Методическая статья

Выделение и очистка островков поджелудочной железы у крыс Льюиса с помощью ферментативного расщепления и разделения плотностно-градиентного разделения

DOI:

10.3791/70414

⸱

3 апреля 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for BioNanoengineering, Houston Methodist Research Institute, 2School of Medicine and Health Sciences, Tecnologico de Monterrey, 3Department of Applied Science and Technology, Politecnico di Torino, 4Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 5Department of Surgery, Houston Methodist Hospital, 6Department of Radiation Oncology, Houston Methodist Hospital

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает стандартизированный метод хирургического сбора, ферментативного пищеварения и плотно-градиентной очистки островков поджелудочной железы крыс Льюиса, что позволяет создавать высокоэффективные и чистые препараты для прямого использования при трансплантации или исследованиях in vitro .

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Поджелудочные островки необходимы как для клинической трансплантации островков, так и для доклинических исследований, направленных на понимание механизмов и прогрессирования диабета. Однако прогресс в этих областях часто ограничен доступностью высококачественных островков, поскольку новые терапевтические стратегии требуют более крупных, чистых и стандартизированных препаратов. В этой статье представлен высокопроизводительный, стандартизированный протокол хирургического извлечения, ферментативного переваривания и плотно-градиентной очистки островков поджелудочной железы у крыс Льюиса. Метод сочетает внутрипроточную перфузию поджелудочной железы с определённой смесью ферментов, объединённое переваривание нескольких поджелудочной железы и разделение по плотности для максимизации выхода при минимизации фрагментации и устранении необходимости рутинного ручного сбора. Урожайность островков количественно оценивается с помощью двух взаимодополняющих подходов: традиционного метода подсчёта на основе аликвотов, широко используемого в клинических условиях, и полуавтоматического метода полной подготовки на основе визуализации. В репрезентативной изоляции из 12 поджелудочной железы ручной подсчёт дал примерно 3 300 эквивалентов островков (IEQ) и 2 700 абсолютных островков на поджелудочную железу (~39 600 IEQ), с распределением размеров 62% (50-100 мкм), 17% (100-150 мкм), 10% (150-200 мкм), 5% (200-250 мкм) и 6% (>250 мкм). Для сравнения, автоматизированный анализ по всей подготовке показал 16 350 общих IEQ (1 362 IEQ/поджелудочную железу), что подчёркивает внутреннюю вариабельность количественной оценки на основе аликвот. Препараты имели чистоту 98% при окрашивании дитизона, а жизнеспособность островков сохранялась на уровне 98% in vitro на 3 и 7 дни после изоляции. Функциональная оценка с помощью статической секреции инсулина, стимулируемой глюкозой, показала 10-кратное увеличение высвобождения инсулина после 1-часовой стимуляции с глюкозой 16,7 мМ. В целом, этот протокол обеспечивает воспроизводимый и эффективный подход к получению высококачественных, функционально целых островческих препаратов, которые можно использовать сразу без дополнительной очистки. Островки сохраняют надёжную функцию в культуре до семи дней, что обеспечивает гибкость для проведения крупномасштабных in vitro тестов, а также исследований трансплантации in vivo .

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Трансплантация островков поджелудочной железы представляет собой жизнеспособную стратегию восстановления эндогенной выработки инсулина у людей с диабетом 1 типа (Т1Д)1. Помимо T1D, биология островков становится всё более актуальной для диабета 2 типа (T2D) — состояния, характеризующегося прогрессирующей дисфункцией и потерей β клеток, а также для пациентов, проходящих частичную или тотальную панкреатэктомию при хроническом панкреатите, опухолях поджелудочной железы или травматических повреждениях. В этих контекстах доступ к высококачественным островкам необходим для продвижения клеточной терапии, моделирования β-клеточной недостаточности, изучения взаимодействия иммунного и островочко-стромального взаимодействия, а также для разработки новых регенеративныхподходов 2. Следовательно, надёжные и воспроизводимые процедуры изоляции островков крайне важны для поддержки как механистических исследований, так и трансляционных разработок в широком спектре эндокринных заболеваний поджелудочной железы.

Хотя островки составляют менее 2% массы поджелудочной железы, они играют непропорционально значительную роль в гомеостазе глюкозы. Их внутренняя уязвимость к гипоксии, ферментативному переварению, окислительному стрессу и механическому сдвигу делает их особенно чувствительными к повреждениям, связанным с изоляцией 3,4,5. Даже незначительные отклонения в температуре, насыщении кислородом или работе с тканями могут нарушать связь β-клеток стимула и секреции или вызвать апоптоз из-за ограниченной антиоксидантной защиты и высокого метаболического спроса 6,7. В результате большинство традиционных протоколов делают акцент на быстром применении на последующих этапах, обычно в течение 24-48 часов после сбора урожая как в клинических, так и в экспериментальныхусловиях 8,9,10,11,12. Хотя эта система «немедленного использования» минимизирует разрушение, она ограничивает гибкость экспериментов, затрудняет продольные исследования и усложняет накопление достаточного количества островков для крупных in vitro тестов или экспериментов по трансплантации in vivo.

Среди моделей грызунов крысы Льюиса широко используются для исследований островков благодаря их инбридному генетическому фону, стабильному иммунному профилю и воспроизводимымфизиологическим характеристикам 14. Различия в выходе выхода, отзывчивости и устойчивости островков, зависящие от деформации, хорошо задокументированы. Де Грут и др. продемонстрировали, что крысиные островки Льюиса обладают превосходной глюкозостимулированной секрецией инсулина по сравнению с другими штаммами, что подчёркивает их пригодность для функциональных, метаболических и трансплантационныхисследований 15. Дополнительные исследования подтвердили их надёжность для иммунологических и алло-/ксенотрансплантационныхисследований 14,15,16. Однако в разных лабораториях вариабельность выхода, чистоты и функции островков остаётся значительной преградой. Большая часть этой вариабельности связана с несоответствиями в смеси ферментов, методах внутрипроточной перфузии, обработке поджелудочной железы, времени пищеварения и стратегииочистки 17.

Для устранения этих ограничений мы разработали воспроизводимый, пошаговый протокол для хирургического сбора зубов, ферментативного пищеварения и плотно-градиентной очистки островков поджелудочной железы у крыс Льюиса. Этот рабочий процесс оптимизирован для максимизации выхода, минимизации фрагментации и сохранения функциональной жизнеспособности. Важно, что он устанавливает чёткие ориентиры, включая эквиваленты островков (IEQ), жизнеспособность со временем, чистоту и секрецию инсулина, стимулируемого глюкозой, что позволяет исследователям надёжно различать успешные и неоптимальныеизоляции 18,19,20. Повышая как урожайность, так и продолжительность, протокол повышает гибкость экспериментов и может сократить количество донорских животных, поддерживая более этичный и масштабируемый экспериментальный дизайн.

В отличие от многих традиционных методов, текущий метод демонстрирует, что крысиные островки Льюиса могут содержаться в культуре до 7 дней при сохранении жизнеспособности и функции, расширяя их полезность для длительных экстракорпоральных исследований. Протокол также включает оптимизированную, объединённую стратегию обработки, способную обрабатывать до 30 поджелудочной железы в одной партии, что обеспечивает равномерное переваривание и снижает изменчивость между выборками. При достигнутой эндокринной чистоты 98% процедура устраняет необходимость трудоёмкого ручного отбора и снижает вероятность микробного загрязнения. По сравнению с одноступенчатыми или массовыми методами пищеварения, которые часто приводят к нечистым или механически поврежденнымпрепаратам 13, этот высокопроизводительный рабочий процесс надёжно даёт большое количество чистых, трансплантационных островков, подходящих для in vitro тестов, метаболического профилирования и исследований трансплантации in vivo .

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Хьюстонского методистского института (IACUC, протокол #IS00007362) и проведены в соответствии с Руководством Национального института здоровья по уходу и использованию лабораторных животных и Законом о благополучии животных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Материалы и инструменты, используемые в протоколе, представлены в Таблице материалов.

