Сравнение результатов анализа ДНК сперматозоидов с использованием различных стратегий выборки в проточной цитометрии

Summary

Многоугольное ворота (PGG) и крестовидно-ворота (CFG) - это методы проточной цитометрии для выявления целостности ДНК сперматозоидов. PGG измеряет индекс фрагментации ДНК (DFI) и индекс высокой окраски ДНК (HDS). CFG сообщает о тяжелом DFI, легком DFI и общем DFI. Данное исследование нацелено на сравнение результатов и корреляций между ними.

Abstract

Целостность ДНК спермы является ключевым фактором для обеспечения успешного оплодотворения, развития эмбриона и поддержания беременности. Оценка структуры хроматина спермы (SCSA) с использованием проточной цитометрии после денатурации ДНК и окрашивания акридиновым оранжевым считается методом «золотого стандарта» для оценки ДНК спермы. В литературе описаны две стратегии гейтинга для оценки индекса фрагментации ДНК спермы (DFI) с использованием проточной цитометрии–многоугольное гейтинг (PGG) и крестовидное гейтинг (CFG). Целью настоящего исследования было сравнение взаимоотношений результатов анализа между PGG и CFG, а также анализ их корреляции с параметрами базового анализа спермы. Данные, полученные независимо двумя методами, были сравнены с использованием статистического анализа, включая построение графиков Bland-Altman и регрессионный анализ. Всего 121 мужчина-пациент, проходящий оценку фертильности в репродуктивном центре нашей больницы, были отобраны с помощью метода полностью случайной выборки. DFI спермы и сопутствующие показатели анализировались с помощью проточной цитометрии с использованием PGG и CFG соответственно. Результаты показали, что значения DFI, полученные двумя методами, демонстрируют хорошее согласие. Коэффициенты корреляции между DFIp из метода PGG и DFIm, DFIs и DFIc из метода CFG составили 0,6497, 0,9404 и 0,9667 соответственно (все p < 0,01). Высокий индекс окрашивания ДНК (HDS) показал слабую отрицательную корреляцию с DFIs (r = -0,3042, p < 0,05). Процент прогрессирующих сперматозоидов был отрицательно коррелирован с DFIp, DFIs и DFIc (r = -0,3824, -0,3794, -0,3574 соответственно, все p < 0,05). Никакой значимой корреляции не наблюдалось между HDS и объемом спермы, концентрацией сперматозоидов, общим количеством сперматозоидов или PR (%). Эти результаты указывают на то, что DFIs тесно связаны с мужской фертильностью, что предполагает, что метод CFG, который предоставляет этот параметр, может быть более подходящим для клинической оценки повреждений ДНК спермы.

Introduction

Целостность ДНК сперматозоидов относится к целостности и функциональной стабильности структуры молекулы ДНК в ядре сперматозоида. В частности, она характеризуется нормальным конформационным состоянием хроматина, целостными последовательностями оснований без разрывов или окислительного повреждения, а также способностью точно передавать генетическую информацию потомству. В процессе сперматогенеза, когда уровень окислительного стресса повышается¹, ремоделирование хроматина происходит аномально² или сперматозоиды подвергаются воздействию токсинов окружающей среды³, целостность ДНК сперматозоидов повреждается, что приводит к несоответствию оснований, потере, модификации, добавлению ДНК и кросс-линку, одноцепочечным и двуцепочечным разрывам и т. д. Более того, поврежденная ДНК сперматозоидов может ухудшить мужскую фертильность и неблагоприятно повлиять на результаты беременности в технологиях вспомогательного репродуктивного технологии (ВРТ)⁴, а также увеличивает риск рецидивирующих выкидышей⁵. В 2021 году Европейская ассоциация урологов (EAU) рекомендовала включить тестирование DFI в систему оценки мужской фертильности⁶.

В настоящее время целостность ДНК сперматозоидов в основном оценивается путем обнаружения индекса фрагментации ДНК сперматозоидов (DFI). Анализ структуры хроматина сперматозоидов (SCSA) с помощью потокового цитометра является основным методом оценки DFI⁷. В литературе описаны два метода потокового цитометрического анализа для обнаружения DFI сперматозоидов. Один из них - это полигональный метод анализа (PGG), который может одновременно сообщать о двух ключевых показателях, таких как DFI сперматозоидов и HDS⁸. PGG является классическим подходом SCSA, характеризующимся меньшим коэффициентом вариации обнаружения и превосходной повторяемостью⁹. Однако он не может различать степень повреждения ДНК. Другой тип - это крючкообразный метод анализа (CFG), который может сообщать о серьезном маркере повреждения ДНК сперматозоидов (DFIs), легком маркере повреждения ДНК сперматозоидов (DFIm) и общем индексе фрагментации ДНК метода крючкообразного анализа (DFIc). DFIc равен сумме DFIs и DFIm. По сравнению с существующими технологиями оценки целостности ДНК сперматозоидов, метод CFG может отражать степень повреждения ДНК сперматозоидов¹⁰.

