Измерение оттока и соответствия глаз в экс виво мышиных глаз с помощью системы шприц-помпы

Краткое содержание

Интеграция аналитических подходов из проверенных методов контроля давления позволила оптимизировать простую, недорогую систему насоса для шприцев для оценки отходной системы и соответствия глаз у глаз мышей.

Аннотация

Поддержание внутриглазного давления (ВГД) на подходящем и стабильном уровне жизненно важно для здоровья глаз. Биомеханические свойства трабекулярной сетки (TM), канала Шлемма (SC) и всей корнеосклеральной оболочки играют ключевую роль в гомеостазе IOP. Установка оттока (C) является ключевым параметром для оценки эффективности TM и SC в дренаже водной вооружённости, тогда как глазная комплаенс (φ) отражает эластичность корнеосклеральной оболочки и временного оттока через TM и SC. Ранее была разработана простая и экономичная система шприцев-насосов для оценки C. Однако использование простой линейной регрессии для анализа данных in vivo имеет ограничения в характеристике функций TM и SC. В этом исследовании система насоса для шприца была оптимизирована с применением аналитических подходов, разработанных для устоявшихся систем глазной перфузии с контролем давления. Измеренные значения C и φ в глазах ex vivo сравнивались с ранее опубликованными значениями перфузионной системы и соответствовали указанным диапазонам. В итоге, эта простая и недорогая система насосов облегчает оценку биомеханических свойств TM и SC.

Введение

Поддержание подходящего и стабильного уровня внутриглазного давления (ВГД) крайне важно для здоровья^{глаз 1}. Устойчивое повышение ВТР является основным фактором риска^{глаукомы 2,3}. Долгосрочные колебания ВГД в течение месяцев или лет также способствуют потере^{зрения 4,5}. Недавние исследования выявили другую форму флуктуаций ВВС — временные колебания, вызванные повседневной деятельностью, которые также могут ускорять прогрессирование^{глаукомы 6,7}. Например, 46-летний мужчина с 20-летним анамнезом трения век, и 52-летний мужчина, который тер глаза 10 лет, оба проявили ускоренное повреждение зрительного^{диска 8,9}. Эти результаты подчёркивают важность своевременной и адекватной реакции на изменения в ВГ для минимизации риска потери зрения.

IOP регулируется балансом между образованием водной вооружённости (AH) и его^{дренажом 10}. AH выходит из глаза преимущественно по традиционному и увеосклерному^{путям 11}. Как в нормальных, так и в глаукоматозных глазах традиционный путь, включающий трабекулярную сетку (TM) и канал Шлемма (SC), является основным источником сопротивления выходу, влияющим на гомеостаз^ИОР 12,13,14. Поэтому биомеханические свойства ТМ и СК необходимы для адаптации глаза к изменениям в^ИОР 15,16,17.

Недавние технологические достижения позволили более точно оценить отток AH. Были разработаны инвазивные методы, такие как гравитационная перфузия и система шприц-насос, для расчёта отходного объекта (C), что показывает, как TM и SC регулируют стационарный отток 18,19,20,21,22,23,24. Неинвазивные методы, такие как тонография²⁵ и^{флюорофотометрия 26}, применялись клинически для определения C у пациентов с глаукомой. Однако большинство подходов не способны конкретно оценить функцию ТМ и СК. Например, в системе шприц-насос данные о скорости расхода и давлении в стационарном режиме подбираются с помощью простой линейной регрессии, а наклон интерпретируется как давление-зависимое C. Однако этот рассчитанный C у живых мышей не может точно отражать емкость выхода AH по обычному пути, поскольку на него влияет секреция AH, увеосклеральный отток и эписклеральное венозное давление, как описано уравнением Гольдмана.

Для устранения этого ограничения Миллар и соавторы рассчитали приток АГ, обычный и увеосклеральный отток в одном и том же мышином глазу с помощью множества измерений постоянного потока, исходя из предположения отсутствия притока АГ, отсутствия эписклерального венозного давления и неизменного увеосклерального оттока после^{эвтаназии 22}. В 2016 году Шервуд и соавторы сообщили, что увеосклеральный отток равен 0 в экс виво глазах при 0 мм рт.ст., а затем ответили на тот же вопрос, представив модель по закону мощности с использованием iPerfusion (системы перфузии с контролем давления, далее называемой перфузионной системой⁾²⁷. Методологические достижения прояснили различные роли ТМ и СК, углубив понимание их физиологических функций в поддержании устойчивого оттока АГ.

Кроме того, временный ответ ТМ и СК на флуктуации ВГД имеет решающее значение для поддержания гомеостаза ВГД. Для отслеживания этого движения Син и соавторы разработали фазочувствительную оптическую когерентную томографию (ОКТ), которая позволяет наблюдать за временем^{в 28} секунд. Трёхмерная последовательная блок-гранная сканирующая электронная микроскопия может исследовать это движение на ультраструктурном^{уровне 29}. Однако методы на основе изображений оценивают только биомеханические свойства TM и SC и не дают реальных значений временного дренажа AH. В 2019 году, после разработки iPerfusion, Шервуд и др. рассчитали глазную комплаенс (φ) как ключевой индикатор как корнеосклеральной эластичности, так и временного ответа TM и SC³⁰. Это достижение обеспечивает количественный параметр для оценки временного поведения ТМ и СК в ответ на флуктуации ВГД.