1. Подготовка перед уборкой и день изоляции

  1. Подготовьте следующие растворы в асептических условиях внутри шкафа для биобезопасности (см. таблицу 1) и храните все растворы при 4 °C до использования.
    Раствор промывания пенициллина и стрептомицина (Pen-Strep).
    Средство для стирки.
    Буфер для закалки.
    Медиа культуры островков.
    Буфер Кребса.
  2. Стерилизуйте инструменты и оборудование с помощью автоклава.
    1. Хирургический пакет для извлечения поджелудочной железы из автоклава: хирургические шторы, марля, щипцы из зуба крысы, плоские щипцы, тонкие изогнутые щипцы, один ножницы для кожи, ножницы для микропрепарирования, два маленьких гемостата и один изогнутый гемостат.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если будет два хирургических оператора, автоклав для двух хирургических пакетов поджелудочной железы.
    2. Хирургический пакет для очистки поджелудочной железы для автоклава: тонкие изогнутые щипцы и микродиссектирующие ножницы.
    3. Автоклав один лист алюминиевой фольги размером 30 см x 30 см.
    4. Автоклав 1-6 стаканов объёмом 600 мл и 1 л в зависимости от количества поджелудочной железы (см. таблицу 2).
    5. Автоклав — одно сито 500 мкм.
    6. Автоклав — две иглы по 14 G, на случай закупорки одной из них непереваренной тканью поджелудочной железы.
    7. Автоклав — одна трубка для шприца на каждый необходимый 50 мл (см. Таблицу 3).
  3. Подготовьте водяную баню для пищеварения.
    1. Наполните водяную ванну, оснащённую орбитальным шейкером, автоклавированной ультрачистой водой, пока она не окажется на 3/4 дюйма выше уровня платформы.
    2. Добавьте 3 мл антимикробного раствора и держите крышку закрытой, чтобы минимизировать загрязнение.

2. Подготовка к дню сбора урожая и изоляции

  1. Подготовьте градиентные шприцы.
    1. Удалите растворы градиентов островков 1,108 г/см³, 1,096 г/см³ и 1,069 г/см³, подготовленные и использованные на следующих этапах и на этапе 5.2 «очистки островков», из хранения при 4 °C, и дайте им уравновеситься до комнатной температуры (около 1 часа).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Требуемый объём градиента будет зависеть от количества поджелудочной железы, которые подлежат обработке; см. Таблицу 3 , чтобы обеспечить достаточное количество оттаявшихся объёмов отдельных градиентов.
    2. Предварительно загрузите и маркируйте 50 мл шприцев градиентами 1,096 г/см³ и 1,069 г/см³.
      1. Интенсивно смешивайте растворы с градиентами плотности 1,069 и 1,096 г/см³.
      2. Загрузите соответствующие объёмы, в зависимости от таблицы 3, в шприцы объемом 50 мл с хирургической трубкой и иглой на 16 G.
      3. После заполнения закрой иглы для поддержания стерильности и отложите шприцы для последующего использования на этапе 5.5 «Очистка островков».
    3. Держите градиент 1,108 г/см 3 при комнатной температуре до последующего использования.
  2. Сделайте раствор фермента Working Dissociation Media (WDM), загрузите их в шприцы для перфузии и автоклавные стаканы.
    1. Работайте в стерильных условиях в шкафу для биобезопасности и храните все растворы на льду.
    2. Разморозить аликвоты коллагеназы, термолизина и ДНКазы I на льду.
    3. Разбавлять ферментные реагенты в стерильном стакане объёмом 1 л с использованием WDM для достижения следующих конечных концентраций: коллагеназ 0,15 мг/мл, термолизин 5 мкг/мл и ДНКаза I 0,1 мг/мл (Таблица 2).
    4. Аккуратно смешивайте WDM, используя вихревое движение 10 раз. Не смешивайте с пипеткой; Сохраняйте активность фермента, аккуратно закручивая их.
    5. По одному заполняйте 10 мл раствора фермента WDM в каждый шприц объёмом 10 мл с помощью игли 16 г для быстрого наполнения, затем заменяйте на иглу с крышкой 25 G X 1/2" дюйма для последующего перфузии поджелудочной железы.
    6. Оберните загруженные шприцы автоклавной алюминиевой фольгой и положите на лёд до использования.
    7. Избыточное количество WDM равномерно разпределяется в стерильные стаканы по 600 мл для хранения собранных поджелудочных средств согласно Таблице 2. Накройте каждую стакан стерильной алюминиевой фольгой и держите её на льду (Таблица 2).
  3. Подготовьте рабочее пространство для культуры клеток.
    1. Включите орбитальный водяной шейкер, установите на 130 об/мин и 37 °C. Оставляйте в таком состоянии во время сбора поджелудочной железы.
    2. Поместите следующие предметы под ультрафиолетовое освещение в шкаф с биобезопасностью на 1 час для дальнейшей стерилизации.
      Стерильное сито 500 мкм.
      Стерильная стакан на 1 литр.
      Шприцовый насос.
    3. Убедитесь, что инкубатор клеточной культуры установлен на 25 °C 5%CO2.
    4. Установите центрифугу на 4 °C с ускорением и замедлением на 9.
  4. Соберите материалы для сбора и направляйтесь в операционную.
    1. Назначенный очиститель поджелудочной железы:
      1. Соберите одно большое ведро для льда, чтобы вместить необходимое количество стаканов WDM на 600 мл и раствор для промывания поджелудочной железы (см. таблицу 1 и 2).
      2. Соберите 1 стерильную чашку Петри на каждые 6 поджелудочной загоренки для обработки.
      3. Соберите 1 стерильные ножницы для микропрепарирования и 2 маленьких изогнутых хрупких щипца.
    2. Назначенный сборщик поджелудочной железы:
      1. Соберите стерильную хирургическую упаковку.
      2. Соберите стерильные хирургические перчатки.
      3. Соберите лоток для льда с заранее загруженными 10 мл WDM-шприцами, запечатанными автоклавной алюминиевой фольгой.
  5. В операционной подготовьте станцию для удаления поджелудочной железы.
    1. Включите стеклянный бусинный стерилизатор для стерилизации хирургических инструментов, погрузив их в стерилизатор на 1 минуту между животными. Приборы могут быстро охлаждаться при погружении в стерильную 1x PBS.
    2. Поместите впитывающую прокладку под поле зрения микроскопа на наличие крови или утечки раствора фермента WDM.
    3. Установите для микроскопа общее увеличение 6,3x между линзами зрения зрения и объектива.
    4. Откройте хирургический пакет и наденьте стерильные хирургические перчатки с помощью асептической техники.
    5. Приступайте к хирургическому забору.
  6. В операционной подготовьте станцию очистки поджелудочной железы.
    1. Залить достаточно раствора Pen-Strep, чтобы заполнить половину чашки Петри диаметром 100 мм (около 6 мл), чтобы погрузить изолированные поджелудочные завершки и положить на лёд.
    2. Откройте хирургический пакет и наденьте стерильные хирургические перчатки с помощью асептической техники.
  7. В операционной подготовьте камеру эвтаназии.
    1. Поставьте резервуарные лотки в пустую, чистую и повторно герметизируемую крысиную клетку.
    2. Наполните лотки наполовину изофлураном.
    3. Поставьте перфорированный лоток сверху резервуаров, чтобы предотвратить пролив при размещении крыс внутри.
    4. Запечатайте верхнюю часть камеры крышкой клетки.
  8. Переходите к сбору поджелудочной железы.

3. Сбор поджелудочной железы

  1. Помещайте крыс по одной в камеру эвтаназии на верх лотка для быстрой передозировки изофлураном.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время эвтаназии, необходимое крысе, будет варьироваться, особенно когда изофлуран испаряется.
  2. Подтвердите отсутствие пульса и дыхания у каждой крысы.
  3. Подтверждайте эвтаназию с помощью вторичного метода, который не нарушает брюшную полость (например, сердечная пункция).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Другие первичные методы эвтаназии допустимы; Однако предпочтительнее передозировка изофлурана, так как быстрая эвтаназия минимизирует гипоксию островков.
  4. Опрыскивайте брюшную шерсть каждой крысы 70% этанолом, чтобы скрыться и предотвратить появление шерсти в хирургическом поле.
  5. Поместите эвтаназианную крысу на спине под микроскоп с головой, расположенной вдали от оператора. Убедитесь, что верхняя брюшная полость находится под полем зрения микроскопа.