Чтобы определить, какой метод более подходит для оценки качества спермы, в данном исследовании были применены как метод PGG, так и метод CFG для измерения DFI и связанных параметров в сперме. Было сравнено соответствие результатов этих двух методов с параметрами обычного анализа семени. Насколько нам известно, это первое исследование, анализирующее корреляцию результатов обнаружения между двумя методологиями, PGG и CFG.

Protocol

Данное исследование было одобрено Комитетом по медицинской этике Первой городской больницы Хуай'ань, принадлежащей Нанкинскому медицинскому университету (Номер одобрения: KY-2024-181-01). Информированное согласие было получено от пациентов, чьи образцы были использованы в этом исследовании. Общее схематическое представление рабочего процесса представлено на Рисунке 1. Детальный список использованных реагентов и оборудования представлен в Таблице материалов.

Настройки CFG для потокового цитометра
После кислотной обработки ядерный хроматин сперматозоидов с поврежденной ДНК показывает одноцепочечную ДНК, в то время как ядерный хроматин сперматозоидов с неповрежденной ДНК сохраняет свою целостную двухцепочечную структуру. Флуоресцентный краситель акридиновый оранжевый (АО) связывается с одноцепочечной ДНК и излучает красное флуоресцентное свечение при возбуждении лазером 488 нм. При связывании с двухцепочечной ДНК он излучает зеленое флуоресцентное свечение при возбуждении лазером 488 нм. На основе количества красных и зеленых флуоресцентных сигналов, зарегистрированных потоковым цитометром, рассчитывается отношение красного флуоресцентного сигнала к общей сумме красного и зеленого флуоресцентного сигнала, что представляет собой индекс фрагментации ДНК сперматозоидов (DFI).

Настройки CFG были реализованы в соответствии с обзорной информацией, предоставленной Ян и др.¹⁰. Потоковый цитометр должен быть настроен с использованием минимальной зеленой флуоресценции и максимальной красной флуоресценции, измеренной в АО-окрашенных нормальных сперматозоидах, в качестве граничных значений (Рисунок 2). Ниже приведен список клеточных характеристик каждого квадранта в CFG:
Квадрант Q1 указывает на нормальные сперматозоиды. Было замечено, что ДНК сперматозоидов интактна, а количество связывания АО минимально, что приводит к зеленой флуоресценции.
Сперматозоиды в квадранте Q2 имеют частично фрагментированную ДНК и выглядят оранжевыми при флуоресцентной микроскопии. Такая ДНК может быть восстановима, эти сперматозоиды классифицируются как с легкой фрагментацией ДНК (DFIm)¹⁰.
Квадрант Q3 определен как неспецифическая флуоресценция, подвергшаяся вычитанию.
Сперматозоиды в квадранте Q4 имеют фрагментированную ДНК и выглядят красными при флуоресцентной микроскопии, что указывает на тяжелую фрагментацию ДНК (DFIs).

Предполагается, что сперматозоиды в квадрантах Q2 и Q4 содержат фрагментированную ДНК, и их сумма определяется как DFIc.

Настройки PGG для потокового цитометра
Многоугольная шлюзная зона для анализа потокового цитометра была установлена в соответствии с методом, описанным Evenson и др.⁸. Как показано на Рисунке 3, клеточные характеристики, связанные с каждой шлюзной зоной, следующие:
P3 указывает на процент клеток с денатурированной ДНК.
P4 представляет сперматозоиды с высокой окрашиваемостью ДНК (HDS). Эта группа сперматозоидов лишена нормального обмена гистонов на протамины.
Основные популяции клеток, расположенные за пределами шлюзных зон P3 и P4, состоят из нормальных сперматозоидов, демонстрирующих сниженную красную флуоресценцию и преимущественно излучающих зеленую флуоресценцию.

Сбор и анализ семенных образцов
Все 121 семенный образец были получены от мужчин, посетивших Репродуктивный центр Первой городской больницы Хуай'ань, принадлежащей Нанкинскому медицинскому университету. Семенные образцы были собраны путем мастурбации после периода воздержания от полового акта в течение 2-7 дней. Рутинный анализ семенной жидкости строго проводился в соответствии с требованиями Руководства ВОЗ по лабораторным исследованиям и обработке человеческой семенной жидкости^11,12. Анализ концентрации и подвижности сперматозоидов проводился с помощью компьютерной системы анализа сперматозоидов (CASA). Каждый образец анализировался дважды. Результаты сообщались в виде среднего значения только в том случае, если разница между двумя результатами была в пределах 95% доверительного интервала; в противном случае проводилась повторная выборка образцов и анализ.

