Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

In vivo Кальциевая визуализация с помощью миниатюрного микроскопа гипоталамуса для понимания социальных поведений мышей

992 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70401

⸱

20 марта 2026 г.

 ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Westlake University, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Harvard University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол подробно описывает кальциевую визуализацию гипоталамических нейронов in vivo с помощью миниатюрного микроскопа (минископа) у свободно ведущих себя мышей во время манипуляций социальным состоянием (социальная изоляция и воссоединение). Этот метод позволяет визуализировать с разрешением одного нейрона гипоталамическую активность, отражающую социальную потребность и социальную насыщенность, что позволяет механистически изучать социальный гомеостаз.

Аннотация

Социальное поведение у позвоночных строго регулируется через гипоталамические цепи. Недавно были выявлены молекулярно определённые типы гипоталамических нейронов для гомеостатического кодирования социальной потребности. Здесь мы описываем пошаговый протокол проведения кальциевой визуализации in vivo в гипоталамическом медиальном преоптическом ядре (MPN) с использованием миниатюрного микроскопа (минископа), установленного на голове, у свободно ведущих себя мышей. Этот метод позволяет проводить продольные записи динамики нейронной популяции во время социальной изоляции и воссоединения, что позволяет проводить механистические исследования социальной нужды и социальной насыщености при разрешении одного нейрона. В частности, взрослые мыши получают стереотаксичные инъекции аденоассоциированного вируса (AAV), экспрессирующего генетически закодированный кальциевый индикатор в MPN, после чего имплантируют линзу с градиентным индексом (GRIN) и базу минископа. После восстановления мыши привыкают к установке минископической визуализации и подвергаются плановой социальной изоляции и воссоединению, во время которого визуализируется нейронная активность. Сигналы кальция синхронизируются с поведением животных для дальнейшего анализа. Этот протокол предоставляет комплексные рекомендации по кальциевой визуализации in vivo с помощью минископа гипоталамуса мыши во время социального поведения. Его легко адаптировать для визуализации в других глубоких областях мозга и в различных поведенческих контекстах. Этот подход объединяет нейронную активность на клеточном уровне и социальное поведение, углубляя наше понимание нейронных основ сложного поведения у свободно движущихся животных.

Введение

Способность поддерживать социальные связи является фундаментальной для выживания животных 1,2,3. Длительная социальная изоляция вызывает тревогу, когнитивные нарушения и метаболические изменения, тогда как воссоединение восстанавливает социальную активность и социальные потребности 4,5,6. Наблюдаемое восстановление в социальном поведении после кратковременной социальной изоляции указывает на наличие гомеостатическогомеханизма 7, аналогичного регуляцииголода 8,9 или жажды 10,11,12. Однако нейронные субстраты, опосредовающие социальный гомеостаз, остаются плохо изученными.

Недавние исследования показали, что отдельные популяции гипоталамических нейронов кодируют социальную потребность и социальную насыщение соответственно7. Кальциевая визуализация in vivo показала, что популяция генетически определённых глутаматергических нейронов в медиальном преоптическом ядре (MPN) становится активной во время изоляции (нейроны MPN Isolation ), тогда как другая популяция ГАМКергических нейронов становится активной при воссоединении (нейроныMPN Reunion ). Оптогенетическая активациянейронов изоляции МПН имитирует состояние социальной изоляции, а оптогенетическая активация нейроноввоссоединения МПН ослабляет социальный рикошет, что указывает на их противоположную роль в регулировании социальных потребностей. Эти популяции взаимодействуют взаимно и соединяются с нейронными цепями всего мозга, образуя обратную связь, динамически модулирующую социальную потребность.

Здесь мы представляем подробный протокол с общей целью позволить исследователям фиксировать динамику кальция в глубоком мозге при разрешении одного нейрона у свободно движущихся мышей во время этологически значимых социальных поведений, таких как социальная изоляция ивоссоединение 13. Сочетание этой техники визуализации с этологически значимыми социальными парадигмами предоставляет беспрецедентную возможность исследовать нейронное представление различных социальных состояний. Обоснование разработки этого адаптированного метода связано с необходимостью визуализировать, как социальная потребность и насыщение динамически проявляются в глубоких структурах мозга, таких как MPN. Хотя использование минископа уже описывалось14, 15 и 16, его применение в неограниченных социальных взаимодействиях, особенно при переходах между изоляцией и воссоединением, требует специфических технических и поведенческих адаптаций для поддержания оптической стабильности, минимизации артефактов движения и обеспечения естественного проявления поведения.