Рисунок 1
Рисунок 1: Хирургическое воздействие и интрадуктальная перфузия поджелудочной железы крысы. Иллюстрация ключевых этапов экспонирования и проникновения поджелудочной железы через сфинктер Одди. (A) Усыпленная крыса Льюиса с открытой брюшной полостью. (Аа) Размещение зажимом общего желчного протока и печеночных вен. (B) Увеличенный вид двенадцатиперстной кишки с гемостатами, отмечающими область сфинктера Одди. (Bb) Игла для перфузии, расположенная внутри главного поджелудочного протока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

  1. Сбор поджелудочной железы (роль сборщика поджелудочной железы):
    1. Сделайте разрез в форме буквы «V», используя кожные ножницы, начиная от лобкового симфиза к каждой боковой рёбра, чтобы получить доступ к брюшной полости (см. рисунок 1A).
    2. Оттяните тонкую и толстую кишку к левой стороне животного с помощью плоских щипцов, чтобы очистить «рабочее пространство» брюшной полости.
    3. Разверните двенадцатиперстную кишку с помощью плоских щипцов и изогнутых гемостатов. Убедитесь, что общий желчный проток и печеночная портальная вена находятся в поле зрения микроскопа.
    4. Втяните головную часть печени и зажмите общий желчный проток и печеночную вену с помощью изогнутых гемостатов. Зажим на расстоянии 1–2 мм от печени (см. рисунок 1Aa).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 3.6.1-3.6.4 и 3.6.8 могут выполняться с помощью прямой визуализации. Используйте микроскоп для всех остальных этапов, чтобы обеспечить деликатную манипуляцию тканями.
    5. Под призором микроскопа, используя плоские щипцы и плоские гемостаты, аккуратно мобилизуйте содержимое двенадцатиперстной кишки, чтобы очистить сфинктер от Одди.
      ПРИМЕЧАНИЕ: убедитесь, что содержимое двенадцатиперстной кишки смещено с предполагаемого места введения иглы.
    6. Изолировать область вокруг сфинктера Одди, аккуратно зажав двенадцатиперстную кишку плоскими гемостатами примерно на 5 мм от каждой стороны сфинктера. Обеспечить минимальное сжатие для сохранения целостности тканей (см. рисунок 1B).
    7. Используя стерильный WDM-шприц, аккуратно введите иглу через двенадцатиперстную стенку, проведите её через сфинктер Одди и продвигайте в главный поджелудочный проток для перфузии (см . рисунок 1Bb).
      1. Как только игла проходит через сфинктер Одди, поддерживая постоянное давление, введите 7-10 мл WDM в поджелудочную железу со скоростью около 500 мкл/с, пока поджелудочная железа полностью не расширится.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что фаска поднята, а игла параллельна поджелудочной железе, чтобы минимизировать травму. Начинайте инъекции сразу после введения. Это поможет расширить сфинктер и проток, облегчая продвижение иглы. Поджелудочная железа считается полностью раздутой, когда хвост поджелудочной железы, расположенный рядом с селезёнкой, становится заметно перфузионным.
    8. Вырезать поджелудочную железу, аккуратно отделив её от окружающих структур в следующем порядке: селезёнка, желудок, толстая кишечница, двенадцатиперстная и брыжей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте тупую диссекция, чтобы минимизировать повреждение тканей. Действуйте последовательно, чтобы сохранить анатомическую ориентацию и снизить напряжение на сосудистых и протоках.
      1. Удалите оба плоских гемостата из двенадцатиперстной кишки.
      2. Используйте плоские щипцы, чтобы зажать спленопанкреатическую связку (соединяющую поджелудочную железу и селезёнку) и аккуратно натягивайте.
      3. С помощью тонко изогнутых диспартирующих щипцов аккуратно мобилизуйте и отделяйте поджелудочную железу от соседних селезёночных прикреплений.
      4. Отсоедините поджелудочную железу от желудка, поднимая ткань поджелудочной железы тонкими изогнутыми щипцами и мягко противотягивая плоскими щипцами.
      5. Затем, используя плоские щипцы, приложите плотное натяжение, чтобы вырвать толстую кишку из поджелудочной железы.
      6. Поднимите тонкий кишечник с помощью плоских щипцов и рассеките брыжейку из поджелудочной железы с помощью тонко изогнутых щипцов.
      7. Аккуратно поднимите перфузионную поджелудочную железу плоскими щипцами и используйте тонкие ножницы для препарирования, чтобы разрезать оставшиеся прикрепления к соединительной ткани.
    9. Немедленно переложите вырезанную поджелудочную железу в чашку Петри с ледяным раствором для промывания и немедленно приступите к сбору следующей поджелудочной железы, так как очиститель поджелудочной железы начинает её чистку.
  2. Очистка поджелудочной железы (роль очищающего поджелудочной железы):

Рисунок 2
Рисунок 2: Очистка перфузировавшейся поджелудочной железы крыс. Последовательная визуализация поджелудочной железы до и после удаления несущественной ткани. (A) Перфузия поджелудочной железы сразу после вскрытия, с видимыми прилегающими жировыми тканями, лимфатическими узлами и соединительными структурами. (B) Перфузионная поджелудочная железа с отмеченными основными анатомическими ориентирами. (C) Очищена поджелудочная железа после удаления избыточной ткани, показывая окончательный вид до пищеварения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

  1. Используйте тонкие изогнутые щипцы и тонкие ножницы для вскрытия лимфатических узлов, жировой ткани, брыжей и крупные сосудистые органы из перфузионной поджелудочной железы, если она присутствует (см. рисунок 2).
  2. Переложите очищенную поджелудочную железу в стерильную стакан объёмом 600 мл с 25 мл холодного WDM. Накройте стакан стерильной алюминиевой фольгой, чтобы сохранить чистоту между переносом из операционного рабочего места в рабочее место для клеточной культуры.
    1. Заменяйте раствор для ополаскивания в чашке Петри каждые 6 раз на поджелудочной железе, чтобы предотвратить загрязнение.
    2. Запишите время, когда первая поджелудочная железа помещается на лёд. Это будет использоваться для документирования времени холодной ишемии.
  1. После того как все поджелудочной железы будут приобретены и очищены, быстро переходите к стадии пищеварения в рабочей зоне клеточной культуры.

4. Пищеварение поджелудочной железы

  1. Приостановите обороты орбитального шейкера и закрепите покрытый стакан с поджелудочной железой в назначенных держателях водяной бани.
  2. Быстро перезапустите орбитальный шейкер, установленный на 130 об/мин, и запустите таймер на 10 минут для времени переваривания (см. рисунок 3A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Запишите этот момент как конец периода холодной ишемии. Записывайте каждый сбор урожая островков с соответствующим общим временем холодной ишемии в лабораторных записях.
  3. На отметке 5 минут ручно поверните стакан по часовой стрелке, затем против часовой стрелки, чтобы помочь тканевой диссоциации.
  4. Через 8 минут достать раствор для закалки из холодного хранилища и перенести его в шкаф биобезопасности для последующего немедленного использования (см. Таблицу 1).
  5. На отметке 10 минут быстро переносите и погружайте стаканы в лёд, чтобы замедлить активность ферментов (см. рисунок 3B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента обрабатывайте все ткани, клетки и растворы на льду, чтобы сохранить их до шага 4.20 при использовании градиентов плотности комнатной температуры.
  6. Перенесите снаружи стакана и лоток в шкаф для биобезопасности.
  7. Добавьте буфер для закалки в соотношении 1:1 с раствором в стакане, чтобы остановить пищеварение (примерно 75-100 мл на стакан).
  8. Аспирируйте и выведите тканевую суспензию аккуратно и многократно с помощью шприца объемом 50 мл с иглой 14 G для удаления крупных фрагментов ткани (см. рисунок 3C).
  9. Перенесите подвеску на конические трубки объёмом 200 мл.
  10. Прополосните стакан 5 мл стирального средства и декантуйте в коническую трубку объёмом 200 мл с островочным диджестом, чтобы собрать остатки диджеста.
  11. Центрифуга переваривает при 200 × г в течение 5 минут при 4 °C. Обязательно используйте подходящие адаптеры и подушки для центрифуг для обеспечения безопасности.
  12. Аккуратно декантуйте супернатант и заново суспензуйте гранулу в 100 мл стирального материала, используя ту же иглу на 14 G, что и раньше.
  13. Фильтруйте суспензию через стерильное сито диаметром 500 мкм, установленное над стерильной стаканом на 600 мл, чтобы удалить крупную, непереваренную ткань.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если перфузия и очистка поджелудочной железы были выполнены оптимально, на решетке не останется минимальное количество жировой ткани и не будет неперфузионной поджелудочной железы.
  14. Прополосните решето 10 мл стирального материала, чтобы восстановить застрянутую ткань.
  15. Перенесите фильтрат в новые конические трубки объёмом 200 мл.
  16. Центрифуга при 200 × г в течение 5 минут при 4 °C.
  17. Декантуйте супернатант и повторно подвешивайте гранулу в промывке объёмом 100 мл с помощью серологической пипетки объемом 10 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте минимальную потерю клеток, предварительно смачивая кончики пипеток буфером с FBS, перед контактом с островками.
  18. Центрифуга при 600 × г в течение 5 минут при 4 °C.
  19. Аккуратно аспирируйте супернатант, чтобы получить сухую гранулу.
  20. Установите температуру центрифуги на 22 °C в подготовке к градиентному разделению.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это можно ускорить, запустив центрифугу при 2000 x g в течение 15 минут при 22 °C, без отбора образцов.

