$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры были одобрены Комитетом по этике животных компании Guangzhou Miles Biotechnology Co., Ltd., номер одобрения — IACUC-MIS2023045.
Создание модели SUI Rat
Всего 20 самок крыс рода Спраг-Доули (SD) в возрасте 6–8 недель были использованы для создания модели травмы тазового дна, имитирующей роды. Для индуцирования вагинального баллонного расширения (VBD) крысам подвергали анестезии через внутрибрюшинную инъекцию кетамина (75 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг). В средневагинальный канал аккуратно вводили сдутый катетер 10 Fr Foley, после чего баллон надули 3 мл стерильного физиологического раствора. Баллон удерживался на месте 4 часа, чтобы воспроизвести продолжительное механическое растяжение мышц тазового дна и сжатие пудендального нерва, связанное с родами. Период моделирования составлял 7 дней. На 8-й день для уродинамического тестирования были случайным образом отобраны 6 животных.
Успешное создание модели было подтверждено с помощью уродинамических тестов и измерения уровня сывороточной лактатдегидрогеназы (LDH), которые служат индикаторами мышечного повреждения. После подтверждения успешного моделирования крысы с SUI случайным образом были разделены на группу с фиктивной операцией и группу лечения, в каждой из которых было по пять крыс. Одновременно в контрольную группу были предоставлены пять обычных крыс SD. В фиктивной группе иглоукалывающие иглы были введены в акупунктурные точки BL23 (расположенные в 6 мм латерально от позвочного отростка L2) и GB30 (позади тазобедренного сустава) без какой-либо электрической стимуляции. В группе электроакупунктуры те же акупунктурные точки стимулировались с помощью электроакупунктурного устройства по стандартному клиническому методу лечения. Электроакупунктурное устройство было настроено на 1 Гц с разредённой плотностью волны при напряжении 2 В. Каждое вмешательство длилось 30 минут в день в течение 10 последовательных дней. Все животные ежедневно контролировались и содержались в стандартных лабораторных условиях. В конце эксперимента на животных каждой группы проводилось уродинамическое тестирование. Впоследствии каждую группу крыс анестезировали смесью 3% изофлурана и 1,0 л/мин кислорода. После того как крысы потеряли сознание, концентрация изофлурана была скорректирована до 5%, а образцы были собраны после смерти крыс от дыхательной недостаточности.
Уродинамические тесты
После анестезии, вызванной изофлураном, животных помещали в положение на спине и закрепляли. Средний разрез нижней части живота обнажил мочевойпузырь 18. Эпидуральный катетер имплантировался через фистулу диаметром 2 мм в куполе мочевого пузыря, продвинул на 0,5–1,0 см в просвет и закреплялся швом 11-0 с помощью метода кошелька-верёвка. Катетер был подключён к системе мониторинга давления и перфузирован физиологическим раствором с 37 °C метилен-синего цвета при 10 мл/ч с помощью микрошприцового насоса, с одновременном внутривезиковым мониторингом давления. Максимальная ёмкость мочевого пузыря рассчитывалась как произведение длительности инфузии (интервал между началом инфузии и первой каплей уретральной жидкости) и скорости расхода. Давление точки утечки (ЛПП) определялось путём фиксации пика внутривезикального давления сразу после резкого снятия ручной компрессии брюшной поверхности. Все параметры были получены с помощью системы уродинамического анализа с тройными измерениями на каждую метрику. Все выборки были случайным образом закодированы и проанализированы слепым способом тремя независимыми операторами, каждый из которых выполнял одно измерение. Результаты трёх независимых измерений использовались для статистического анализа.
Измерьте уровень лактатдегидрогеназы в сыворотке (LDH)
На седьмой день после операции из хвостовой вены каждой крысы было получено примерно 1 мл цельной крови. Собранные образцы оставляли при комнатной температуре в течение 1 часа для образования сгустков, после чего их центрифугировали при 2000 × г в течение 15 минут. Примерно 0,5 мл супернатанта было тщательно собрано в виде сыворотки. Уровни сывороточной лактатдегидрогеназы (ЛДГ) были количественно определены с помощью теста D-лактатдегидрогеназы согласно протоколам производителя.