По сравнению с фотометрией волокон, подход на основе минископа обеспечивает клеточное разрешение, позволяя различать различные типы функциональных нейронов в одной области. Он позволяет проводить долгосрочные записи свободно взаимодействующих животных, что крайне важно для изучения социально обусловленной нейронной динамики. Предыдущие исследования с использованием однофотонной микроэндоскопии в основном были сосредоточены на коре или дорсальном гиппокампе во время пространственных или сенсорных задач14, 15 и 16. Наш протокол расширяет эти достижения на более глубокие субкортикальные области во время сложных социальных поведенческих происходящих, предоставляя шаблон для исследования аффективных состоятельных цепей в натуралистических условиях.

Протокол оптимизирован для областей мозга глубиной до ~5 мм, с использованием имплантации линз GRIN и генетически закодированных индикаторов кальция. Ключевые аспекты включают точность хирургии, размещение линз, разработку поведенческих парадигм и сопутствующий анализ данных. Этот метод можно адаптировать для других глубоких областей мозга и поведенческих контекстов. Этот протокол проводит пользователей на всех критических этапах: хирургическая подготовка, доставка вируса, имплантация хрусталиков, поведенческий дизайн, установка минископа, визуализация и анализ данных (рисунок 1A-E). Мы ожидаем, что этот доступный, детализированный рабочий процесс позволит изучать нейронные популяции глубокого мозга в широком спектре натуралистических поведенческих проявлений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры были утверждены комитетом по этике животных Университета Вестлейк с протоколом для животных #25-076-LD-9. Все эксперименты проводились в соответствии с рекомендациями Лабораторного корпуса животных Университета Вестлейк. Всё оборудование и материалы, используемые в этом протоколе, перечислены в Таблице материалов.