5. Очищение островков

  1. См. таблицу 3 , чтобы определить количество необходимых конических трубок объёмом 50 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к таблице 3 , чтобы равномерно распределить общий объём гранул, обеспечивая распределение примерно 2-3 мл пеллетного дигеста на каждую градиентную трубку. Если позже наблюдается слабое разделение полос островков, используйте дополнительные градиентные трубки для повышения разрешения разделения.
  2. Предварительно увлажните серологический наконечник пипетки объёмом 10 мл раствором градиента плотности 1,108 г/см³, чтобы предотвратить прилипывание островков к внутренней поверхности кончика.
  3. Суспензировать каждую тканевую гранулу в 15 мл раствора градиента 1,108 г/см³ на 2 мл объёма гранул, используя предварительно увлажнённую серологическую пипетку объёмом 10 мл. Несмотря на то, что общий объём превышает 10 мл, меньшая ширина пипетки способствует более контролируемому смешиванию и эффективному удалению гранул. Аккуратно перемешивайте до однородной формы.
  4. Аккуратно вводите 15 мл суспензии ячейки в дно каждой конической трубки объёмом 50 мл, избегая контакта со стенками трубки для обеспечения чистого градиента.
  5. Используя заранее загруженные градиентные шприцы, последовательно наложите 10 мл градиента 1,096 г/см³, затем 10 мл градиента 1,069 г/см³.
  6. Каждый градиент подаёт со скоростью 5 мл/мин с помощью насоса шприца, размещая кончик иглы 16 G у внутренней стенки трубки, чтобы предотвратить градиентное смешивание.
  7. Центрифугуйте трубки при 700 × г на 15 минут при 22 °C, при этом ускорение центрифуги установлено на 3 и замедление на 0, чтобы предотвратить градиентное смешивание.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая длительное время замедления, весь цикл центрифугации занимает примерно 45 минут. Внимательно следите за временем, так как островки необходимо собирать своевременно, чтобы предотвратить градиентное смешивание и возможное повреждение клеток. Если нужно, подготовьте противовесные трубки по весу, а не по объёму, чтобы учесть разницу плотности. После снятия ламп сбросьте центрифугу на 4 °C, а ускорение и замедление — на 9 для будущих шагов.
  8. После центрифугирования определите слой островка, расположенный на границах между градиентными слоями 1,069-1,096 г/см³ и 1,096-108 г/см³ (см . рисунок 3D).
  9. Аспирируйте и аккуратно сбросьте всю ткань, собранную в верхнем слое, с помощью пипетки Pasteur, предварительно смаченной средством для стирки.
  10. Намочите ещё одну пипетку Пастера, соберите слой островка и переложите его в предварительно охлаждённую коническую трубку объёмом 200 мл с 5 мл стирального материала.
  11. Поднимите объём предварительно охлаждённой конической трубки объёмом 200 мл до 200 мл с помощью стирального материала.
  12. Центрифугу при 600 × г в течение 5 минут и декантировать супернатант.
  13. Суспензируйте гранулы в 30 мл стирального материала с помощью предварительно увлажнённого серологического наконечника объемом 10 мл.
  14. Перенесите ресуспензию в новую коническую трубку объёмом 50 мл с использованием предварительно увлажнённого серологического наконечника на 10 мл для лучшего гранулирования островков.
  15. Промыйте ту же коническую трубку объёмом 200 мл с 20 мл стирального средства и переведите в коническую трубку объёмом 50 мл, содержащую оставшиеся островки.
  16. Центрифугуйте коническую форму объёмом 50 мл с островками и средством для промывания при 300 × г в течение 5 минут при 4 °C.
  17. Декантуйте наверхнюю часть и снова суспензуйте гранулу островка в 50 мл среды культуры островков (см. таблицу 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При подсчете островков ручным методом количественной оценки удалите 100 мкл аликвотов.
  18. Равномерно размещайте островки в 100-мм чашках Петри, не обработанные тканями, используя одну тарелку на каждые пять обработанных поджелудочной железы крыс Льюиса.
    1. Вычислите общий объём островчатого среды по формуле (количество поджелудочной ÷ 5 × 10 мл).
    2. Повторно подвесьте гранулу островка в половине рассчитанного объёма среды, затем равномерно распределите подвеску по определённому числу пластин.
    3. Ополосните коническую трубку объемом 50 мл с остатками островков оставшейся половиной рассчитанного материала и промите её пипеткой по тем же пластинам, чтобы получить итоговый объём 10 мл на одну тарелку (см. рисунок 3E).
  19. Инкубировать на ночь при 25 °C при 5% CO₂. Каждые 24 часа добавляйте 3 мл среды для культуры островков в сторону каждой чашки Петри, а затем аккуратно перемешивайте, чтобы восполнить материал.
  20. Переходите к подсчёту островков (шаг 6).

Рисунок 3
Рисунок 3: Пищеварение поджелудочной железы и очистка изолированных островков. Репрезентативные изображения последовательных этапов от пищеварения поджелудочной железы в объединённых группах до очистки островков. (A) Сгруппированные перфузионные поджелудочной железы перед ферментативным пищеварением. (B) Фрагментированная поджелудочная железа после ферментативного пищеварения. (C) Равномерная суспензия тканей, постмеханический. (D) Плотно-градиентные трубки до центрифугирования (слева) и после центрифугирования (справа), с видимой полосой островков на границе градиента, обведённой кругом. (E) Изображение островков Дня 0 в Brightfield сразу после сбора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

6. Подсчёт островков

  1. Собирайте ручную количественную оценку островков.
    1. На шаге 5.16 извлекайте три аликвота по 100 мкл из подвески островка, используя пипетку на 200 мкл и обычные наконечники 200 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что островки равномерно подвешены в среде с помощью пипетки при взятии аликвот для измерения.
    2. Переместите каждый аликвот в отдельную решётчатую чашку Петри размером 2 мм × 2 мм, содержащую 1 мл 1× PBS.
    3. Подсчёт островков под перевёрнутым микроскопом, каталогизируя их по диаметру с помощью вставки прицельной линзы окуляра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не все островки будут круглыми; на протяжении всего подсчёта придерживайтесь либо горизонтальных, либо вертикальных измерений.
    4. Вычислите общее количество эквивалентов островков размером 150 мкм с помощью стандартизированной таблицы преобразования (см. таблицу 4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сравните IEQ каждого образца. Если IEQ аликвотов отличается более чем на 30%, следует использовать среднее по наиболее похожим аликвотам.

7. Меры безопасности

  1. Выполняйте все хирургические и тканевые процедуры в асептических условиях внутри биозащитного шкафа, когда это необходимо. Используйте средства индивидуальной защиты (СИЗ), включая защитные очки, лабораторные халаты, перчатки и хирургические маски, при обращении с реагентами и салфетками.
  2. Проводите удаление поджелудочной железы в стерильных условиях с использованием соответствующих хирургических инструментов и СИЗ. Обращайтесь с изофлураном и другими анестетиками в соответствии с рекомендациями учреждения для предотвращения воздействия вдыхания.
  3. Утилизировать ткани животных, острые изделия и биологические отходы в соответствии с институциональными протоколами биобезопасности. Хранить ферментативные реагенты и биологические материалы на льду, если не указано иное, чтобы сохранить активность и жизнеспособность.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Следующие результаты представляют собой типичную изоляцию островков, выполненную с использованием описанного метода, с параллельной обработкой двенадцати поджелудочной железы крыс Льюиса.

