольную группу, модельную группу, индуцированную Aβ1-42, группу, обработанную триптолидами, и группу совместного лечения LY294002 плюс триптолид, по 12 мышей в группу. Самцы и самки мышей были распределены по группам максимально равномерно.

Пептид Aβ1-42 растворялся в стерильном нормальном физиологическом растворе до конечной концентрации 10 мкг/мкл. Для приготовления Aβ1-42 в условиях, вызывающих агрегацию, раствор инкубировали при 37 °C в течение 7 дней в циркулирующей водяной бане, аккуратно перемешивали перед употреблением и хранили на льду во время инъекции. Это условие подготовки было адаптировано из ранее опубликованных процедур агрегирования Aβ42. В настоящем исследовании состояние агрегации точной инъекционной партии Aβ1-42 не было независимо охарактеризовано тиофлавиновой T-флуоресценцией, SDS-PAGE/вестерн-блоттингом или трансмиссионной электронной микроскопией. Таким образом, термин «агрегированный Aβ1-42» в данном протоколе относится к Aβ1-42, приготовленным в условиях агрегации, индуцирующих агрегацию.

Для создания моделей мышей анестезиировали путём внутрибрюшной инъекции 10% пентобарбитала натрия при дозе 0,04 мл/10 г массы тела. Адекватная анестезия подтверждалась отсутствием отмены педалей и роговицовых рефлексов. Каждую мышь затем фиксировали на стереотаксическом аппарате, а кожу головы брили и дезинфицировали йодофором или 75% этанолом. Был сделан средний разрез для обнажения черепа, а брегма была идентифицирована под стереомикроскопом. Череп был настроен так, чтобы брегма и лямбда располагались на одной горизонтальной плоскости.

Двусторонние инъекции в латеральный желудочек проводились с использованием следующих координат относительно брегмы: переднезадний — −0,50 мм; среднелатеральный — ±1,00 мм; и дорсовентральной, на расстоянии −3,00 мм от поверхности черепа. Общий объем 2 мкл агрегированного раствора Aβ1-42 медленно (2 мкл/мин) вводился в каждый латеральный желудочек с помощью микрошприца. Инъекция проводилась на постоянной низкой скорости для снижения повреждения тканей и рефлюкса. После инъекции иглу оставляли на месте примерно 5 минут, затем медленно выводили. Контрольные мыши получали равный объём стерильного нормального физиологического раствора на тех же координатах и с использованием той же хирургической процедуры. После инъекции разрез на коже головы закрывался швами или зажимами для ран, а мышей помещали в тёплую клетку для восстановления, пока они не пришли в сознание. Ежедневно отслеживались послеоперационное восстановление, вес тела, заживление ран, поведение при груминге, двигательная активность, а также признаки боли или страдания.

Медикаментозное вмешательство было начато через 2 недели после стереотаксичной инъекции, после того как модель призналась стабильной. Триптолид растворялся в нормальном физиологическом растворе с 4% пропиленгликолем и вводился внутрибрюшно один раз в день в течение 30 дней подряд. Группа, получавшая триптолид, получала триптолид в дозе 0,2 мг/кг в день, тогда как группа с LY294002 плюс триптолид — вместе с ингибитором PI3K LY294002 в 0,3 мг/кг один раз в день в течение 30 дней подряд. Контрольная группа и модельная группа, индуцированная Aβ1-42, похожая на AD, получали равные объёмы раствора с использованием одного и того же графика впрыска¹⁶.

Тест водного лабиринта Морриса
Пространственное обучение и память оценивались с помощью водного лабиринта Морриса через 24 часа после окончательного введения препарата. Водный лабиринт представлял собой круглый бассейн, наполненный водой, поддерживавшейся при температуре 22 °C ± 1 °C. Визуальные подсказки были размещены по всему бассейну и оставались неизменными на протяжении всего эксперимента. Во время этапа навигации по месту скрытая платформа фиксировалась в целевом квадранте. Перед каждым днём тестирования мышам позволяли привыкнуть к тестовой комнате примерно на 30 минут.

Навигационный тест проводился в течение шести дней подряд. В каждом испытании мышь аккуратно помещали в воду, лицом к стене бассейна из одного из стартовых квадрантов, и позволяли искать скрытую платформу до 60 секунд. Если мышь находила платформу в пределах 60 секунд, ей разрешалось оставаться на платформе 15 секунд. Если мышь не могла найти платформу в пределах 60 секунд, её направляли на платформу и позволяли оставаться там 20 секунд для облегчения консолидации пространственной памяти. Каждая мышь проходила 4 испытания в день, а задержка побега, дистанция плавания и скорость плавания фиксировались с помощью автоматизированной системы видеоотслеживания.

На седьмой день платформа была снята для пробного испытания. Мышь была погружена в воду из квадранта напротив первоначальной платформы и свободно плавала в течение 60 секунд. Количество пересечений платформ и процент времени, проведённого в целевом квадранте, фиксировался. После каждого испытания мышь сушили и возвращали в нагретую клетку, чтобы предотвратить^{гипотермию 17,18}.