Основываясь на этих достижениях в оценке функций TM и SC, это исследование улучшило систему шприцев-насосов, включив модель степенного закона для вычисления C и интегрируя новые методологии для вычисления φ. Эти измерения сравнивались с опубликованными данными, полученными с помощью перфузионной системы, чтобы оценить, подходит ли оптимизированная система насоса для шприца для оценки соответствия оттока и глазной системы в экс виво глазах мыши.

Протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с Заявлением ARVO по использованию животных в офтальмологических и зрительных исследованиях, а также рекомендациями по уходу и использованию лабораторных животных Медицинского центра университета Циндао (QDU-AEC-2022069).

1. Отбор и обращение с животными

1. Используйте мышей 5 месяцев с 50% C57BL/6 и 50% BALB/C. Не учитывайте секс в экспериментальном дизайне.
2. Поддерживайте мышей в цикле 12 ч/12 часов светло-тёмный при температуре 23 ± 2 °C и влажности 50 ± 5%.

2. Измерение ВМС

1. Анестезиируйте мышей с использованием 2,5% изофлурана с 80% (об/об) кислорода в герметичной камере в течение 3,5 минут.
   ВНИМАНИЕ: Изофлуран — летучий анестетик. Проведите анестезию в хорошо проветриваемом помещении или в соответствующей системе изоляции.
2. Перенесите мышей на рабочую платформу. Поддерживайте анестезию с помощью маски ещё 30 секунд.
3. Выполняйте все измерения между 9:00 и 12:00. Запишите три измерения на глаз. Вычислите среднее значение для каждой точки данных.

3. Настройка системы (рисунок 1)

1. Подключите шприц на 100 мкл к насосу для шприца.
2. Подключите шприц к датчику проточного давления.
3. Подключите датчик к системе сбора данных.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что датчик давления и держатель глаз выровнены на одной высоте, чтобы избежать артефактов давления.
4. Заполните систему 1× фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS). Удалите все воздушные пузырьки.
5. Поместите глаз в держатель с круглым углублением (диаметром 4–6 мм). Убедитесь, что глаз стабилен во время канюляции. Расположите датчик давления и держатель для глаз на одной высоте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Неправильное выравнивание может привести к ошибкам измерения давления. Файл дизайна STL для кастомизированного держателя для глаз предоставлен как дополнительный файл 1.

4. Работа программного обеспечения

1. Калибровка датчика давления
   1. Откройте программное обеспечение для сбора данных. Загрузите файл настройки калибровки. Выберите функцию калибровки .
   2. Подключите систему к резервуару с водой на двух определённых высотах.
   3. Входные измерения и фактические давления с использованием преобразования:
      1 см H₂O = 0,735 мм рт. ст.
2. Установка насоса
   1. Откройте настройки модуля. Загрузите файл конфигурации регулятора.
   2. Выберите насосное устройство. Введите максимальный расход и диаметр шприца.
3. Запись данных
   1. Начинайте запись.
   2. После каждого шага давления прекратите запись.
   3. Введите следующее значение давления.
   4. Перезапусти запись.

5. Подготовка иглы

1. Вытащите стеклянную микропипетку согласно установленному^{протоколу 8}.
2. Шлифуйте кончик до внутреннего диаметра 80–100 мкм. Полировка наконечника иглы.
   ВНИМАНИЕ: Обращайтесь со стеклянными иглами осторожно, чтобы избежать травм.
3. Закрепите иглу на микроманипуляторе. Подключите иглу к датчику давления.
4. Заполните иглу PBS.
5. Разместите кончик иглы на той же высоте, что и датчик давления.
6. Измерение сопротивления
   1. Приложите давление 1 мм рт. ст. Запишите расход.
   2. Рассчитайте сопротивление иглы:
      
   3. Используйте иглы с сопротивлением от 0,01 до 0,5 мм рт. ст. (мкл/мин).

6. Системный объект и соответствие требованиям

1. Измерение объектов
   1. Переполните систему с помощью PBS. Герметизируйте систему трёхклапанным клапаном.
   2. Прикладывайте давление на 6, 8, 10, 12, 14 и 16 мм рт. ст.
   3. Записывайте P и Q по 10 минут на каждом шаге. Рассчитайте средние значения за последние 5 минут.
   4. Выполните линейную регрессию. Интерпретировать уклон как системный объект.
2. Валидация
   1. Повторите измерения 3 раза.
   2. Убедитесь, что системный объект меньше 0,2 nL/min/mmHg.
3. Измерение соответствия
   1. Введите в систему силиконовую трубку диаметром 35 см.
   2. Измеряйте соответствие с тефлоновой трубкой и без неё.
   3. Вычислите изменение объёма с помощью метода дискретного^{объёма 14}.
   4. Определите соответствие системе как 4 nL/mmHg.
4. Проверка чувствительности
   1. Убедитесь, что обнаруживаемое соответствие системы превышает 9,9 nL/mmHg.