1. Операция по инъекции вируса

  1. Поместите мышь в камеру для анестезии с 2-3% изофлураном.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Успешное введение анестезии подтверждается отсутствием рефлекса сжатия пальцев и ровным, глубоким дыханием.
  2. Через 2-3 минуты, или после потери рефлекса выпрямления, быстро перенесите животное на стереотаксичный инструмент. Закрепить нос в конусе с анестезией и поддерживать анестезию с дозой 1-1,5% изофлурана на время операции (рисунок 1B). Расход кислорода обычно устанавливается в диапазоне 0,8–1,2 л/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за частотой дыхания животного и другими физиологическими признаками. Если у животного увеличивается частота дыхания и у него появляются усы и другие признаки пробуждения, увеличьте концентрацию изофлурана до 2-3%.
  3. Закрепите резцы мыши через режцовую планку стереотаксичного инструмента. Затяните носовой зажим, чтобы закрепить головку.
  4. Аккуратно введите две ушные планки во внешние слуховые каналы, пока они не закрепятся, обеспечивая стабильную и жесткую фиксацию головы (рисунок 1B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: (1) Неправильное расположение, сжимающее ткани шеи, может вызвать дыхательные недостатки или нестабильную фиксацию. (2) Если у животного наблюдаются признаки затруднённого дыхания или затруднения во время фиксации, немедленно отпустите и переместите ушные планки, так как это указывает на возможное сжатие дыхательных путей. (3) Убедитесь, что обе ушные планки расположены на одинаковой высоте. Это необходимо для последующего точного выравнивания черепа.
  5. Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза мыши, чтобы предотвратить пересыхание глаз.
  6. Удалите головную шерсть с помощью крема для удаления волос. Тщательно протрите эту область салфетками с 75% этанолом, чтобы удалить остатки крема и волос.
  7. Дезинфицируйте открытую кожу салфетками с 75% этанолом и бетадином. Использование тонких хирургических ножниц для нанесения сагиттального разреза по средней линии через кожу головы. Оттяните кожу, чтобы полностью открыть череп над целевой областью мозга. Аккуратно очистите поверхность черепа ватной палочкой, чтобы удалить надстволь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Открытие достаточно большой площади черепа необходимо для обеспечения прочного крепления зубного цемента, обеспечивающего долгосрочную стабильность импланта.
  8. Закрепите стеклянную пипетку на стереотаксичный держатель для измерения поверхности черепа. Под стереомикроскопом определите кончик пипетки к брегме (пересечению сагиттального и коронального швов) и установите его как начало координат (X = 0, Y = 0, Z = 0, рисунок 1C).
  9. Переместите кончик пипетки в позиции ±2 мм латерально по сравнению с брегмой и отрегулируйте уровень черепа, пока разница высот между этими двумя точками не достигнет ±0,03 мм.
  10. Затем переместите пипетку к лямбде (место пересечения сагиттального и лямбдовидного швов) и отрегулируйте переднезадний наклон, пока разница высот между брегмой и лямбда не достигнет ±0,03 мм (рисунок 1C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: (1) Предварительное визуальное осмотрение и корректировка черепа могут значительно упростить процесс тонкого выравнивания. (2) Сушка поверхности черепа сжатым воздухом перед выравниванием улучшает видимость черепных швов.
  11. Используйте ручное сверло с головкой 0,8 мм, чтобы провести краниотомию над целевой областью мозга (например, для мышей C57BL6/J). Координаты расположены на передне-заднем (AP) 0 мм, медиально-латеральном (ML) 0,3 мм и дорсально-вентральной (DV) -4,8 мм для нацеливания на область MPN; для мышей FVB/NJ краниотомия выполняется при AP +0,4 мм-+0,5 мм, ML 0,3 мм и DV -4,8 мм) (рисунок 1C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В случае кровотечения временно увеличите концентрацию изофлурана до 2-2,5%. Используйте стерильный хлопковый наконечник или гемостатическую губку для впитывания крови, затем сразу же нанесите стерильный физиологический раствор. После гемостаза вернуть уровень изофлурана до поддерживающего уровня (1-1,5%) и удалить лишнюю жидкость.
  12. После краниотомии выполните стереотаксичную инъекцию вируса с выражением кальциевого индикатора в целевом участке мозга.
  13. Разведите AAV-hSyn-jGCaMP7f — аденоассоциированный вирус, используемый для экспрессии генетически закодированного кальциевого индикатора в нейронах и для визуализации нейронной активности с помощью кальциевых сигналов, до конечного титра примерно 5 × 10¹² вирусных геномов на миллилитр перед введением.
  14. Сначала наполните стеклянную пипетку минеральным маслом, затем вирусным раствором, чтобы избежать пузырьков воздуха. Разместите пипетку по координатам цели на поверхности черепа и медленно опустите её до глубины цели.
  15. Вводите вирус в одностороннем порядке с медленной, постоянной скоростью (например, 30 нл/мин), с общим объёмом 400нл-7, чтобы обеспечить заражение достаточного количества нейронов в области МПН. Это количество можно регулировать в зависимости от конкретных размеров областей мозга и существования дополнительных ограничений, таких как система Cre-loxP.
  16. После завершения оставьте пипетку на месте на 10-15 минут, чтобы обеспечить адекватную диффузию вируса и минимизировать рефлюкс вдоль пути инъекции, прежде чем медленно убрать.
    ПРИМЕЧАНИЕ: (1) Вирусные аликвоты с соответствующими и стабильными титрами критически важны для успешной и стабильной экспрессии у животных. Чрезмерно высокий титр может вызвать нейротоксичность, а недостаток титра приводит к слабой экспрессии и плохому соотношению сигнал/шум при визуализации. (2) Медленная скорость инъекции и достаточное время ожидания перед удалением пипетки критически важны для минимизации повреждения тканей и предотвращения вирусного рефлюкса, обеспечивая точную и устойчивую экспрессию вируса в целевой области.
  17. После инъекции вируса зашьют кожу над черепом с помощью впитываемых швов.
  18. После операции подкожно вводят карпрофен (5 мг/кг) сразу после операции для обезболивания с продолжением мониторинга и дополнительного применения по мере необходимости в течение следующих трёх дней.
  19. После операции по введению вируса содержать мыши отдельно не менее 2-3 недель, чтобы обеспечить достаточное восстановление животных и экспрессию вируса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Имплантация линзы GRIN (раздел 2) может быть выполнена в тот же день, что и вирусная инъекция, или через 2-3 недели после вирусной инъекции. В этом протоколе мы описываем двухэтапный метод, который позволяет экспериментатору оценивать экспрессию вирусов во время имплантации линзы GRIN.