Сбор тканей
После поведенческого тестирования мыши подвергались глубокому обезболиванию путём внутрибрюшнической инъекции 10% пентобарбитала натрия при дозе 0,04 мл/10 г массы тела. Восемь мышей из каждой группы были случайным образом отобраны для извлечения белка из гиппокампа. Их мозг быстро удалялся на льду, а двусторонние ткани гиппокампа были вскрыты на ледяной поверхности. Образцы гиппокампа помещались в заранее маркированные криовиалы, быстро замораживались в жидком азоте и хранили при −80 °C до извлечения белка.

Оставшиеся четыре мыши из каждой группы использовались для гистологического и иммуногистохимического анализа. Под глубоким наркозом мыши транссердечно перфузировались фосфатно-буферным физиологическим раствором, пока печень не побледнела, а затем 4% параформальдегида. Мозг был аккуратно удален и потом фиксирован в 4% параформальдегиде при 4 °C в течение 24 часов. После фиксации ткани мозга отправлялись на экспериментальную платформу патологии, где проводилось вложение парафина и последующее сечение. Параформальдегид обработался в химическом выхлопчике, а отходы, содержащие параформальдегид, собирались отдельно в соответствии с институциональными требованиями по утилизации химических отходов.

Окрашивание гематоксилином и эозином
Мозговые ткани, вложенные в парафин, были разрезаны на корональные срезы диаметром 4 мкм, содержащие гиппокамп. Секции запекали при 60 °C в течение 1 часа, дважды депарафинизировали в ксилоле по 10 минут каждая, а затем регидратировали с помощью сортированных этаноловых растворов (100%, 95%, 85% и 75%), а затем дистиллированной водой (по 5 минут на каждый этап). После регидратации участки окрашивались гематоксилином в течение 10 минут, промывались в проточной воде из-под крана, при необходимости кратковременно дифференцировали кислотным спиртом (2 с) и посиняли в проточной воде из-под крана. Затем участки окрашивались эозином в течение 5 минут, дегидрированы с помощью сортированного этанола, дважды очищали в ксилоле по 5 минут каждый и монтировали нейтральной смолой.

Морфология гиппокампа наблюдалась под световым микроскопом. Изображения были получены из одного и того же подрегиона гиппокампа во всех группах с использованием параметров увеличения и визуализации 20×. Повреждение нейронов оценивалось на основе плотности нейронов, ядерного пикноза и неупорядоченной организации с помощью программного обеспечения для анализа изображений исследователем, ослеплённым к^{групповому распределению 19}.

Aβ иммуногистохимия
Для иммуногистохимии Aβ парафиновые срезы депарафинизировались и регидратирались, как описано, для окрашивания гематоксилином и эозином. Извлечение антигена проводилось в буфере для получения антигена ЭДТА при pH 8,0 путём нагрева секций в микроволновой печи на высокой мощности в течение 3 минут дважды. Секции остывали до комнатной температуры, а затем три раза мыли с помощью PBS по 5 минут каждая. Эндогенная пероксидазная активность блокировалась 3% перекиси водорода на 15 минут при комнатной температуре, после чего промывалась PBS три раза по 5 минут каждая. Неспецифическое связывание было заблокировано 5% нормальной козьей сывороткой на 30 минут при комнатной температуре. Срезы инкубировали ночью при 4 °C с первичным антителом против Aβ, разбавлённым 1:200 в PBS. После инкубации секции промывались три раза с помощью PBS по 5 минут каждая, затем инкубировали с вторичным антителом, конъюгированным с HRP, в течение 60 минут при комнатной температуре. После промывания PBS наносили DAB-субстрат, а проявление цвета контролировалось под микроскопом. Реакцию прекратили дистиллированной водой, когда стало видно коричнево-положительное пятно. Срезы были окрашены гематоксилином, обезвожены с помощью градированного этанола, очищены ксилолом и закреплены нейтральной смолой. Изображения были сделаны из одного и того же подрегиона гиппокампа во всех группах с использованием одинаковых микроскопических установок при увеличении 20×. Aβ иммунокрашивание количественно оценивалось с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Положительный порог окрашивания сохранялся постоянным на всех изображениях, а осаждение Aβ рассчитывалось как положительная область окрашивания, делённая на общее количество клеток в каждом микроскопическом поле.

Экстракция белка гиппокампа и вестерн-блот анализ
Замороженные ткани гиппокампа хранились на льду и гомогенизировались в ледяном буфере лизиса RIPA, содержащем ингибиторы протеазы и фосфатазы. Гомогенаты инкубировали на льду в течение 30 минут и периодически вихрили для обеспечения достаточного лизиса. Лизаты затем центрифугировали при 12 000 × г в течение 15 минут при 4 °C, а супернатанты собирали для анализа белков. Концентрации белка определялись с помощью белкового теста BCA согласно инструкциям производителя. Кратко: стандарты BSA и образцы белка были подготовлены в дубликате, смешивались с рабочим реагентом BCA, инкубировали при 37 °C в течение 30 минут и измерялись на 562 нм с помощью считывателя микропластин. Концентрации белков рассчитывались по стандартной кривой, и все образцы были скорректированы до той же конечной концентрации до^{электрофореза 20}.

