Методическая статья

Мелкомасштабная диссекция и окрашивание антителами глазно-усиков и крыльев (Drosophila melanogaster)

144 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70434

⸱

15 мая 2026 г.

 , 
1Department of Developmental and Cell Biology, Charlie Dunlop School of Biological Sciences, University of California, Irvine, 2Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of California, Irvine

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье описывается эффективный протокол воображаемой диссекции диска и окрашивания антител, который экономичен с использованием реагентов и облегчает работу с воображаемыми дисками в небольших количествах.

Аннотация

Воображаемые диски Drosophila давно изучаются как модели развития, паттернирования и регенерации эпителиев. Маркировка антител и визуализация диссектирующих воображаемых дисков важны для визуализации паттернов экспрессии белков как маркеров развития и физиологических процессов. Этот метод воображаемой диссекции и маркировки диска был изначально разработан для иммуноэлектронной микроскопии воображаемых дисков глаз-антенн Томлинсоном и Реди. Используя пластины размером 60 микроскважин и перемещая ткани между растворами вместо переноса растворов, индивидуализированное внимание к образцам тканей становится возможным с минимальными потерями. Даже отдельные воображаемые диски могут быть обработаны. Метод требует лишь небольших объёмов антител и других реагентов. В качестве примера применения метода к другим мелким тканям, статья также демонстрирует, как крылья могут быть препарированы и промаркированы тем же методом. Похожий подход можно применить к любой небольшой ткани схожих размеров, а также к другим гистохимическим и метческим процедурам, помимо окрашивания антител.

Введение

Воображаемые диски у Drosophila — это ткани-предшественники, которые откладываются в сторону во время эмбриогенеза и растут внутри личинки без дифференциации, а также вносят вклад в формирование эпидермических структур взрослой женщины встадии 1 куколки. Их исследование дало множество знаний о механизмах формирования паттернов развития, особенно хорошо изучены диски глаз икрыльев 2,3,4,5,6. Иммуногистохимия особенно полезна для изучения пространственных и временных паттернов экспрессии генов в воображаемых дисках, а также для характеристики поведения клеток, включая деление клеток и гибель клеток.

Для облегчения дополнительных требований к электронно-микроскопическому анализу мышечных дисков глаз, маркированных антителами, Томлинсон и Реди разработали маломасштабный протокол, который особенно экономичен с реагентами и обеспечивает очень высокую степень надёжности и индивидуальности.7. Их метод описан в печатном виде, но видео недоступно 3, 8 и 9. Метод легко модифицируется для маркировки других воображаемых дисков (или других тканей) и может применяться к крылым воображаемым дискам, а также к глазно-антеннальным воображаемым дискам.

Маркировка антител воображаемых дисков Drosophila соответствует общей схеме, применимой к любойткани 10 (рисунок 1). Ткань должна быть рассечена и фиксирована перед инкубацией антителами, специфичными к интересующим белкам. После того как несвязанное антитело смывается, добавляется маркированный (часто флуоресцентный) вторичный антител, который связывается с первичным антителом, которое само связывается с интересующим белком в фиксированной ткани. После промывания для удаления несвязанных вторичных антител ткань можно установить для микроскопического исследования, а интересующие белки визуализировать. Существует множество общих описаний этого процесса, которые могут применяться к воображаемым дискам и другим тканям дрозофилы 11. Здесь предусмотрен протокол для метода Томлинсона и Реди, при котором образцы тканей переносятся индивидуально между небольшими инкубационными ямами на пластине микроколодици и наблюдаются стереомикроскопом на каждом этапе (см. рисунок 2). Этот подход лучше всего подходит для окрашивания небольшого количества тканей за раз (десятки образцов) и не подходит для больших партий (то есть сотен). Этот подход требует лишь небольших объёмов раствора по 13 мкл в каждой яме, поэтому может быть выполнен с очень низким количеством антител. Из-за минимальной потери тканей нет минимального размера образца, и даже одиночные воображаемые диски можно надёжно обрабатывать.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Создание инструмента для переноса

  1. Используйте плоскогубцы, чтобы перерезать ~2,5 см вольфрамовой проволоки диаметром 0,005". Используйте щипцы, чтобы сформировать один конец провода в крючок или петлю (рисунок 3). Вставьте другой конец в держатель для иглы. Это будет использоваться для переноса дисков с минимальным или отсутствующим переносом жидкости. Петля может быть проще в использовании, но крючок передаёт меньше жидкости между растворами.