Анализ DFI
Рассчитайте необходимый объем семенного образца, чтобы конечная концентрация сперматозоидов в реагенте A из набора для потокового цитометра составляла 2–3 x 10⁶/мл. Метод расчета: пред

Results

Среди 121 участников исследования (средний возраст: 32,5 ± 4,9 года; диапазон: 26–44 года) 28 были диагностированы с астенозооспермией и 4 с олигозоспермией. Основные демографические характеристики и параметры анализа спермы представлены в Таблице 1.

Как показано на Рисунке 4, график Блэнд-Альтмана показал, что результаты DFI сперматозоидов, полученные методами PGG и CFG, продемонстрировали отличную совместимость (r = 0,9667, p = 0,0000). Только у двух образцов наблюдались расхождения, превышающие +10%, и у трех образцов — менее -10%, причем доля составляла 1,7% и 2,5% соответственно.

Таблица 2 показывает сильную положительную корреляцию между DFIp из PGG и каждым из трех параметров CFG: DFIm, DFIs и DFIc. Коэффициенты корреляции составили 0,6497, 0,9404 и 0,9667 соответственно, а значения p были меньше 0,05. Результаты HDS, обнаруженные методом PGG, продемонстрировали значительную отрицательную корреляцию с DFIs и DFIc, обнаруженными методом CFG. Коэффициенты корреляции составили -0,3042 и -0,2120 соответственно, а значения p были меньше 0,05. Исследование не выявило корреляции между HDS и DFIm (значение p было больше 0,05).

Как показано в Таблице 3, процент прогрессивно подвижных сперматозоидов значительно отрицательно коррелировался с DFIp, DFIm, DFIs и DFIc (все значения p были меньше 0,05), но не коррелировался с HDS (значение p было больше 0,05). Объем семенной жидкости продемонстрировал значительную положительную корреляцию с DFIp, DFIs и DFIc (все значения p были меньше 0,05), но не с HDS (значение p было больше 0,05). Концентрация сперматозоидов и общее количество сперматозоидов не были связаны с результатами анализа PGG и CFG (значение p было больше 0,05).

Метод CFG демонстрирует отличную совместимость с PGG для оценки DFI. CFG позволяет различать степень повреждения ДНК, и его параметры DFI значительно коррелируют с подвижностью сперматозоидов. Показатели сильного повреждения ДНК сперматозоидов, известные как DFIs, более применимы для широкого использования в клинической практике.

Доступность данных:
Данные наборы данных, созданные и/или проанализированные в ходе данного исследования, включают клиническую информацию на уровне пациента и не раскрываются публике ввиду институциональных соображений конфиденциальности и этики. После представления разумного запроса и получения одобрения Комитета по этике Связного государственного больницы № 1 Хуайнань Нанкинского медицинского университета, соответствующему автору разрешается предоставить анонимизированные данные и аналитические результаты. В данном исследовании не разрабатывался никакой пользовательский код.

Рисунок 1: Общая схема рабочего процесса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этого рисунка.

Рисунок 2: Крестовое гатинговое (CFG) анализа потоковой цитометрии для обнаружения DFI. Q1 — нормальные сперматозоиды. Q2 — легкое повреждение ДНК (DFIm). Q3 — неспецифическая флуоресценция, которая была вычтена. Q4 — тяжелое повреждение ДНК (DFIs). Сперматозоиды с повреждением ДНК попадают как в Q2, так и в Q4. Их сумма представляет собой общую популяцию сперматозоидов с фрагментированной ДНК (DFIc). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этого рисунка.

Рисунок 3: Многоугольное гатинговое (PGG) анализа потоковой цитометрии для обнаружения DFI. P3: сперматозоиды с денатурированной ДНК. P4: высокая окрашиваемость ДНК (HDS) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этого рисунка.

Discussion

Шестое издание лабораторного руководства ВОЗ по исследованию и обработке человеческой спермы¹² рекомендует четыре метода для оценки целостности ДНК сперматозоидов: маркировку концов никей (TUNEL) с использованием терминальной дезоксинуклеотидил трансферазы (dUTP), методы электрофореза на геле с одной клеткой (Comet), СCSA и тест на дисперсию хроматина сперматозоидов (SCD). Из них, СCSA широко применяется в андрологических лабораториях благодаря использованию для анализа фазовой цитометрии, которая обеспечивает высокую пропускную способность, эффективность и объективность, а также возможность одновременного отчета о параметрах, таких как DFI и HDS⁷. Согласно глобальному исследованию⁷, почти четверть (24,1%) клиницистов, занимающихся репродуктивной медициной по всему миру, выбрали СCSA в качестве метода для оценки целостности ДНК сперматозоидов.