20 мкг общего белка из каждого образца гиппокампа отделялось на 12% SDS-PAGE и переносилось на мембраны PVDF. Электрофорез проводился при 80 В для укладки и 120 В для разделения. Белки переносились на мембраны PVDF, активируемые метанолом, с помощью влажного переноса при 100 В в течение 90 минут при 4 °C. После переноса мембраны блокировались 5% BSA в течение 1 часа при комнатной температуре. Мембраны инкубировали ночью при 4 °C с первичными антителами против гефирина (разбавление 1:1000), фосфорилированного гефирина (разбавление 1:500), коллибистина (разбавление 1:1000), PI3K (разбавление 1:1000), Akt (разбавление 1:1000), фосфорилированного Akt (разбавление 1:1000), GSK-3β (разбавление 1:1000), фосфорилированного GSK-3β (разбавление 1:1000), LC3 (разбавление 1:1000), p62 (разбавление 1:1000) и β-актина (разбавление 1:5000). После промывания с помощью TBST мембраны инкубировали вторичными антителами, конъюгированными с HRP, в течение 1 часа при комнатной температуре (разбавление 1:5000). Белковые полосы визуализировались с помощью хемилюминесцентного субстрата ECL и зафиксированы с помощью системы хемилюминесцентной визуализации. Интенсивность полос была количественно измерена с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Общий уровень экспрессии белка был нормализован до β-актина. В дополнительные материалы были включены высококачественные необрезанные западные блот-изображения.

Статистические данные
Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения для генерации графиков. Данные были выражаны в среднем ± SD, как указано на рисунках. Тестирование поведения и количественная оценка изображений проводились исследователями, не обращая внимания на распределение групп. Задержка побега во время фазы тренировки в водном лабиринте Моррис была проанализирована с помощью двусторонних повторяющихся мер ANOVA, с учетом групповой и тренировочной системы в качестве факторов. Данные пробных испытаний, гистологическая количественная оценка, иммуногистохимическая квантификация и денситометрия западного блота анализировались с помощью одностороннего теста ANOVA. Статистическая значимость была определена как p < 0,05. Стандартная нотация значимости использовалась следующим образом: *p < 0,05, **p < 0,01 и ***p < 0,001. Точные размеры выборки были указаны в соответствующих легендах на рисунках. Самцы и самки мышей были равномерно распределены по экспериментальным группам. Однако статистический анализ по полу не проводился, поскольку исследование не было разработано и не было оснащено для выявления эффектов, специфичных для пола. Это ограничение признано в разделе «Обсуждение».

Результаты

Нарушение обучения и памяти у мышей, подобных АД, индуцированным Aβ1-42, и частичное улучшение после лечения триптолидом

Для создания модели мышей, индуцируемой Aβ1-42, агрегированный Aβ1-42 стереотаксически вводили в двусторонние латеральные желудочки мышей C57BL/6J. После установления модели мышей обрабатывали транспортными средствами, триптолидом или триптолидом в сочетании с ингибитором PI3K LY294002. Пространственное обучение и память затем оценивались с помощью водного лабиринта Морриса.

Во время шестидневной фазы навигации по местам задержка побега постепенно снижалась во всех группах, что указывает на то, что мыши получили задачу пространственного обучения с помощью повторяющихся тренировок (рисунок 1A). Однако мыши, похожие на AD, индуцированные Aβ1-42, демонстрировали стабильно более длительную задержку побега, особенно в более поздние дни обучения, что указывает на нарушение пространственного обучения. Лечение триптолидами сократило латентность выхода по сравнению с модельной группой, индуцированной Aβ1-42, похожими на AD, тогда как совместное лечение с LY294002 ослабляло это улучшение. Эти результаты показывают, что триптолид частично улучшал пространственное обучение, вызванное Aβ1-42, и этот эффект был ослаблен ингибированием PI3K.

Репрезентативные плавательные дорожки дополнительно подтверждали эти поведенческие изменения (рисунок 1B). Контрольные мыши показали более прямой, целенаправленный поиск вокруг расположения платформы, тогда как мыши, индуцированные Aβ1-42, похожими на AD, демонстрировали рассеянную, неэффективную траекторию плавания. Мыши, обработанные триптолидами, показали улучшенное поведение поиска, при этом траектории были более сосредоточены вокруг целевого района. В отличие от этого, мыши, обработанные LY294002 и триптолидом, показали менее эффективный поиск, чем те, что получали только триптолид. В пробном испытании, проведённом после удаления платформы, мыши, вызванные Aβ1-42, похожими на AD, пересекали исходное место платформы реже, чем контрольные, что свидетельствует о нарушении пространственной памяти (рисунок 1C). Лечение триптолидом увеличило количество пересечений платформ, тогда как LY294002 совместное лечение уменьшило этот эффект. Аналогично, процент времени, проведённого в целевом квадранте, был снижен у мышей, похожих на AD, индуцированных Aβ1-42, по сравнению с контрольными мышами, увеличился после обработки триптолидом и снова уменьшился после LY294002 совместного лечения (рисунок 1D).