Урожайность и распределение размеров

Ручной подсчёт аликвотов и преобразование IEQ

Два независимых аликвота по 100 мкл были получены из смешанной суспензии островков, как описано в разделе «Подсчёт островков», шаг 6.1, и подсчитаны по диаметрам (50-100 мкм, 100-150 мкм, 150-200 мкм, 200-250 мкм, 250-300 мкм, 250-300 мкм). Счёты преобразовывались в эквиваленты островков (IEQ; 150 мкм эталон) с использованием стандартных таблиц эквивалентности и экстраполированы на общий объём подвески (см. рисунок 4A). По тестовой изоляции (n = 12) выход составлял 3330 IEQ/поджелудочную железу с медианным диаметром островка в бинке 50-100 мкм. Репликационные аликвоты согласованы на 18,8% на бин (коэффициент вариации), что указывает на умеренную вариацию, но ожидаемую при использовании методов ручного подсчёта. За предыдущие 14 изоляций островков этот метод дал в среднем 1353 (SD 607) IEQ/поджелудочную железу.

Автоматизированная оценка целых пластин

Для оценки ручного IEQ изображения яркого поля были получены на уровне D1 с помощью микроскопа и сшиты для создания композитов целой антенны (4× объектив; экспозиция 1/100 с). Автоматизированные размеры и квантификация объектов выполнялись с использованием фиджийского языка и кодирования с заранее определённым порогом размера 50-600 мкм. Изображения сначала были предварительно обработаны для уменьшения вариаций фона и повышения равномерности контраста. Структуры островков были выявлены на основе различий интенсивности относительно окружающей ткани, что приводило к созданию бинарных масок объектов. Соседние или частично соприкасающиеся островки были разделены, чтобы избежать недооценки номера объекта. Объекты за пределами указанного размерного диапазона были исключены для удаления мусора и неостровчатых тканей. Для каждого сохранившегося объекта извлекались морфометрические параметры, включая площадь и диаметры осей x и y. Затем островки были разделены по диаметру, а IEQ вычислялся путём умножения количества островков в каждом бине размера на соответствующий коэффициент преобразования. Автоматизированное измерение дало 98 832 объекта со средним диаметром осей x и y соответственно 117 мкм и 116 мкм и оценочным общим IEQ 16 350 IEQ, что сильно коррелировало с ручным IEQ, измеренным в D0 (Спирман r = 0,937, p = 0,0048; см. рисунок 4A-C).

Линяние ячеек островка

Изображения всей пластины были получены через 2 часа после очистки и снова в первый день (D1), используя ту же методологию в «Автоматизированной квантификации целой пластины» для оценки ранней стабилизации островков («выпадения»). Количество объектов изменилось на 0,9%, а IEQ — на -6,11% с 2 часа до D1 (см. рисунок 4D). Парное сравнение диаметров островков между D0 и D1 показало статистически значимое медианное уменьшение на 2 мкм (тест Уилкоксона со знакомым рангом, p = 0,0136, n = 2820). Однако малый масштаб этого изменения вряд ли будет иметь биологическое или клиническое значение.

Рисунок 4
Рисунок 4: Количественная оценка распределения размеров островков, корреляции и раннего выпадения. Графическое резюме измерений островков, полученных с помощью ручного и автоматизированного анализа. (A) Распределение размеров островков в день 0 (D0) на основе ручной количественной оценки в стандартизированных IEQ-контейнерах, эквивалентных островкам. (B) Распределение размеров островков в день 1 (D1), определяемое автоматизированными измерениями на основе изображений в тех же стандартизированных бинах размеров IEQ. (C) Корреляция подсчёта между ручной D0 и автоматизированной количественной оценкой D1 в контейнерах размера IEQ. (D) Коробчатый график распределения диаметров островков между D0 и D1 для автоматизированных измерений одной и той же пластины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Чистота (содержание эндокринного и экзокрина)

Окрашивание дитизоном (DTZ)

На D1 аликвот островков (n = 451) был окрашён DTZ в течение 30 с при комнатной температуре и сразу же сфотографирован с помощью яркой микроскопии (4× объектив; экспозиция 1/20 с). На Фиджи фоновые пиксели удалялись так, что оставшаяся площадь пикселей соответствовала общей площади островка. DTZ-отрицательные экзокринные области ткани, выявленные по более тёмному цветовому контрасту, выбирались вручную с помощью инструмента лассо, а область каждой интересующей области автоматически записывалась в пикселях. Эндокринная чистота рассчитывалась как процент DTZ-положительных пикселей относительно общего числа пикселей островков, давая чистоту 98,56 ± 0,38% (рисунок 5A).

Жизнеспособность и функциональная производительность

Глюкозостимулированная секреция инсулина (GSIS)

В каждой точке времени (D1, D3, D7) вручную отбирались 15 островков по размеру, которые помещались в отдельные колодцы пластины на 24 лунки, подготовленные в четырёхкратных пластинах. Островки инкубировали при 37 °C 5%CO2 в буфере Кребса по протоколу стимуляции глюкозы с низким уровнем и высоким и низким уровнем глюкозы: сначала при низкой глюкозе (2,8 мМ, 60 мин), затем при высокой глюкозе (16,7 мМ, 60 мин, см. Таблицу 1). Фракции сточных вод собирались в конце каждого инкубационного периода, а концентрации инсулина количественно определялись с помощью теста инсулина на ИФА у крыс. Индексы стимуляции рассчитывались как отношение секреции инсулина при условиях высокого и низкого уровня глюкозы. Индексы стимуляции составляли 9,37, 8,34 и 6,7 на 1, 3 и 7 дни соответственно, без значимых различий (см. рисунок 5B).

Живые/мёртвые пятна

В D1, D3 и D7 15 островков были отобраны вручную и окрашены набором для жизнеспособности Live/Dead согласно инструкциям производителя. Кратко время островки инкубировали в растворе окрашивания Live/Dead в течение 30 минут при 25 °C, затем снимали под последовательными микроскопическими настройками для обеспечения сопоставимости между временными точками (4X объектив; экспозиция 1/30 с, Texas Red и GFP-фильтры). Жизнеспособность была количественно измерена с помощью скрипта на Python с использованием scikit-image для сегментации островков и измерения флуоресценции. Островки были идентифицированы путём объединения зелёных и красных флуоресцентных каналов, применения метода порога Ли для создания двойной маски и использования сегментации водосборов для разделения соприкасающихся островков. Объекты фильтровались по площади, чтобы исключить мусор и артефакты. Для каждого островка жизнеспособность рассчитывалась как процент живой интегрированной плотности (зелёные пиксели) относительно общей интегрированной плотности (зелёные плюс красные пиксели). Результаты показали жизнеспособность 68 ± 9% при D1, 98,2 ± 0,6% при D3 и 100% при D7. Положительный контрольный образец, обработанный 70% этанолом в течение 10 минут, показал жизнеспособность 2,7 ± 7,2% (см. рисунок 5C-F).

Рисунок 5
Рисунок 5: Оценка чистоты, жизнеспособности и функциональной реакции островков. Репрезентативные изображения и количественные резюме характеристик изолированных островков со временем. (A) Репрезентативное изображение 10× яркого поля островков, окрашенных дитизоном (DTZ), показывающее эндокринные островки с красным окрашением и неокрашенную экзокриновую ткань. (B) Значения глюкозостимулируемой секреции инсулина (GSIS) индекса стимуляции высокого и низкого уровня глюкозы (HG/LG) за 1, 3 и 7 дни. (C-E) Живые/мёртвые флуоресцентные изображения островков на день 1 (C), день 3 (D) и день 7 (E). (F) Живое/мёртвое флуоресцентное изображение островков с положительным контролем, обработанное этанолом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

(A) Стиральные средства
КомпонентИтоговая концентрацияКоличество (мл)
RPMI 1640-500 мл
Сыворотка плода для быка10%50 мл
Пенстрептококк (10 000 U/мл)1%5,5 мл
HEPES25 мМ12,5 мл из 1М запаса
L-глутамин2 мМ5 мл из 200 мМ запаса
(B) Islet Culture Media
КомпонентИтоговая концентрацияКоличество (мл или г)
RPMI 1640, без глюкозы-500 мл
Сыворотка плода для быка10%50 мл
Пенстрептококк (10 000 U/мл)1%5,5 мл
HEPES20 мМ11 мл из 1М запаса
Пируват натрия1 мМ5,5 мл из запаса 100 мл
Глюкоза5,5 мМ2,75 мл из приклада 200 г/л
(C) Раствор для промывания пенициллина и стрептомицина
КомпонентИтоговая концентрацияКоличество (мл или г)
Солевый раствор, 0,9%-500 мл
Пенициллин стрептомицин (10 000 U/мл)2%10 мл
(D) Затухающий буфер
КомпонентИтоговая концентрацияКоличество (мл или г)
HBSS-500 мл
Сыворотка плода для быка20%100 мл
HEPES (1 М)2.50%2,5 мл
(E) Буфер Кребса
КомпонентИтоговая концентрацияКоличество (мл или г)
dH 2O-975 мл
NaCl115 мМ6,72 г
NaHCO324 мМ2,02 г
KCl5 мМ0,3728 г
HEPES (1 М)25 мМ25 мл
MgCl21 мМ0,0952 г
BSA0.10%1 г
CaCl22,5 мМ0,2775 г