2. Имплантация линзы GRIN

  1. Повторите шаги 1.1-1.10, чтобы снова открыть краниотомию. Поцарапайте поверхность черепа скальпелем для лучшего захвата зубного цемента в шаге 2.8. Для новой краниотомии диаметр должен быть немного больше, чем у GRIN (обычно ~1 мм), чтобы обеспечить плавную имплантацию. Тщательно очищайте все остатки после сверления.
  2. Чтобы уменьшить сжатие тканей во время имплантации линзы GRIN, введите стеклянную пипетку в целевой область мозга и медленно перемещайте пипетку в посреднестороннем направлении, чтобы создать разрез. Этот микрорез имеет длину ~1 мм, чтобы освободить место для имплантации линзы GRIN (рисунок 2A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг критически важен для успеха всего протокола.
  3. Перед имплантацией линзы GRIN продезинфицируйте линзу 75% этанолом, затем промойте стерильным физиологическим раствором и аккуратно протрите салфеткой.
  4. Держите объектив GRIN держателем и прикрепляйте минископ к верхней части объектива.
  5. Разместите всю сборку в брегме и установите все координаты равными нулю (то есть X = 0, Y = 0, Z = 0). Затем разместите её по координатам цели X-Y над краниотомией.
  6. Смочите поверхность черепа стерильным физиологическим раствором. Очень медленно опускайте линзу GRIN в ткань мозга со скоростью примерно 100 мкм/мин, пока она не достигнет цели (рисунок 2B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: (1) Если имплантация линзы GRIN проводится через 2-3 недели после инъекции вируса, во время установки линзы, включите минископ, чтобы наблюдать изменения флуоресценции в реальном времени. По мере приближения линзы к целевой области общий флуоресцентный сигнал в поле зрения становится ярче, и это изменение можно читать непосредственно с гистограммы сигнала в реальном времени с помощью программного обеспечения для визуализации (рисунок 2C, D). (2) Будьте осторожны, чтобы избежать кровотечения во время имплантации, так как тромбы значительно ухудшают качество сигнала. (3) Если кровотечение неизбежно и сильно, вынимите линзу GRIN, очистите линзу и снова имплантируйте после прекращения кровотечения.
  7. После имплантации линзы тщательно высушите поверхность черепа, впитая остаточную жидкость и продувая сжатым воздухом.
  8. Аккуратно нанесите зубной цемент, чтобы закрепить основание линзы GRIN к черепу и постройте полноценную головку, которая покрывает открытый череп (рисунок 2B). Будьте осторожны, чтобы цемент не контактировал с окружающими мышцами. Затем аккуратно ослабьте держатель объектива и снимите держатель вместе с минископом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: (1) Смешайте зубной цемент в охлаждённой плите на льду, чтобы замедлить процесс затвердевания и увеличить рабочее время. (2) Рекомендуется установить головную планку за объективом для удержания мыши во время подключения к минископу. (3) Будьте очень осторожны, чтобы не наносить цемент на держатель линзы или минископ.
  9. Подготовьте двухкомпонентный силиконовый клей, смешав его две жидкости. Нанесите его на верхнюю часть линзы GRIN, чтобы создать защитное уплотнение от пыли и царапин в период восстановления.
  10. После имплантации линзы GRIN размещайте мышь отдельно, чтобы избежать возможных повреждений линзы со стороны соседей по клетке во время восстановления.