В совокупности эти поведенческие результаты показывают, что двусторонняя инъекция агрегированного Aβ1-42 индуцированного пространственного обучения и нарушения памяти у мышей. Триптолид частично обратил эти поведенческие нарушения, тогда как LY294002 ослабил защитный эффект триптолида, что позволяет предположить, что сигнализация PI3K/Akt может способствовать поведенческим эффектам, наблюдаемым в этой модели.

Инъекция Aβ1-42 вызывала повреждение нейронов гиппокампа и отложение Aβ, которые были ослаблены триптолидом

Для дальнейшей проверки установления патологических изменений, вызванных Aβ1-42, похожих на AD, и оценки влияния триптолида на повреждение гиппокампа были проведены окрашивание гематоксилина и эозина, а также иммуногистохимия Aβ на срезах мозга каждой группы.

Окрашивание HE показало, что нейроны в контрольной группе расположены плотно и равномерно, с относительно чёткой морфологией клеток и структурой ядра (рисунок 2A). В отличие от этого, мыши, похожие на AD, индуцированные Aβ1-42, демонстрировали явное повреждение нейронов гиппокампа, характеризующееся беспорядком клеточного расположения, снижением плотности нейронов и усиленной конденсацией ядер. Лечение триптолидами частично улучшило морфологию нейронов гиппокампа, с более сохранившейся клеточной структурой и менее заметным ядерным пикнозом по сравнению с модельной группой, индуцированной Aβ1-42. Однако совместное лечение с LY294002 ослабляло защитное действие триптолида, что отражено в более выраженной дезорганизации и повреждении нейронов по сравнению с группой, получающей триптолид.

Затем была проведена иммуногистохимия Aβ для оценки отложения Aβ в гиппокампе (рисунок 2B). В контрольной группе наблюдалось минимальное окрашивание Aβ-положительным, тогда как модельная группа, индуцированная Aβ1-42, показала заметное увеличение коричневых сигналов Aβ-положительных. Обработка триптолидами снизила Aβ-положительное окрашивание по сравнению с модельной группой, что указывает на то, что триптолид ослаблял отложение Aβ в этой модели. В отличие от этого, мыши, обработанные LY294002 плюс триптолид, показали повышенное Aβ-положительное окрашивание по сравнению с мышами, обработанными только триптолидом. Количественный анализ дополнительно подтвердил эти гистологические наблюдения. Площадь Aβ-положительного сигнала, нормализованная к общему количеству клеток в каждом микроскопическом поле, была увеличена в группе, индуцированной AD-подобной группой, по сравнению с контрольной группой, уменьшилась после обработки триптолидом и частично увеличилась после LY294002 совместного лечения (рисунок 2B).

Эти результаты показывают, что инъекция Aβ1-42 вызывала повреждение нейронов гиппокампа и накопление Aβ, в то время как триптолид частично смягчал эти патологические изменения. Обратная реакция, наблюдаемая после LY294002 совместного лечения, указывает на то, что сигнализация PI3K/Akt может способствовать защитному эффекту триптолида.

Триптолид восстановил экспрессию гефирина и коллибистина у гиппокампа и модулировал сигнализацию PI3K/Akt/GSK-3β

Чтобы определить, сопровождались ли поведенческие и гистологические изменения изменениями в ингибиторных синапс-ассоциированных белках и их верхних регуляторных сигналах, гиппокампальные лизаты из каждой группы были проанализированы методом вестерн-блоттинга. По сравнению с контрольной группой, у мышей, подобных на АД, индуцированных Aβ1-42, наблюдалось заметное снижение экспрессии гефирина в гиппокампе, тогда как уровень фосфорилированного гефирина был повышен (рисунок 3A). Лечение триптолидом частично восстановило полную экспрессию гефирина и снизило уровень фосфорилированного гефирина. В отличие от этого, LY294002 совместное лечение ослабляло эффект триптолида, что подтверждается снижением экспрессии гефирина и увеличением фосфорилированного гефирина по сравнению с группой, обработанной триптолидами. Эти результаты свидетельствуют о том, что патология, вызванная Aβ1-42, была связана не только с уменьшением содержания гефирина в гиппокампе, но и с усиленной фосфорилированием гефирина, в то время как триптолид частично обратил эти изменения.

Коллибистин показал схожий паттерн экспрессии с полным гефирином. Мыши, индуцированные Aβ1-42, похожи на AD, демонстрировали снижение экспрессии коллибистина в гиппокампе по сравнению с контрольными мышами, тогда как лечение триптолидом восстанавливало экспрессию коллибистина. LY294002 совместное лечение частично обратило этот эффект назад (рисунок 3B). Эти результаты свидетельствуют о том, что триптолид сохранял экспрессию ингибиторных синапс-ассоциированных белков-каркасов в гиппокампе, и этот эффект был ослаблен ингибированием PI3K. Затем был исследован сигнальный путь PI3K/Akt/GSK-3β для дальнейшего прояснения молекулярных изменений, лежащих в основе фосфорилирования гефирина. В группе, индуцированной Aβ1-42, подобной AD, экспрессия PI3K и соотношение p-Akt/Akt были снижены по сравнению с контрольной группой, что указывает на снижение сигнальной активности PI3K/Akt (рисунок 3B). Соотношение p-GSK-3β/GSK-3β также было уменьшено в группе моделей. Поскольку фосфорилирование GSK-3β в ингибиторном участке отражает подавление активности GSK-3β, это снижение свидетельствует о относительно повышенной активности GSK-3β в индуцированном Aβ1-42 гиппокампом, подобном AD. Лечение триптолидами увеличило экспрессию PI3K, восстановило соотношение p-Akt/Akt и повысило соотношение p-GSK-3β/GSK-3β. Эти эффекты были ослаблены LY294002 совместным лечением.