2. Вскрытие и фиксация воображаемых дисков глаз-антенн

  1. Промывайте личинки буфером с натрием фосфатом (pH7.2) объемом ~7,5 мл 0,1 м в чашке Петри (диаметр 60 мм), чтобы удалить среду от мух и другой мусор. См. шаг 6 для рассечения воображаемых дисков крыла, а не глазно-антеннальных дисков. Оба этих воображаемых диска расположены в передней части тела (рисунок 4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: PBS также может использоваться вместо фосфатного буфера в шагах 2.1–2.3.
  2. Перенесите личинки в чашку Петри с свежим буфером.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые работники предпочитают вскрытие отдельных личинок в отдельные капли в чашке Петри диаметром 60 мм; Другие используют слайды DownWell Well.
  3. Во время наблюдения под расчленительным микроскопом удержите личинку на ~50% вдоль тела с помощью щипцов. Используйте вторую пару тонких щипцов, чтобы схватить крючки и потянуть. Глазно-антеннальные диски выходят, прикреплённые к ротовым частям. Мозг также может оставаться прикреплённым к дискам глаз.
  4. С помощью проволочного инструмента переместите расчленённую ткань в небольшую чашку Петри (диаметром 35 мм), содержащую фиксацию ~3 мл, например, 3,7% формальдегида в буфере натрия фосфата (pH7,2) объемом 0,1 М, полученного путём разбавления 37% раствора формальдегида в буфере.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте одобренные местами меры безопасности при обращении с формальдегидем. 3,7% формальдегид — это простой фиксатор, который во многих случаях будет удовлетворительным средством, но другие фиксативы могут быть оптимальными для определённых антигенов. PBS или PEM (0,1 M PIPES pH 7,0, 2 mM MgSO4, 1 mM EGTA) могут использоваться в качестве фиксирующего буфера вместо 0,1 M натриевого фосфата, либо формальдегидный раствор может быть получен путём растворения твёрдого параформальдегида, а не из концентрированного стандартного раствора. Фиксативный параформальдегид-лизин-периодат (PLP) сочетает более мягкую фиксацию белка с перекрёстным сшивом углеводов и лучше сохраняет мембранныеструктуры 12. Например, гликопротеин Drosophila Scabrous остаётся антигенным после фиксации PLP, но не после фиксации формальдегида. Приготовьте PLP свежим образом: (1) Добавьте 2 г параформальдегидного порошка в 25 мл деионизированной воды в конической колбе в вытяжке и перемешайте на низком огне; (2) Окуньте пипетку в раствор гидроксида натрия с 50% и перенесите в смесь небольшой след жидкости (значительно меньше одной капли). Параформальдегид должен раствориться в течение нескольких минут, не доведя до кипения. Охлаждая раствор 8% формальдегида, растворите 0,36 г лизина в 10 мл деионизированной воде, 7,5 мл 0,1 млн натрий фосфата pH 7,2, 2,5 мл 0,1 м На, 2HPO 4 и храните на льду. Смешайте 15 мл этого холодно буферированного лизинового раствора с 5 мл свежего 8% формальдегида и 50 мг натриевого периодата в винтовой трубке на 50 мл, перемешайте вихрь и используйте в состоянии свежей формы.
  5. Через 15–20 минут при комнатной температуре переместите расчленённую ткань в другую чашку Петри с буфером натрия фосфатом 0,1 M (pH 7,2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: PBS также может использоваться вместо фосфатного буфера. Фиксация на льде может быть предпочтительнее для некоторых антигенов или при необходимости визуализации эндогенной флуоресценции GFP или RFP, экспрессируемой в ткани. Фиксация PLP всегда длится 45 минут на льду.