Таблица 1: Список решений. Состав и детали подготовки всех растворов, используемых в протоколе изоляции и очистки островка. В каждом подразделе перечислены компоненты, итоговые концентрации, объёмы подготовки и номера каталога. (A) Средство для мытья, используемое для промывания и мытья тканей во время пищеварения и очистки. (B) Среда для культуры островков, используемая для поддержания и жизнеспособности островков после изоляции. (C) Раствор для промывания пенициллина и стрептомицина, используемый для стерилизации и промывания собранной поджелудочной железы. (D) Буфер для закалки, используемый для прекращения ферментативного переваривания и сохранения жизнеспособности клеток. (E) Буфер Кребса, используемый при анализах секреции инсулина, стимулируемого глюкозой (GSIS).

Количество поджелудочной железыКоллагеназа (15,38 мг/мл)Термолизин (1 мг/мл)ДНКза (100 мг/мл)Рабочий буфер600 мл стаканов для использованияОбъём/Стакан
304,5 мл2,25 мл450 мкл450 мл525 мл
243,6 мл1,8 мл360 мкл360 мл425 мл
203 мл1,5 мл300 мкл300 мл325 мл
162,4 мл1,2 мл240 мкл240 мл225 мл
121,8 мл0,9 мл180 мкл180 мл225 мл
101,5 мл0,75 мл150 мкл150 мл225 мл
Финальный конк.0,15 мг/мл5 мг/мл0,1 мг/мл

Таблица 2: Раствор пищеварительных ферментов по количеству поджелудочной железы.Объёмы коллагеназы, термолизина и ДНКазы I необходимы для подготовки рабочей диссоциационной среды (WDM) для различного количества поджелудочной железы крыс. Конечные концентрации каждого фермента приведены внизу таблицы.

Количество поджелудочной железыТрубки с номером 50 млОбъём/шприцКоличество 1 096 шприцевКоличество шприцев 1.068
3010 ламп50 мл22
248 ламп40 мл22
206 ламп30 мл22
164 лампы40 мл11
124 лампы40 мл11
102 лампы20 мл11

Таблица 3: Градиентная нагрузка по количеству поджелудочной железы.Количество конических трубок объёмом 50 мл и соответствующие градиентные объёмы, необходимые для очистки островков, в зависимости от количества обработанных поджелудочной железы.

Диапазон диаметра островков (мкм)Число частиц островков (ИИ)Коэффициент преобразования IEQIEQ на диапазон
50-100a* 0.167a * 0,167
101-150b* 0.648b * 0.648
151-200c* 1.685c * 1.685
201-250d* 3.500d * 3.500
251-300e* 6.315e * 6.315
301-350f* 10.352f * 10.352
> 350g* 15.833g * 15.833

Таблица 4: Преобразование эквивалентности островков. Преобразование диапазонов диаметров островков в стандартизированные эквиваленты островков (IEQ). В таблице перечислены наблюдаемые ямы диаметров островков, количество частиц островков в диапазоне, соответствующий коэффициент преобразования IEQ для каждого диапазона размеров и итоговый вклад IEQ на каждый диапазон.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает способ высокопроизводительного выделения и очистки поджелудочных островков от крыс Льюиса. Успех метода зависит от нескольких ключевых этапов, которые в совокупности сохраняют целостность и функционирование островков. Среди них — точная и полная внутрипроточечная перфузия поджелудочной железы, тщательная очистка перфузионной поджелудочной железы и точное время ферментативного пищеварения. Постоянная перфузия целого органа крайне важна для равномерного расширения поджелудочной железы и равномерного распределения смеси коллагеназы-термолизин-ДНКазы, которая соответственно расщепляет внеклеточный матрикс, усиливает проникновение ферментов и снижает вязкость, опосредованную ДНК21,22. Недостаточная перфузия может привести к неполному перевариванию тканей и потере значительной части островков, поскольку недостаточно переварённая ткань фильтруется с помощью сита. Аналогично, недостаточное удаление жировой или сосудистой ткани до пищеварения может привести к появлению неэндокринных примесей, снижающих чистоту. Наконец, продолжительное пищеварение приводит к десегрегации островков из-за чрезмерного разрушения внеклеточного матрикса, а неоптимальное пищеварение приводит к образованию неперевариваемой ткани, устойчивой к механическому перевариванию с помощью спинной игли. Эти шаги являются самыми частыми техническими подводными камнями и должны тщательно отслеживаться во время обучения и оптимизации.

Хотя этот метод был разработан специально для крыс Льюиса, его, вероятно, можно адаптировать к другим штаммам или видам путём незначительной реоптимизации времени пищеварения и соотношения ферментов 23,24,25,26. Некоторые лаборатории могут корректировать соотношение коллагеназы, термолизина и ДНКазы I в рабочей диссоциационной среде (WDM) для оптимизации выхода с учётом их специфических характеристик партии ферментов или ткани. Для этого лаборатории должны тщательно следовать пошаговому руководству производителя по оптимизации ферментов и тканей и во всех случаях избегать добавления таких компонентов, как 0,1 M EDTA, цистеин, меркаптоетанол, ингибиторы протеаз, сыворотка или альбумин, поскольку они могут ингибировать активность коллагеназы, термолизина и ферментаDNase 1 27. Хотя точные рабочие сроки для смеси ферментов до диссоциации не опубликованы, предыдущие данные показывают, что длительное холодное сохранение поджелудочной железы негативно влияет на выход и функциюостровков 28. Эмпирически мы обнаружили, что в нашем протоколе успешные изоляции стабильно достигались, когда общее время холодной ишемии, определяемое как интервал между положением первой поджелудочной железы на лёд для очистки и переносом её в водную ванну при температуре 37 °C, оставалось менее 1,5 часа. Дальнейшая оптимизация этого параметра может потребоваться в зависимости от конечного пользователя.

Несмотря на свою надёжность, этот протокол имеет ряд практических и технических ограничений. Во-первых, смесь ферментов (коллагеназа, термолизин и ДНКаза I) и градиенты плотности необходимы для эффективной диссоциации тканей и выделения островков, но при этом требуют значительных затрат. Наш выбор комбинации ферментов был обусловлен структурными особенностями внеклеточного матрикса поджелудочной железы и необходимостью балансировать эффективную диссоциацию тканей с сохранением целостности островков. Каждый ферментатический компонент выполняет свою особую роль: коллагеназа нацеливается на фибриллярные и базальные мембранные коллагены для освобождения островков; термолизин, нейтральная протеаза, расщепляет неколлагеновые матриксные белки и молекулы клеточно-клеточной адгезии, снижая необходимое воздействие коллагенази; а ДНКаза I минимизирует вязкость, вызванную ДНК, высвобождаемой из лизированныхклеток 29,30,31. Хотя доступны более дешёвые формулы пищеварительных ферментов, их чистота варьируется и может снижать ферментативнуюэффективность 13,23. Поскольку коллагеназу изолируют из бактериальных культур, дополнительные этапы очистки снижают загрязнение эндотоксинами, но значительно увеличивают стоимостьна 13,23.

Для коллагеназы мы рекомендуем препараты с активностью примерно 2000–4000 единиц Вюнша на бутылку, что поддерживает эффективную диссоциацию при умеренной дозировке и избегает длительного пищеварения. В частности, смесь должна включать сбалансированное соотношение коллагеназы класса I и класса II, соответствующее доле коллагеназы II/общая доля коллагеназы примерно 0,3-0,5. Это соотношение обеспечивает высокую коллагенолитическую активность, одновременно ограничивая чрезмерное разложение неколлагенового внеклеточного матрикса. Кроме того, смесь коллагеназы должна дополняться умеренным уровнем нейтральной активности протеазы (примерно 150 000–250 000 единиц) и ДНКазой, по уже упомянутым причинам.