В совокупности эти результаты свидетельствуют о том, что патология, похожая на AD, индуцированная Aβ1-42, была связана со снижением экспрессии гефирина и коллибистина в гиппокампе, увеличением фосфорилирования гефирина и нарушением тормозного фосфорилирования GSK-3β, опосредованной PI3K/Akt. Триптолид частично обратил эти молекулярные изменения, тогда как LY294002 ослабил действие триптолида, что подтверждает участие сигнализации PI3K/Akt/GSK-3β в регуляции гиппокампального гефирина и коллибистина в этой модели.

Триптолид ослаблял белковые аномалии, связанные с аутофагией, в гиппокампе мышей, похожих на AD, индуцированных Aβ1-42

Чтобы определить, связаны ли патология, похожая на АД, и лечение триптолидами, вызванные Aβ1-42, с изменениями белков, связанных с аутофагией, экспрессия LC3 и p62 в лизатах гиппокампа была исследована методом вестерн-блоттинга. По сравнению с контрольной группой, мыши, индуцированные Aβ1-42, похожими на AD, показали повышенное соотношение LC3-II/I, что указывает на увеличение накопления LC3-II, связанного с аутофагосомами. Параллельно экспрессия p62 также была повышена в модельной группе, что указывает на накопление субстратов, связанных с аутофагией, в гиппокампе. Лечение триптолидами снизило как соотношение LC3-II/I, так и экспрессию p62 по сравнению с модельной группой, индуцированной Aβ1-42, подобной AD. Эти результаты показывают, что триптолид ослаблял аномальное накопление белков, связанных с аутофагией, вызванное Aβ1-42. В отличие от этого, LY294002 совместное лечение повысило соотношение LC3-II/I и экспрессию p62 по сравнению с одним лечением триптолидами, что свидетельствует о том, что ингибирование PI3K ослабляет влияние триптолида на изменения белка, связанные с аутофагией (см. рисунок 4).

В целом, контрольная группа предоставила исходный поведенческий, гистологический и молекулярный профиль, тогда как модельная группа, индуцированная Aβ1-42, подобная AD, подтвердила, что введение в мозговой вентрикулярный Aβ1-42 вызывает когнитивные нарушения, повреждение нейронов гиппокампа, отложение Aβ, снижение ингибирующего синапс-ассоциированного белка, изменения в сигнализации PI3K/Akt/GSK-3β и накопление белков, связанных с аутофагией. Сравнение модельной группы, индуцированной Aβ1-42, и группы, обработанной триптолидами, показало, что триптолид частично обратил эти аномалии. Сравнение группы, обработанной триптолидами, и группы совместного лечения LY294002 плюс триптолид, дополнительно показало, что ингибирование PI3K ослабляет эффекты триптолида. Эти результаты подтверждают рабочую гипотезу о том, что триптолид модулирует изменения в гиппокампе гефирине, коллибистине и белках, связанных с аутофагией, в модели, подобной AD, индуцированной Aβ1-42, с помощью механизма, ассоциированного с PI3K/Akt/GSK-3β.

ДОСТУПНОСТЬ ДАННЫХ:

Все исходные данные, необходимые для воспроизведения результатов этого исследования, предоставлены в виде Дополнительного файла 1 и Дополнительного файла 2. Сюда входят оригинальные изображения вестерн блот и геля, необрезанные данные блотов, необработанные числовые значения, используемые для статистического анализа, и сгенерированные графики. (Дополнительный файл 1 и дополнительный файл 2) Эти файлы предоставляют исходные данные, подтверждающие количественные результаты, представленные на рисунках 1–4.