3. Установка базовой пластины

  1. Через две-три недели после имплантации линзы GRIN проводится установка базовой пластины. Анестезируйте и фиксируйте мышь в стереотаксическом инструменте, как описано выше.
  2. Снимите силиконовое уплотнение с верхней части линзы GRIN и аккуратно очистите поверхность линзы кусочком салфетки.
  3. Прикрепите базовую пластину к минископу. Весь сборку микроскопа и основания закрепите на стереотаксичный манипулятор через держатель.
  4. Подключите минископ к блоку сбора данных и включите живую визуализацию.
  5. Выровнять объектив минископа и имплантированную линзу GRIN, тонко настроив манипулятор для достижения точного оптического коаксиального выравнивания между минископом и линзой GRIN.
  6. Расположите объектив минископа параллельно верхней поверхности линзы GRIN и убедитесь, что граница всей линзы GRIN включена в окно с идеальным кругом, а центр объектива находится в центре окна.
  7. Опустите минископ до оптимального рабочего расстояния, чтобы получить чёткие изображения нейронов в целевой фокальной плоскости.
  8. Используйте стоматологический цемент, чтобы соединить и инкапсулировать основание на существующую цементную крышку (рисунок 2B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: (1) Критическим шагом является поднятие минископа на небольшое, эмпирически определённое расстояние (примерно 50-100 мкм) перед окончательной фиксацией, чтобы компенсировать потенциальный сдвиг фокальной плоскости, вызванный усадкой цемента во время затвердевания. (2) Будьте крайне осторожны, чтобы зубной цемент не коснулся частей минископа, которые должны быть отсоединены после установки базовой пластины.
  9. После полного затвердевания зубного цемента ослабьте держатель, аккуратно отсоедините микроскоп от базовой пластины и немедленно прикрутите крышку к основной пластине для защиты оптического интерфейса.
  10. Индивидуально держать мышь в течение 3-5 дней после установки базовой пластины, а затем воссоединять мышь с соседями по клетке минимум на неделю до манипуляций социальным состоянием (например, социальная изоляция).

4. Настройка параметров привычки и изображения

  1. Привычьте имплантированных мышей к временному подголовнику для установки минископа и к установке визуализации 2-3 раза перед формальными сессиями визуализации.
  2. Чтобы закрепить минископ на базовой пластине, зафиксируйте голову имплантированных мышей, снимите крышку и пристыкуйте минископ к ней через магнитный интерфейс. Затем затяните боковой винт, чтобы закрепить минископ. Проведите кальциевую визуализацию в течение 10 минут, в течение которых животное свободно перемещается в арене для записи или клетке.
  3. Введите стимулы, такие как нежное прикосновение и новая мышь, во время этой пилотной сессии визуализации. Проанализируйте данные (см. подробности в разделе 6), чтобы проверить, можно ли извлечь сигналы одного нейрона. Во время привыкания определите оптимальные настройки изображения, регулировав фокальную плоскость минископа на рабочем расстоянии, чтобы максимизировать количество наблюдаемых нейронов и чёткость изображения.
  4. Установите мощность освещения на ~10% от максимального значения и усиление датчика на ~10-20% от максимального, чтобы получить чёткие сигналы без насыщения. Изображение с пространственным разрешением 1280 x 800 и частотой дискретизации 20 Гц. Сохраняйте эти настройки для каждого животного и используйте их повторно во время следующих сессий съёмки.

5. Социальные поведенческие анализы для минископической кальциевой визуализации

  1. Анализ социального воссоединения (рисунок 3A)
    1. Изолируйте мышь с имплантированным минископом в течение 1, 3 или 5 дней перед снимком. Проводите кальциевую визуализацию во время начальной стадии, воссоединения и повторной изоляции.
    2. Базовый уровень: подключите мышь к минископу и записывайте 10 минут, в течение которых мышь находится в изоляции.
    3. Воссоединение: Добавьте бывший Cagemate в камеру звукозаписи и запишите 10 минут.
    4. Повторная изоляция: Удалите кагемат после 10-минутного воссоединения и сделайте изображение ещё 10 минут во время повторной изоляции.
  2. Анализ социальной изоляции (рисунок 3B)
    1. Изолировать мышь с имплантированным минископом на 6 часов и записывать кальциевые сигналы в начале каждого часа в течение 15 минут.
    2. Добавьте бывший кагемат в камеру записи и записывайте в течение 10 минут в конце всей сессии визуализации, чтобы определить нейроны, значительно модулированные социальным воссоединением (см. подробности в разделах 6 и 7).
      ПРИМЕЧАНИЕ: (1) Этот конкретный график визуализации используется для минимизации фотоотбеливания сигналов и обеспечения мониторинга нейронной активности в течение первых 6 часов социальной изоляции. (2) Минископ соединён на протяжении всей процедуры. (3) Этот подход позволяет отслеживать один и тот же нейронный ансамбль на протяжении всей сессии визуализации. (4) Во время визуализации предоставляются пища и гидрогель.