С точки зрения контроля качества, каждая партия должна содержать документацию о низкой нагрузке эндотоксинов (≤50 EU/mg белка), высокой чистоте ферментов (≥85% по HPLC) и подтверждённой активности партии в партии, поскольку чистота и состав ферментов могут значительно различаться в зависимости от производителя. Наконец, вариации состава лота могут влиять на согласованность пищеварения и урожайность островков, что требует проведения специфической для лота внутренней валидации. Такую валидацию можно достичь, следуя стандартизированным условиям пищеварения, описанным в этом протоколе, а затем оценивая эффективность пищеварения и морфологию островков. Показатели неоптимальной эффективности ферментов включают неполную диссоциацию тканей, островки с неправильными или грубыми краями, а также необходимость чрезмерного механического сдвига для достижения разделения, в этом случае может потребоваться титрование времени пищеварения.

Похожие соображения применимы к градиентам плотности. Мы выбрали градиент на основе полисахарозы — неионный, высокогидрофильный сахароза-эпихлоргидриновый сополимер, который образует стабильные градиенты до 1,2 г/мл и имеет долгую историю в изоляцииостровков 32,33. Иодиксанол — хорошо проверенная альтернатива, и исследования на человеческих островках показывают, что градиенты на основе йодиксанола могут улучшать восстановление островков, сохраняя при этом жизнеспособность ифункцию 34,35,36,37. Однако данные по грызунам не дают однозначных результатов: некоторые исследования показывают лучшие результаты при использовании йодиксанола, а другие — лучшую жизнеспособность и функционирование с градиентами на основеполиссахарозы 32,35. Критически важно использовать коммерчески произведённые решения с контролируемым качеством градиентов для повышения воспроизводимости в лабораториях. Градиенты на основе полисахарозы широко доступны с оптимальной плотностью для выделения островков, тогда как градиенты йодиксанола обычно получают внутренним разбавлением, что добавляет дополнительную вариабельность. Второе ограничение заключается в том, что хирургическое извлечение требует высокого уровня технической подготовки, особенно для внутрипроточечной перфузии через сфинктер Одди и быстрого удаления поджелудочной железы. Даже незначительные задержки или смещение могут привести к повреждению тканей, протечкам, неравномерной перфузии или продолжительной тёплой ишемии, что может снизить урожайность и жизнеспособность островков. Чтобы смягчить это ограничение, протокол включает подробные процедурные описания и оригинальные графические средства с анатомическими ориентирами, выделенными цветом, для облегчения понимания. Новым операторам рекомендуется освоить технику перфузии до проведения полной изоляции, а также рекомендуется практика на тушах перед попыткой живого улова.

В-третьих, для максимальной эффективности этот протокол требует скоординированной командной работы. Во время извлечения поджелудочной железы и ферментативного пищеварения обычно требуются три обученных оператора: один выполняет стерильную операцию, другой очищает поджелудочную железу в стерильных условиях, а третий — циркулирующий и эвтаназирующий животных в нестерильных условиях. После переваривания последующие этапы очистки обычно выполняются меньшим количеством операторов после достижения квалификации. Хотя такая координация представляет собой первоначальную логистическую нагрузку, она позволяет изолировать множество островков от нескольких животных за относительно короткий срок, повышая общую пропускную способность по сравнению с менее скоординированными рабочими процессами. Хотя этот протокол технически требователен и требует ресурсов, эти ограничения общие для всех методов изоляции островков. Делая акцент на стандартизированных условиях пищеварения, структурированном обучении и скоординированном исполнении, этот высокопроизводительный подход позволяет сократить время и труд на одну изоляцию и дать последовательные, воспроизводимые результаты при выполнении обученной командой.

По сравнению с традиционными протоколами изоляции островков грызунов, этот метод обладает значительными преимуществами в пропускной способности, воспроизводимости и стабильности. Традиционные одноорганные диградации сильно зависят от ручного перебора и часто дают переменнуючистоту 13. В отличие от этого, наш протокол использует объединённое переваривание и плотно-градиентную очистку, что значительно сокращает время подготовки и вариабельность между выборками, сохраняя при этом высокую жизнеспособность островков и функциональную реакцию. Изолированные островки были всесторонне охарактеризованы по морфологии (дитизонное окрашивание), жизнеспособности (живой/мёртвый анализ) и функции (секреция инсулина, стимулируемого глюкозой), что подтверждало надёжность метода. В совокупности этот стандартизированный рабочий процесс позволяет создавать обильные, чистые и функциональные препараты для островков, подходящие для последующих приложений, включая инкапсуляцию, трансплантацию и микрофизиологическоемоделирование 38,39,40. Важно, что крысиные островки Льюиса, выделенные с помощью этой методики, обратили диабет обратно в доклинических моделях, что подчёркивает трансляционную значимость этого воспроизводимого и масштабируемогоподхода 41.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

А.Г. является соучредителем и главным научным советником Continuity Biosciences, LLC. A.G., J.P-M. и C.Y.X.C. являются изобретателями интеллектуальной собственности, лицензированной Continuity Biosciences, LLC. Все остальные авторы не заявляют о конкурирующих интересах.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Национальными институтами здоровья (NIH) R01DK133610-01 (A.G., N.K.) и NIH NIDDK R01DK132104 (A.G.), Breakthrough T1D SRA-2021-1078-S-B (AG) и SRA-2022-1224-S-B (A.G., N.K.), а также Фондом Вивиан Л. Смит.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
21 G x 2 дюйма. Игла BD PrecisionGlideBD305129
500 и микро; m латунная рама и экран из нержавеющей стали 304, диаметром 3" x глубиной 1" (решето номер 35)МакМастер-Карр34735K525
Стерильные шприцы Air-Tite, замок LuerFisher Scientific14-817-178
Biogel PI UltraTouch MMö Инликке42665
Боннские ножницы; Прямо; Острые кончики; длина лезвия — 15 мм; Общая длина 3 1/2"РобозRS-5840
Braintree Scientific GERMINATOR 500 СУХОЙ СТЕРИЛFisher ScientificNC9956482
Cell-IQ Series 5,8 куб. футов. Лабораторный инкубатор CO2PHCBIMCO-170AICUVHL-PA
Блюдо для культуры Corning 100 мм, не обработанное TCКорнинг430591
Корнингская сыворотка плода быка, 500 мл, обычная, проверена по безопасности USDA (инактивирована теплом)Корнинг35011CV
Градиент острова Корнинг 1,069 (плотность 1,069 г/см3)Корнинг99-815-CISТребуется особый запрос от компании
Градиент острова Корнинг 1,096 (плотность 1,096 г/см3)Корнинг99-691-CISТребуется особый запрос от компании
Градиент острова Корнинг 1,108 (плотность 1,108 г/см<суп>3)Корнинг99-692-CISТребуется особый запрос от компании
Подкладки Covidien TendersorbFisher Scientific22-225-102
DNase I степени IIРош10104159001
Falcon  Конические центрифугные трубки с высокой прозрачностью 50 млFisher Scientific14-432-22
Алюминиевая фольга Fisherbrand, рулон стандартной колеиFisher Scientific01-213-100
Fisherbrand  Нетканые марлевые губкиFisher Scientific22-028-559
Многоразовые стеклянные стаканы Fisherbrand для тяжёлых низкой формыFisher ScientificFB101600
Флуоресцентный мироскоп и bbsp; BZ-X810КейенсBZ-X810
Раствор глюкозыGibcoA2494001
Держатель для игл Halsey MicroТонкие научные инструменты12500-12
HBSS, кальций, магний, без фенол-красногоGibco14025092
HEPES (1 М)Gibco15630080
Гемостатические щипцы Classic Crile длиной 5-1/2 дюймаМакКессон1231217
Щипцы Гудзона (Эвальда)РобозRS-5238
Гиподермическая игла Monoject длиной 1-1/2 дюйма, 16 gauge, обычная стенка без предохранительностиМакКессон43481
L-глутамин (200 мМ)Gibco25030081
Либераза T-Flex, исследовательский классРош5989132001
Комплект для жизнеспособности/цитотоксичности LIVE/DEAD для клеток млекопитающихИнвитроген  L3224
Программный пакет MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/pricing-licensing.html?prodcode=ML
Двухканальный программируемый шприцовый насос NE-4000SyringePumpNE-4000-US
ИГЛА, HYPO STR DISP 27GX1/2"(100/BX) EXLINTМакКессон408877
Культура клеток Nunc/чашки ПетриThermo-Scientific174926
Микроскоп с инвертированным фазовым контрастом Olympus CKX41ОлимпCKX41-B
PBS, pH 7,4Gibco10010023
Пеницилляция Стрептомицин (10 000 U/мл)Gibco15140122
RPMI 1640Gibco11875093
RPMI 1640, без глюкозыGibco11879020
Пируват натрия (100 мм)Gibco11360070
Пируват натрия (запас 100 мм)Gibco11360070
Sorval ST 16RThermo-Scientific75004381
Игла для шприца из нержавеющей стали 304Милипор СигмаZ117013-1EA
ХИРУРГИЧЕСКАЯ ДРАПИРОВКА, ОДНОРАЗОВАЯ, 36 ДЮЙМОВ X 100 ЯРДОВКоветрус10408
Хирургические ножницы — ToughCutТонкие научные инструменты14054-13
Щипцы для перевязки большого пальца 4,5" с зубчатыми нежными тонкими кончиками ширины 1,3 ммРобозRS-8120
Центрифугная трубка Thermo Scientific Nunc объёмом 200 млThermo-Scientific14-962-17
Адаптеры и подушки для бутылок центрифуг Thermo Scientific NuncThermo-Scientific12-565-283B
TSDUB15 15-литровая встряхивающая ванна DubnoffFisher Scientific300610298
TX-400 4 x 400 мл поворотный роторThermo-Scientific75003181
Tygon S-50-HLТайгонAAXoooo3
Набор для инсулина ELISA для ультрачувствительных крысCrystal Chem90060