Рисунок 1: Триптолид частично улучшил пространственное обучение и дефициты памяти у мышей, вызванных Aβ1-42, похожими на AD. (A) Задержка побега во время 6-дневной фазы навигации по местам в водном лабиринте Морриса. (B) Репрезентативные траектории плавания во время пробного испытания. (C) Количество пересечений над первоначальным расположением платформы после снятия платформы. (D) Процент времени, проведённого в целевом квадранте во время испытаний зонда. Данные представлены в виде среднего ± SD. Задержка побега анализировалась с помощью двухнаправленных повторяющихся измерений ANOVA, а данные пробных испытаний — с помощью одностороннего теста ANOVA. Ctr, контрольная группа; AD, индуцированная Aβ1-42-индуцированная модельная группа, похожая на AD; ТП, группа, обработанная триптолидами; LY, LY294002 и группа совместного лечения триптолида. n = 6 на группу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Триптолид ослабил повреждение нейронов гиппокампа и отложение Aβ у мышей, подобных AD, индуцированным Aβ1-42. (A) Репрезентативные изображения гематоксилина и эозина для срезов гиппокампа из каждой группы. Шкала = 50 мкм. (B) Репрезентативные изображения иммуногистохимического окрашивания Aβ и количественный анализ Aβ-положительного отложения в гиппокампе. Шкала = 50 мкм. Данные представлены в виде среднего ± SD. Статистический анализ проводился с помощью одностороннего теста ANOVA. Ctr, контрольная группа; AD, индуцированная Aβ1-42-индуцированная модельная группа, похожая на AD; ТП, группа, обработанная триптолидами; LY, LY294002 и группа совместного лечения триптолида. n = 3 на группу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Триптолид восстановил экспрессию гиппокампа гефирина и коллибистина и модулировал сигнализацию, ассоциированную с PI3K/Akt/GSK-3β, у мышей, индуцированных Aβ1-42, подобных AD .(A) Репрезентативные изображения западных блот и количественный анализ общей экспрессии гефирина и фосфорилированного гефирина в лизатах гиппокампа каждой группы. (B) Репрезентативные изображения западного блота и количественный анализ коллибистина, PI3K, Akt, фосфорилированного Akt, GSK-3β и фосфорилированного GSK-3β в лизатах гиппокампа. Коллибистин и PI3K были нормализованы до β-актина. Фосфорилированный Akt и фосфорилированный GSK-3β были количественно определены как соотношения p-Akt/Akt и p-GSK-3β/GSK-3β соответственно. Данные представлены в виде среднего ± SD. Статистический анализ проводился с помощью одностороннего теста ANOVA. Ctr, контрольная группа; AD, индуцированная Aβ1-42-индуцированная модельная группа, похожая на AD; ТП, группа, обработанная триптолидами; LY, LY294002 и группа совместного лечения триптолида. n = 3 на группу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Триптолид ослабил белковые аномалии, связанные с аутофагией, в гиппокампе мышей, индуцированных Aβ1-42, подобных AD .Репрезентативные изображения западных блот и количественный анализ экспрессии LC3-I/II и p62 в лизатах гиппокампа из каждой группы. Соотношение LC3-II/I рассчитывалось делением интенсивности зоны LC3-II на интенсивность LC3-I, а экспрессия p62 нормализовывалась до β-актина. Данные представлены в виде среднего ± SD. Статистический анализ проводился с помощью одностороннего теста ANOVA. Ctr, контрольная группа; AD, индуцированная Aβ1-42-индуцированная модельная группа, похожая на AD; ТП, группа, обработанная триптолидами; LY, LY294002 и группа совместного лечения триптолида. n = 3 на группу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Дополнительный файл 1: Необрезанные изображения западных блотов . Указываются полосы, используемые для количественной оценки, а маркеры молекулярной массы — там, где это возможно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 2: Исходные числовые значения, используемые для статистического анализа в этой статье. Этот файл содержит исходные численные наборы данных, используемые для генерации количественных графиков на рисунках 1–4, включая поведенческие измерения водного лабиринта Морриса, количественную оценку иммуногистохимии Aβ и значения плотности западного блота. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Центральное механистическое предположение данного исследования состоит в том, что патология, индуцированная Aβ1-42, подавляет сигнализацию PI3K/Act, снижает ингибиторную фосфорилирование GSK-3β, способствует фосфорилированию гефирина, снижает экспрессию гефирина и коллибистина в гиппокампе, а также способствует накоплению белков, связанных с аутофагией, тогда как триптолид частично противодействует этим изменениям через путь, ассоциированный с PI3K/Akt/GSK-3β. Это исследование показывает, что патология, похожая на AD, индуцированная Aβ1-42, сопровождается нарушением пространственного обучения и памяти, повреждением нейронов гиппокампа, увеличением отложения Aβ, снижением экспрессии гефирина и коллибистина, усилением фосфорилирования гефирина, изменением сигнализации PI3K/Akt/GSK-3β и накоплением белков, связанных с аутофагией. Триптолид частично обратил эти поведенческие, гистологические и молекулярные аномалии, тогда как LY294002 ослабил его воздействие. Эти результаты подтверждают модель, в которой триптолид защищает белки, связанные с ингибиторами гиппокампа, по крайней мере частично, через PI3K/Akt/GSK-3β-опосредованную регуляцию фосфорилирования гефирина и изменений белков, связанных с аутофагией. Следует отметить, что модель инъекции Aβ1-42 в мозговой бровенулочек в первую очередь отражает нейротоксичность, вызванную Aβ, и патологию, похожую на AD, а не полную хроническую многофакторную прогрессию человеческой^{AD 21} AD.