6. Предварительная обработка данных

  1. Импортируйте необработанные видео с изображениями в программное обеспечение для обработки данных.
  2. Пространственно и временно снижайте дискретизацию оригинального видео, когда это необходимо, чтобы снизить вычислительную нагрузку на анализ данных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого анализа исходные данные изображений собираются с пространственным разрешением 1280 x 800 при 20 Гц; Пространственно уменьшайте дискретизацию видео в 4 раза и временно в 2 раза.
  3. Примените фильтр пространственного пропускания полосы с глобальным средним вычитанием для уменьшения высокочастотного шума и низкочастотного фонового дрейфа.
  4. Корректируйте артефакты движения с помощью алгоритма коррекции движения в программном обеспечении для обработки данных. Визуально осмотрите фильм с коррекцией движения, чтобы убедиться в стабильной нейронной соматах и минимальных остаточных артефактах движения.
  5. Нажмите кнопку «Идентифицировать клетки» и выберите «CNMFe» в списке, чтобы извлечь следы кальциевой активности отдельных нейронов с помощью алгоритма CNMF-E17 (Ограниченная неотрицательная матричная факторизация для микроэндоскопических данных).
  6. Нажмите кнопку линейки в программном обеспечении обработки данных и измерьте диаметры сома (в пикселях) по представительным нейронам. Введите средний размер в поле «Средний диаметр ячейки (пиксели)». Затем нажмите кнопку Применить , чтобы запустить CNMF-E.
  7. Корректируйте настройки инициализации CNMF-E, когда обнаружение ячеек недостаточно, появляется чрезмерное количество компонентов, не связанных с ячейками, или происходит чрезмерная сегментация.
  8. Проверьте все экстракцированные компоненты и принимайте/отвергайте их, исходя из морфологии клеток и биологически правдоподобной динамики кальция. Исключайте компоненты с неправильными и колючими формами. Исключайте следы, основанные на шуме или артефактах движения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: (1) На рисунках 2E и 2F показаны два признанных нейрона с чёткой морфологией нейронов, а также типичные кальциевые транзиенты. (2) На рисунках 2G и 2H показаны два отторженных нейрона с выраженными базовыми флуктуациями и отсутствием типичных кальциевых транзиентов.
  9. Экспортировать следы флуоресценции принятых нейронов из программного обеспечения для обработки данных для дальнейшей идентификации нейронов с модулированным социальным состоянием (раздел 7).

7. Идентифицировать нейроны, модулируемые социальным состоянием

  1. Используйте MATLAB или Python для дальнейшего анализа заранее обработанных данных.
  2. Согласовать следы активности кальция принятых нейронов с поведенческими временными метками.
  3. Найдите момент социальной встречи по поведенческому видео. Для каждого нейрона сегментируйте активность на период социальной изоляции до воссоединения в 300 и 300 с периодом социального воссоединения.
  4. Для каждого нейрона количественно определите распределение активности кальция в период изоляции и воссоединения.
  5. Проведите анализ операционных характеристик приёмника (ROC)18 для оценки способности нейронной активности различать состояния изоляции и воссоединения, давая значение AUC, вычисляющее площадь под кривой ROC.
  6. Оцените статистическую значимость с помощью перестановочного теста. Для каждого нейрона значения активности кальция циркулярно перемещаются между поведенческими состояниями в временных блоках по 1 с в течение 1 000 раз, чтобы получить нулевое распределение значений AUC. Нейроны с наблюдаемыми значениями AUC, превышающими 95-й процентиль их перетасованного нулевого распределения, считаются значительно модулированными социальным состоянием.
  7. Классифицировать значительно модулированные нейроны по направлению модуляции. Классифицировать нейроны, ингибируемые воссоединением, как изолированные нейроны и активируемые при воссоединении как нейроны воссоединения (рисунок 4).

8. Верификация после эксперимента

  1. Перфузируйте мышей и проведите стандартную гистологию для проверки трека линзы GRIN и экспрессии вируса (см. пример гистологической визуализации на рисунке 2I).
  2. Используйте 4% PFA, чтобы скрепить всю головку мыши вместе с имплантатом, затем снимите линзу GRIN, чтобы визуализировать прозрачный трек линзы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Включайте только данные животных с правильным назначением.