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grattoni, A., et al. Harnessing cellular therapeutics for type 1 diabetes mellitus: progress, challenges, and the road ahead. Nat Rev Endocrinol. 21 (1), 14-30 (2025).
  2. Páez-Mayorga, J., et al. Emerging strategies for β cell transplantation to treat type 1 diabetes mellitus. Cell Transplant. 31, 963689721004(2022).
  3. Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets and its relevance to β-cell function. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (7), 2334-2339 (2006).
  4. Brissova, M., et al. Pancreatic islet microvasculature and blood flow. J Clin Invest. 124 (4), 1871-1883 (2014).
  5. Jiang, F. X., Morahan, G. Pancreatic islet architecture and function. Cell Death Discov. 10, 170(2024).
  6. Sato, Y., et al. Hypoxia induces β-cell apoptosis and functional suppression in isolated islets. PLoS One. 9 (12), e114868(2014).
  7. Tiedge, M., Lortz, S., Drinkgern, J., Lenzen, S. Relation between antioxidant enzyme gene expression and antioxidative defense status of insulin-producing cells. Diabetes. 46 (11), 1733-1742 (1997).
  8. Ichii, H., et al. Shipment of human islets for transplantation. Am J Transplant. 7 (4), 1010-1020 (2007).
  9. Carobbio, S., et al. Rapid GSIS kinetics in freshly isolated mouse islets. Diabetologia. 47 (9), 1652-1662 (2004).
  10. Zawalich, W. S., Zawalich, K. C., Kelley, G. G. Immediate perifusion of fresh rat and mouse islets. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (2), E444-E450 (2008).
  11. Wassmer, C. H., et al. Clinical use of freshly isolated islets transplanted within 48 h. Transplant Proc. 53 (6), 1907-1912 (2021).
  12. Tai, D. S., et al. Immediate autotransplantation of islets following total pancreatectomy. JAMA Surg. 150 (5), 472-479 (2015).
  13. Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
  14. Emamaullee, J. A., et al. Lewis rats in transplantation studies. Diabetes. 65 (5), 1350-1359 (2016).
  15. de Groot, M., et al. Rat islet isolation yield and function are donor strain dependent. Lab Anim. 38 (2), 200-206 (2004).
  16. Moazenchi, A. M., et al. Strain variability in islet yield and isolation. Islets. 2 (5), 283-289 (2010).
  17. Dolenšek, J., Slak Rupnik, M., Stožer, A. Isolation variability limits reproducibility in rat islet studies. PLoS One. 14 (5), e0216136(2019).
  18. Stehno-Bittel, L. The flaws and future of islet volume measurements. Cell Transplant. 27 (4), 571-578 (2018).
  19. Kissler, H. J., et al. Validation of methodologies for quantifying isolated human islets. Cell Transplant. 18 (6), 611-620 (2009).
  20. Papas, K. K., et al. Islet assessment for transplantation. Cell Transplant. 18 (6), 519-528 (2009).
  21. Dono, K., et al. Low temperature collagenase digestion for islet isolation from 48-hour cold-preserved rat pancreas. Transplantation. 57 (1), 22-26 (1994).
  22. Shapiro, A. M. J., et al. High yield of rodent islets with intraductal collagenase distension and warm incubation. Cell Transplant. 5 (6), 631-638 (1996).
  23. Corbin, K. L., Hughes, J. W., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment revisited. Biol Proced Online. 23, 10(2021).
  24. de Haan, B. J., et al. Factors influencing isolation of functional pancreatic rat islets. Pancreas. 29 (1), e15-e22 (2004).
  25. Kenyon, N. S., et al. Long-term survival and function of intrahepatic islet allografts in baboons treated with humanized anti-CD154. Diabetes. 48 (7), 1473-1481 (1999).
  26. Kenyon, N. S., et al. Long-term survival and function of intrahepatic islet allografts in rhesus monkeys treated with humanized anti-CD154. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (14), 8132-8137 (1999).
  27. Liberase T-Flex Research Grade - Method Sheet. eLabDoc. , Roche Diagnostics GmbH. (2025).
  28. Miyazaki, Y., et al. Strategy towards tailored donor tissue-specific pancreatic islet isolation. PLoS One. 14 (5), e0216136(2019).
  29. Cross, S. E., et al. Key matrix proteins within the pancreatic islet basement membrane are differentially digested during human islet isolation. Am J Transplant. 17 (2), 451-461 (2017).
  30. O'Gorman, D., Kin, T., Pawlick, R., Imes, S., Senior, P. A., Shapiro, A. J. Clinical islet isolation outcomes with a highly purified neutral protease for pancreas dissociation. Islets. 5 (3), 111-115 (2013).
  31. Wang, W., et al. Adjustment of digestion enzyme composition improves islet isolation outcome from marginal grade human donor pancreata. Cell Tissue Bank. 8, 187-194 (2007).
  32. McCall, M. D., Maciver, A. H., Pawlick, R., Edgar, R., Shapiro, A. M. J. Histopaque provides optimal mouse islet purification kinetics: comparison study with Ficoll, iodixanol and dextran. Islets. 3 (4), 144-149 (2011).
  33. Ricordi, C., Lacy, P. E., Finke, E. H., Olack, B. J., Scharp, D. W. Automated method for isolation of human pancreatic islets. Diabetes. 37 (4), 413-420 (1988).
  34. BenchChem Technical Support Team. An in-depth technical guide to cell separation using iodixanol. BenchChem. , (2026).
  35. Dellê, H., Saito, M. H., Yoshimoto, P. M., Noronha, I. L. The use of iodixanol for the purification of rat pancreatic islets. Transplant Proc. 39 (2), 467-469 (2007).
  36. Noguchi, H., et al. Iodixanol-controlled density gradient during islet purification improves recovery rate in human islet isolation. Transplantation. 87 (11), 1629-1635 (2009).
  37. Min, T., et al. Superiority of Visipaque (iodixanol)-controlled density gradient over Ficoll-400 in adult porcine islet purification. Transplant Proc. 42 (5), 1825-1829 (2010).
  38. Paez-Mayorga, J., et al. Neovascularized implantable cell homing encapsulation platform with tunable local immunosuppressant delivery for allogeneic cell transplantation. Biomaterials. 257, 120232(2020).
  39. Paez-Mayorga, J., et al. Implantable niche with local immunosuppression for islet allotransplantation achieves type 1 diabetes reversal in rats. Nat Commun. 13, 7951(2022).
  40. Piemonti, L., et al. Islet transplantation. Endotext. , (2022).
  41. Patel, S. N., et al. The foundation for engineering a pancreatic islet niche. Front Endocrinol. 13, 881525(2022).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Lewis

Похожие статьи