Гефирин и коллибистин являются центральными компонентами ингибиторной синаптической организации. Гефирин закрепляет ингибиторные нейромедиаторные рецепторы в постсинаптических участках, а коллибистин способствует кластеризации и локализации мембран. Снижение экспрессии этих белков, таким образом, может нарушать тормозную синаптическую стабильность и способствовать нарушению функции гиппокампальной^{сети 8}. В этом исследовании Aβ1-42 снизил экспрессию гефирина и коллибистина в гиппокампе, в то время как триптолид восстановил оба белка. Увеличение количества фосфорилированного гефирина даёт правдоподобный механизм потери гефирина, поскольку фосфорилирование в Ser270 связано с распространением гефирина, снижением кластеризации и дестабилизацией белка. Параллельное снижение экспрессии PI3K, фосфорилирование Akt и ингибиторное фосфорилирование GSK-3β свидетельствуют о том, что Aβ1-42 ослабляет сигнализацию PI3K/Akt и может увеличивать активность GSK-3β, что соответствует усиленному фосфорилированию гефирина. Напротив, триптолид восстанавливал фосфорилирование Akt, усилил ингибирующую фосфорилирование GSK-3β и снизил фосфорилирование гефирина, тогда как LY294002 ослабил эти эффекты. Эти результаты показывают, что триптолид может сохранять экспрессию гефирина и коллибистина через регуляцию фосфорилирования гефирина, ассоциированную с PI3K/Akt/GSK-3β. Однако, поскольку использовались целые лизаты гиппокампа, эти результаты отражают изменения в содержании и фосфорилировании белков гиппокампа, а не прямые доказательства локализации^{синаптической 22,23}.

Аномалии, связанные с аутофагией, также могут способствовать молекулярным изменениям, наблюдаемым в этой модели. Аутофагия важна для нейронного протеостаза, но нарушенная аутофагическая деградация при АД может привести к накоплению аутофагосом и патологических белковых^{субстратов 24,25}. В настоящем исследовании Aβ1-42 увеличил как отношение LC3-II/I, так и экспрессию p62, что указывает на накопление субстратов, связанных с аутофагосомой LC3-II и аутофагии. Триптолид снижал оба маркера, тогда как LY294002 частично обратил этот эффект, что предполагает, что триптолид может облегчать накопление белков, связанных с аутофагией, с помощью PI3K/Akt-зависимого механизма. Вместе с изменениями в гефирине, коллибистине и сигнализации PI3K/Akt/GSK-3β эти данные расширяют понимание нейропротективных эффектов триптолида, выходящих за рамки противовоспалительных или общих нейропротекторных эффектов, что предполагает, что триптолид может также влиять на ингибиторные синапс-ассоциированные белки, киназную сигнализацию и связанные с протеостазом пути при Aβ-ассоциированной АД-подобной^{патологии 26}.

Успех и воспроизводимость этого протокола определяются несколько ключевых этапов. Во-первых, состояние агрегации Aβ1-42 должно тщательно контролироваться и проверяться перед введением, поскольку подготовка пептида может сильно влиять на патологические исходы. Во-вторых, точный стереотаксичный ввод в боковые желудочки крайне необходим; Рефлюкс, неправильная установка иглы или чрезмерная скорость инъекции могут привести к переменному воздействию Aβ и непоследовательным поведенческим или гистологическим последствиям. В-третьих, тестирование водных лабиринтов Морриса требует стабильных визуальных сигналов, постоянной температуры воды и контроля скорости плавания, чтобы исключить моторные нарушения как фактор, вызывающий путаницу. В-четвёртых, гистологическое и иммуногистохимическое количественное определение должно проводиться с использованием заранее определённых интересующих областей гиппокампа и слепого анализа. Наконец, результаты Western blot зависят от равномерной нагрузки белка, соответствующей концентрации геля, эффективного переноса и использования необрезанных блитов для подтверждения специфичности полос.