7. Энуклеация

1. Усыпить мышей с использованием_CO2 при расходе 0,7 л/мин в течение 3 минут.
   ВНИМАНИЕ: Эвтаназия при_CO2 должна следовать институциональным рекомендациям для обеспечения гуманных конечных целей.
2. Вскрытие внешних глазных мышц и зрительных нервов с помощью стерильных инструментов. Опустите глазные яблоки.
3. Немедленно установите один глаз в держателе при температуре 35,5 °C.
4. Размещайте противоположный глаз при 4 °C.
5. Измеряйте оба глаза одной и той же системой.

8. Каннуляция

1. Введение иглы
   1. Введите иглу через центральную роговицу под углом 45°.
   2. Продвигайте иглу на глубину 0,3–0,5 мм в переднюю камеру.
2. Валидация
   1. Стабилизируйте систему. Подтвердите колебания давления ≤ 0,4 мм рт. ст. за последние 5 минут.

9. Глазная клетка

1. Стабилизируйте глаз на 8 мм рт. ст. на 30 минут.
2. Прикладывайте давление на 6, 8, 10, 12, 14 и 16 мм рт. ст.
3. Примените последний шаг при 8 мм рт. ст.
4. Сбор данных
   1. Установите максимальный расход на 4 мкл/мин.
   2. Записывайте P и Q по 10 минут на каждом шаге.
5. Анализ
   1. Постройте кривые P–T и Q–T. Рассчитайте средние значения за последние 5 минут.
   2. Подгонка данных к модели степенного^{закона 27}:
      
6. Определим C_r (после вычитания системного объекта) как объект оттока глаз.
7. Набор P_r = 8 мм рт. ст.
8. Определим β как нелинейный коэффициент.

10. Глазная Φ_r

1. Анализировать кривые P–T и Q–T при увеличении давления. Определите увеличение потока до Q_max и последующее замедление.
2. Вычислите изменение громкости между t_p и _{t max} с помощью дискретного объёма^{метода 30}.
3. Подгонка данных к модифицированному уравнению^{Фриденвальда 30}:
   
4. Набор P_r = 13 мм рт. ст. Определите Φ_r (после вычитания соответствия системы) как глазное соответствие Φ_r, _глаз, а γ как параметр материала.

Результаты

Эффективность оптимизированной системы насоса для шприца была оценена путём сравнения C и φ у 5-месячных мышей с ранее опубликованными значениями исследований глазной перфузии под давлением. Нормальность наборов данных на рисунке 2F оценивалась с помощью теста Шапиро–Уилка, а статистические сравнения проводились с помощью двухстороннего парного t-теста Студента.

Как показано на рисунке 2A–C

Обсуждение

В данном исследовании представлена оптимизированная система насоса для шприцев для оценки установки отвода и соответствия глаз у глаз мышей, что даёт значения, соответствующие тем, что сообщаются с использованием систем глазной перфузии с контролируемым давлением. Современный подход повышает точность измерений на основе шприцев, сохраняя при этом простую и доступную экспериментальную систему. Такое сочетание методологической доработки и доступности может способствовать более широкому вне...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Реагент	1 и раз; Буфер PBS	Термо Фишер Сайентифик	10010023
Изофлуран	Shenzhen Rewoode Life Sciences Co., Ltd., Китай	R640
Материал	100 & MU; Высокоточный шприц L	Гамильтон	1710
Боросиликатное стекло	Саттер, Новато, Калифорния	BF100-50-10
Одноразовый стерильный шприц	Fenglin Medical Devices Co., Ltd. Цзянси, Китай	10 мл
Датчик давления	IcuMedical	PX26-015G
Силиконовая трубка	Runze Fluid Co., Ltd, Нанкин, Китай	Н/Д
Прозрачная трубка PTFE	Runze Fluid Co., Ltd, Нанкин, Китай	Н/Д
Оборудование	Пылающий/коричневый пипеточный вытягиватель	Саттер, Новато, Калифорния	P-97
Ручной микроманипулятор	Мировые прецизионные приборы (WPI)	M3301
Металлическая ванна	Beaver Biology, Сучжоу, Китай	2016C
MicroForge	Лаборатория научных приборов Нарисигэ, Токио, Япония	MF830
Кофемолка для микропипеток	MPInstrument Co., Ltd., Ухань, Китай	KDG-02
Бинокулярный микроскоп PZMIII Stereo Zoom	Мировые прецизионные приборы (WPI)	PZMIII
Шприц-насос	Мировые прецизионные приборы (WPI)	AL-1000