Самым критическим этапом в процедуре СCSA является установление соответствующих границ фазовой цитометрии. Традиционный метод PGG может обнаруживать как разорванные фрагменты (DFI) нитей ДНК, так и сперматозоиды с аномально высокой окраской ДНК (HDS), характеризующиеся отсутствием нормального обмена гистонов и протаминов¹³. Однако он не может различать одноцепочечные и двухцепочечные разрывы ДНК сперматозоидов. В последние годы Yang и др.¹⁰ разработали метод CFG для анализа DFI сперматозоидов с использованием фазовой цитометрии, который может различать степень повреждения ДНК сперматозоидов. Ключевым этапом этого метода является настройка крестообразных ворот для фазового цитометра. Метод CFG обладает отличной повторяемостью (коэффициент вариации был менее 5%) и линейным диапазоном обнаружения DFI от 8,93% до 53,90%. Этот метод отображает три показателя—DFIm, DFIs и DFIc—но не предоставляет результаты HDS¹⁰.

В данном исследовании было обнаружено, что общий DFI метода CFG (DFIc) хорошо согласуется с DFI метода PGG (DFIp). Анализ корреляции показал, что коэффициенты корреляции DFIs и DFIp были значительно выше, чем у DFIm. Ни концентрация сперматозоидов, ни общее количество сперматозоидов не коррелировали с результатами методов CFG или PGG. PR (%) и четыре типа DFI (DFIm, DFIs, DFIc, DFIp) были все значимо отрицательно коррелированы. PR (%) был значимо отрицательно коррелирован со всеми четырьмя типами DFI (DFIm, DFIs, DFIc, DFIp). Корреляция с DFIm (r = -0,1975) была значительно слабее, чем с DFIs, DFIc и DFIp (соответственно r = -0,3794, -0,3574, -0,3824). Эти результаты согласуются с результатами, сообщенными Yang и др.¹⁰. Более того, DFIs и DFIc показали хорошую корреляцию с объемом спермы, тогда как DFIm не показал. Хотя клиническая полезность индикатора, близкого к базовым параметрам спермы, может быть ограничена, этот результат указывает на то, что индекс тяжелых повреждений ДНК сперматозоидов (DFIs) может отражать отдельные патологические аспекты сперматогенеза. Более того, как показано в нашем корреляционном анализе, DFIs продемонстрировал значительно более сильную связь с процентом прогрессивно подвижных сперматозоидов по сравнению с DFIm, что еще раз подтверждает его потенциал в качестве дополнительного индикатора при оценке мужской фертильности, выходящего за рамки обычного анализа спермы.

HDS представляет собой долю несозрелых сперматозоидов, которые не обменивают нормальные гистоны и протамины. Предшественник протамина 1 в сперматозоидаx с HDS сохраняет терминальные аминокислоты, которые обычно расщепляются⁸, что может предотвращать надлежащее сгущение хроматина и приводить к увеличенному окрашиванию акридиновым оранжевым dsДНК. Предыдущие исследования подчеркивали важность HDS в описании дефектов хроматина в сперме. Исследования Lin и др.¹⁴ и Virro и др.¹⁵ показывают, что у мужчин с HDS > 15% выкидыши при экстракорпоральном оплодотворении (ЭКО) значительно выше. Однако недавние исследования указывают на то, что HDS может не являться надежным индикатором ядерной незрелости из-за его слабой корреляции с результатами окрашивания CMA3, AB и TB¹⁶. Таким образом, HDS может быть неприменим как индикатор мужской фертильности¹⁷. Это исследование также не показало значимой корреляции между HDS и базовыми параметрами спермы, включая объем спермы, концентрацию сперматозоидов и их подвижность. Поэтому HDS не рекомендуется в качестве маркера целостности ДНК сперматозоидов¹⁸.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Система компьютерного анализа спермы	Beijing Suijia Software Co., Ltd	SA-II
Флюоресцентный цитометр	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd	Cyto E6
Набор для цитометрии	Shenzhen BRED Biotechnology Co., LTD
Камеры Маклера	Sefi Medical Instruments
Набор для определения целостности ДНК ядра спермы	Shenzhen BRED Biotechnology Co., LTD	-