Следует учитывать несколько ограничений. Во-первых, модель инъекций Aβ1-42 не воспроизводит хроническое прогрессирование, патологию тау, сосудистые изменения или нейроиммунную сложность, характерную для человеческого АД. Во-вторых, хотя самцы и самки мышей были равномерно распределены по группам, исследование не было основано на анализе по полу²⁷. В-третьих, лизаты целого гиппокампа не могут определить, происходят ли изменения в Гефирине и Коллибистине именно в ингибиторных синапсах. В-четвёртых, предложенный механизм PI3K/Akt/GSK-3β–Гефирин остаётся ассоциативным, поскольку активность GSK-3β и фосфорилирование Gephyrin Ser270 не подвергались прямой манипуляции. Наконец, LC3-II/I и p62 являются статическими показателями западного блота и не могут полностью определить динамический аутофагический поток. В будущих исследованиях следует использовать фракционирование синаптосом, иммунофлуоресцентную колокализацию с ингибиторными постсинаптическими маркерами, методы прироста или потери функции GSK-3β, мутантные конструкции Gephyrin Ser270 и анализы потока на основе лизосомных ингибиторов. Также потребуется валидация в хронических трансгенных моделях АД, моделях, связанных с тау, и нейронных системах, полученных от человека, чтобы определить, является ли этот путь широко релевантным для патологии^{АД 14}. Ещё одним ограничением является то, что агрегационное состояние точного препарата Aβ1-42, используемого для стереотаксичной инъекции, не было независимо подтверждено с помощью флуоресценции тиофлавина T, SDS-PAGE/вестерн-блоттинга или трансмиссионной электронной микроскопии. Хотя пептид был подготовлен с использованием продолжительной инкубационной процедуры при температуре 37 °C, обычно применяемой для стимулирования агрегации Aβ1-42, вариации агрегации от партии к партии могут повлиять на патологические исходы. Будущие исследования должны подтвердить этот рабочий процесс в хронических трансгенных моделях АЦ, моделях, связанных с тау, и нейронных системах, полученных от человека. Дополнительные эксперименты должны включать прямую валидацию статуса агрегации Aβ1-42, оценку точности стереотаксических инъекций с использованием красителя или анатомической верификации, фракционирование синаптосом, иммунофлуоресцентную колокализацию с ингибиторными постсинаптическими маркерами, методы прироста или потери функции GSK-3β, эксперименты с мутантами Gephyrin Ser270 и аутофагические анализы на основе лизосомных ингибиторов. Для рассмотрения трансляционных применений также необходимы исследования доза-реакции и безопасности триптолида.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Anti-Gephyrin antibody	12681	Peoteintech	Первичное антитело для обнаружения общего Gephyrin в Western blot.
Anti-phosphorylated-Gephyrin  antibody	147011	Synaptic Systems	Первичное антитело для обнаружения фосфорилированного Gephyrin в Western blot.
Anti-Collybistin antibody	ab316963	abcam	Первичное антитело для обнаружения Collybistin в Western blot.
Anti-PI3K antibody	27921	Peoteintech	Первичное антитело для обнаружения PI3K в Western blot.
Anti-Akt antibody	9272	Cell Signaling Technology	Первичное антитело для обнаружения общего Akt в Western blot.
Anti-phosphorylated Akt antibody	4060	Cell Signaling Technology	Первичное антитело для обнаружения фосфорилированного Akt в Western blot.
Anti-GSK-3β antibody	12456	Cell Signaling Technology	Первичное антитело для обнаружения общего GSK-3β в Western blot.
Anti-phosphorylated GSK-3β antibody	5558	Cell Signaling Technology	Первичное антитело для обнаружения фосфорилированного GSK-3β в Western blot.
Anti-β actin antibody	66009	Peoteintech	Антител для нормализации Western blot в качестве контроля загрузки.
Anti-LC3 antibody	11972	Cell Signaling Technology	Первичное антитело для обнаружения LC3-I и LC3-II в Western blot.
Anti-p62 antibody	5114	Cell Signaling Technology	Первичное антитело для обнаружения p62/SQSTM1 в Western blot.
Anti-Aβ1-42 antibody	ab150155	abcam	Первичное антитело для обнаружения Aβ1-42.
HRP-conjugated secondary antibody (anti-mouse IgG)	7076S	Cell Signaling Technology	Вторичное антитело для мышиных первичных антител в Western blotting.
HRP-conjugated secondary antibody (anti-rabbit IgG)	7074S	Cell Signaling Technology	Вторичное антитело для кролика первичных антител в Western blotting.
Anti-Aβ antibody	GT622,	Invitrogen,	Первичное антитело для иммуногистохимии Aβ.
Aβ1-42	9001	Shanghai Duma Technology Co., Ltd.	Амилоидный-β пептид, используемый для приготовления раствора для индуцирования агрегации.
triptolide	BD9097	Shanghai Bide Pharmaceutical.	Тестовое соединение, вводимое внутрибрюшинно.
LY294002	ab120243	abcam	Ингибитор PI3K, используемый для солечения в группе солечения.
paraformaldehyde	P0099	Beyotime	Фиксирующий агент для транскардиальной перфузии и последующей фиксации тканей.
xylene	108298	Merck	Средство для депарафинизации и очищения тканей.
ethanol	100983	Merck	Средство для регидрата и дегидратации для парафиновых секций.
propylene glycol	294004	Merck	Компонент носительного средства для приготовления лекарственного раствора.
protease and phosphatase inhibitors	P1045	Beyotime	Добавка в буфер лизиса для сохранения белков и фосфорилирующих состояний.
RIPA lysis buffer	P0013	Beyotime	Буфер лизиса для извлечения общего белка из ткани гипокампа.
EDTA antigen retrieval buffer	ab93680	abcam	Буфер для термической ретриева антигена для иммуногистохимии.
pentobarbital sodium	P3761	Sigma	Анестетик, используемый для операций и сбора тканей.
Goat serum	ZLI-9056	ZSGB-BIO	Блокирующий реагент для иммуногистохимии.
PVDF membranes	ISEQ00010	Merck Millipore	Мембрана, используемая для переноса в Western blot.
Morris water maze	VX80	Shanghai Xinruan Information Technology Co., Ltd.	Поведенческий аппарат и система видео-трекинга для оценки пространственного обучения и памяти.
chemiluminescence imaging system	Doc™ XR+ 1708195	Bio-rad	Система имэджинга для получения хемилюминесцентных сигналов в Western blot.
stereotaxic apparatus	/	Stoelting Technology Co., Ltd	Аппарат для стереотаксической внутривентрикулярной инъекции.
BCA protein assay kit	P0006	Beyotime	Колорометрический набор для измерения концентрации общего белка.
microplate reader	Synergy2	Biotek	Инструмент для измерения оптической плотности, используемый для определения BCA.
ImageJ	version 9.0.1	National Institutes of Health	Программное обеспечение для анализа изображений для гистохимии, иммуногистохимии и денситометрии Western blot.
GraphPad Prism	version 8.5	GraphPad Software	Программное обеспечение для статистического анализа и построения графиков.