Протеомное профилирование и биоинформатический анализ
Количественный протеомный анализ был проведён на гладкомышечных тканях уретры, выделенных из модельных и терапевтических групп. Белки были идентифицированы по исходным данным масс-спектрометрии с помощью Proteome Discoverer 2.4 с порогом ложного обнаружения 1%. Биоинформатический анализ дифференцированно экспрессированных белков (ДЭП) проводился с использованием R-основанных пакетов: анализ дифференциальной экспрессии проводился с использованием пакета лимма (|log2FC| > 1, скорректированный p < 0,05), анализ обогащения генной онтологии (GO) и анализ путей Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG) с использованием пакета clusterProfiler, при этом обогащённые термины/пути считались значимыми при скорректированном p< 0,05 и q-значении < 0,2; Иерархическая кластеризация визуализировалась с помощью пакета PheatMap. Была построена сеть взаимодействия белков и белков (PPI) с использованием базы данных STRING (v11.5, доверительный балл > 0.7).
Окрашивание гематоксилин-эозином
Гладкомышечные ткани крыс фиксировались в 4% параформальдегиде и внедрены в парафин. Серийные срезы (толщиной 5 мкм) были подготовлены с помощью микротома и окрашивались с помощью стандартизированного набора для окрашивания H&E. Морфологическая оценка проводилась с использованием микроскопии с ярким полем при увеличении 40×–400× с акцентом на структурную целостность мышечной ткани, инфильтрацию воспалительных клеток и ремоделирование матрицы.
Трихромное окрашивание Массона
Согласно экспериментальному протоколу, одобренному этическим комитетом, мы собрали образцы у животных на десятый день лечения. Мышечные ткани крыс фиксировались в 4% параформальдегиде и парафинах. Серийные срезы (толщиной 5 мкм) были вырезаны с помощью вращающегося микротома. Депарафинизированные секции были покрыты трихромом Массона. Окрашенные срезы снимались под яркополевой микроскопом при увеличении 100×.
Вестерн блоттинг
Полные белки извлекались из гладкомышечной ткани крыс путём механического нарушения буфера лизиса RIPA, поддерживаемого при низкой температуре и дополненных ингибиторами протеаз. Лизаты были очищены центрифугированием при 10 000 × г в течение 15 минут при 4 °C, а белоксодержащий супернатант был собран для анализа. Концентрация белка была определена с помощью анализа на бицинхониновую кислоту (BCA) с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве калибровочного стандарта. Равные количества белка (30 мкг) загружались на гели SDS–полиакриламида с 10% или 12% и разделялись при восстановлении условий. После электрофореза белки переносились на мембраны PVDF размером поры 0,22 мкм. Мембраны инкубировали в 3% BSA в течение 1 часа при комнатной температуре для блокировки неспецифических сайтов связывания, затем ночной инкубации при 4 °C с первичными антителами, распознавающими GAPDH, MYL1, TNNI2, TNNT1, TNNT3 и MYLPF. После трёхкратного промывания с ТБСТ вторичные антитела с маркировкой HRP применялись в течение 2 часов при комнатной температуре. Обнаружение сигналов проводилось с использованием хемилюминесцентной подложки, а изображения — с помощью системы люминесцентной визуализации. Количественная оценка экспрессии белков проводилась с помощью денситометрического анализа, при этом GAPDH служил внутренним ориентиром.
Количественное ПЦР в реальном времени (qPCR)
Образцы тканей были лизированы с использованием реагента для экстракции полного РНК, а РНК выделены согласно инструкциям производителя, предоставленным в комплекте для экстракции РНК. Геноспецифические праймеры разрабатывались с использованием специализированного программного обеспечения (Таблица 1), а их специфичность проверялась с помощью анализа BLAST (гомология ≥18 bp, Tm = 58–62 °C). Затем РНК была обратна транскрипционирована с помощью комплекта обратной транскрипции, а экспрессия целевого гена была обнаружена с помощью комплекта для диагностики qPCR SYBR Green.
Статистический анализ
Статистические сравнения между двумя группами проводились с помощью t-теста независимых выборок, тогда как различия между несколькими группами оценивались с помощью одностороннего ANOVA с последующим пост-хок анализом Бонферрони. Данные выражаются как среднее ± стандартное отклонение (SD) или среднее ± стандартной ошибке среднего значения (SEM). Значение p < 0,05 считалось показателем статистической значимости.