9. Устранение неисправностей и практические советы

  1. Закрепите заголовок зубным цементом позади минископа, чтобы облегчить монтаж и снятие минископа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перекладина головы не должна быть слишком длинной и может быть размещена под слегка наклонённым углом, чтобы предотвратить вмешательство в социальное поведение.
  2. Индивидуально размещайте имплантированных мышей в период восстановления после операции не менее одной недели. Это даёт мышам достаточно времени на восстановление и предотвращает повреждение импланта другими мышами.
  3. Воссоедините имплантированных мышей с их прежними кагематами, когда они полностью восстановятся. Регулярно проверяйте и затягивайте крышки. Подготовьте дополнительные крышки и замените их, когда они потеряются во время обслуживания животных.
  4. Проверьте кальциевые сигналы через 3-4 недели после введения вируса GCaMP. Если сигналы слишком слабые или неясные, более длительный период восстановления иногда улучшает качество сигналов.
  5. Будьте осторожны с поверхностями объективов как со стороны объектива GRIN, так и со стороны минископа. Держите линзы в чистоте и без царапин. Закрывайте объектив, когда не используйте.
  6. Перед снимкой отрегулируйте длину сигнального кабеля так, чтобы животное могло добраться до углов площадки, и достаточно короткой для плавного социального взаимодействия.
  7. При необходимости защищайте кабель слоем прочного материала, чтобы предотвратить укусы других мышей во время общения. Регулярно проверяйте сигнальный кабель, чтобы проверить, не перекручен ли он из-за интенсивного общения.
  8. Чтобы выявить один и тот же нейронный ансамбль из последовательных сеансов визуализации (например, на рисунке 3B), исходные видео с изображениями можно объединить для извлечения кальциевых следов.
  9. Для синхронизации нескольких сигналов, например, поведенческих видео и кальциевых сигналов, обычно используются общие TTL-входы и синхронизированные фонарики для выравнивания различных файлов записи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Идентификация нейронных популяций
Мы экспрессировали вирус GCaMP и имплантировали линзу GRIN в MPN мыши C57BL/6J. После операции мышь восстановилась по отдельности и была воссоединена с соседями по клетке как минимум на неделю. Мышь затем содержалась отдельно в течение трёх дней перед кальциевой визуализацией. Во время визуализации сначала была зафиксирована 10-минутная изоляция, а затем 10-минутная социальная встреча с бывшим соседом по клетке. Для анализа ROC исполь...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол подробно описывает интегрированный подход, сочетающий кальциевую визуализацию in vivo miniscope с социальными поведенческими парадигмами для оценки профиля активности гипоталамических нейронов. Он позволяет проводить долгосрочную клеточную разрешённую кальциевую визуализацию из глубоких структур мозга во время естественных социальных взаимодействий. В следующих разделах рассматриваются критические шаги, методологическая значимость, ограничения и потенциал этого под...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конкурирующих финансовых интересах или конфликте интересов. В процессе редактирования рукописей использовался ChatGPT с тщательной и детальной корректурой всеми авторами.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить профессора Кэтрин Дюлак за поддержку начального обучения минископическим экспериментам и Ян Суну за помощь в проведении операции. Эта работа была поддержана стартовым финансированием от Университета Вестлейк и финансированием от Фонда NOMIS, Центра исследований аутизма Тан-Янга при Гарвардском университете, премии Джейн Коффин Чайлдс за медицинские исследования для доктора Л. и постдокторской стипендии Фонда Чарльза А. Кинга для доктора Л. Благодарим всех членов лаборатории Лю за их комментарии к рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
AAV2/9-hSyn-jGCaMP7f-WPRE-pATaitoolS0587-9Вирусные векторы, хирургия
Абсирбируемая гемостатическая желатиновая губкаFUKANGSENFKS-AХирургия
Раствор бетадина (10% йодированный повидон) 500 млHYNAUTQ13702855HNW002Хирургия
Камера для поведенческих видеоДЭХЭНMER2-160-227-U3CПоведение
КарпрофенMCEHY-B1227Хирургия
Цифровые стереотаксичные инструментыЗадний привод68803Хирургия
Этанол (75%)Sinopharm Chemical Reagent Co., Ld801769610Хирургия
Глазная мазьFODUH37022025Хирургия
Программное обеспечение для обработки данных Inscopix (IDPS)Inscopix1000-006551Анализ данных
ИзофлуранЗадний приводR510-22-10Хирургия
Клеевой пакет Kwik-Sil из 2 штукWorld Precision InstrumentsKWIK-SILХирургия
MicrodrillЗадний привод78001Хирургия
Микропипеточный вытягиватель MP-1000Задний приводMP-1000Хирургия
Многофункциональные решения для анестезии для животныхЗадний приводТАЙДЗИ-ИЭХирургия
Нанолитровый микроинжекционный насосЗадний приводР-480Хирургия
Минископ nVista 3.0Inscopix1000-004323Визуализация
Офтальмологический щипцЗадний приводF12006-10Хирургия
Рабочие ножницыЗадний приводS14001-15Хирургия
Набор для имплантов ProViewInscopix1000-004238Хирургия и визуализация
Смоляный цемент (супер-связь)Sun MedicalСупер Бонд C& BХирургия
Набор из 5 крышек для базовых пластинInscopix1050-004639Визуализация
Набор из 5 базовых пластинInscopix1050-004638Визуализация
Набор из 5 объективов GRIN, диаметр 0,6 мм, длина 7,3 ммInscopix1050-004626Хирургия и визуализация
Микроскоп StereotaxisМурцидерMSD205AХирургия
Стерильный физиологический растворЦИДУКЕЛИНR1B25071902Хирургия

Ссылки

  1. Beery, A. K. Frank Beach award winner: Neuroendocrinology of group living. Horm Behav. 107, 67-75 (2019).
  2. Krause, J., Ruxton, G. D. Living in groups. , Oxford University Press. (2002).
  3. Riters, L. V., Kelm Nelson, C. A., Spool, J. A. Why do birds flock? A role for opioids in the reinforcement of gregarious social interactions. Front Physiol. 10, 421(2019).
  4. Panksepp, J. B., Lahvis, G. P. Social reward among juvenile mice. Genes Brain Behav. 6 (7), 661-671 (2007).
  5. Matthews, G. A., Tye, K. M. Neural mechanisms of social homeostasis. Ann N Y Acad Sci. 1457 (1), 5-25 (2019).
  6. Lee, C. R., Chen, A., Tye, K. M. The neural circuitry of social homeostasis: Consequences of acute versus chronic social isolation. Cell. 184 (6), 1500-1516 (2021).
  7. Liu, D., et al. A hypothalamic circuit underlying the dynamic control of social homeostasis. Nature. 640 (8060), 1000-1010 (2025).
  8. Luquet, S., Perez, F. A., Hnasko, T. S., Palmiter, R. D. NPY/AgRP neurons are essential for feeding in adult mice but can be ablated in neonates. Science. 310 (5748), 683-685 (2005).
  9. Balthasar, N., et al. Leptin receptor signaling in POMC neurons is required for normal body weight homeostasis. Neuron. 42 (6), 983-991 (2004).
  10. Zimmerman, C. A., et al. Thirst neurons anticipate the homeostatic consequences of eating and drinking. Nature. 537 (7622), 680-684 (2016).
  11. Augustine, V., et al. Hierarchical neural architecture underlying thirst regulation. Nature. 555 (7695), 204-209 (2018).
  12. Allen, W. E., et al. Thirst-associated preoptic neurons encode an aversive motivational drive. Science. 357 (6356), 1149-1155 (2017).
  13. Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nat Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
  14. Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy. J Vis Exp. (124), (2017).
  15. Lee, H. S., Han, J. H. Successful in vivo calcium imaging with a head-mount miniaturized microscope in the amygdala of freely behaving mouse. J Vis Exp. (162), (2020).
  16. Burrows, R., Ma, C. H., Sun, Y. J. Long-term imaging of identified neural populations using microprisms in freely moving and head-fixed animals. J Vis Exp. (203), (2024).
  17. Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. eLife. 7, e28728(2018).
  18. Britten, K. H., Shadlen, M. N., Newsome, W. T., Movshon, J. A. The analysis of visual motion: a comparison of neuronal and psychophysical performance. J Neurosci. 12 (12), 4745-4765 (1992).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

GRIN
In vivo Кальциевая визуализация с помощью миниатюрного микроскопа гипоталамуса для понимания социальных поведений мышей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.