3. Блокировка и инкубация с первичными антителами

  1. Перенесите ткани в чашку Петри толщиной 35 мм, содержащую буфер для промывания антител с NSG объемом ~3 мл для блокировки. Инкубировать чашку Петри на льду не менее 15 минут. NSG содержит 0,1 млн буфера фосфата натрия (pH 7,2), 0,1% сапонина, 5% обычной козьей сыворотки. Буферные приклады хранятся в фильтре при температуре 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разные буферы для мытья могут быть оптимальными для определённых антител. Например, если сапонин — это мягкий неионный детергенный препарат, который особенно растворяет плазматическую мембрану, то другие детергенные средства могут быть предпочтительнее для обнаружения антигенов внутри ядра. В качестве дополнительного примера, антитела, разработанные Джарманом и др. 13 против ядерного белка Atonal, наиболее иммунореактивны в буферах, содержащих NP40 в качестве детергента. Смотрите таблицу материалов для рецептов альтернативных буферов для мойки: PDT, PBT или NSG. При использовании обычной сыворотки в качестве блокирующего белка, в идеале, она должна быть из вида, в котором производится вторичное антитело, например, обычная козья сыворотка, если используется козья вторичная антитела, или обычная ослиная сыворотка, если используются вторичные антитела для осликов. На практике это мало что меняет.
  2. Очистите любые нежелательные ткани от воображаемых дисков глаз-антенн во время блокировки с помощью тонких щипцов, кроме крючков для рта. Пока оставьте ротовые части прикреплёнными для облегчения переноса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Посторонние ткани, например мозг, также могут оставаться до установки затвора (шаг 5.4), если они не мешают пятнанию или видимости.
  3. Во время блокировки приготовьте разбавление 1:100 раствора антител mAb40-1a в NSG, например, 1 мкл антитела на 100 мкл NSG. Смешивайте пипеткой, а не вихрь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: mAb40-1a — это моноклональное антитело, возбуждаемое против бета-галактозидазы. Оптимальное разбавление антител и буфер для промывания будут различаться в зависимости от конкретных используемых антител.
  4. Добавьте по 13 мкл антител в каждую из до шести скважин в первой колонке мини-лотка на 60 лунок. Конические микроколодцы с прямыми сторонами важны для оптической чистоты. Если требуется более шести колодцев, задавайте второй мини-лоток.
  5. Передавать глазно-антеннальные воображаемые диски, желательно всё ещё прикреплённые к ротовым органам, в основной раствор антител по одному с помощью проволочной петли или крючка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество воображаемых дисков, которые можно добавить в каждую яму, зависит от антитела. Слишком много ткани может истощать некоторые антитела до такой степени, что маркировка уменьшается. 5 пар на скважину обычно вполне удовлетворительны. Таким образом, ~60 дисков можно легко маркировать с помощью 6 рядов микротитров с 60 ячецами. Для каждого ряда можно использовать разные антитела. Возможность повторного использования растворов антител требует эмпирического тестирования для каждого случая; Это не рутина в нашей лаборатории.
  6. Закройте пластину крышкой и запечатайте парапленкой, чтобы ограничить испарение. Инкубировать на льду или при 4 °C в течение 4 часов до ночи. Покачивание не обязательно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное время и температура инкубации антител зависят от самого антитела. Во многих случаях достаточно 1–2 часа при комнатной температуре, но некоторые антитела дают лучшие результаты после инкубации при 4 °C, и часто удобно инкубировать при 4 °C ночью. В очень редких случаях оптимальными могут быть первичные инкубации антител в течение 2–3 дней. Герметизация крышки микроколодца необходима только при инкубациях длительностью более ~4 часа.

4. Промывка и инкубация с вторичным антителом

  1. Добавьте 13 мкл буфера NSG в следующие три колонны колодцев после каждой ямы антител, так как образцы будут промываться три раза. Перемещайте образцы для промывки в каждую колодцу последовательно.
  2. Во время промывки приготовьте разбавление флуоресцентно конъюгированных вторичных антител в буфере NSG в соотношении 1:200–400, например, 0,5 мкл антител в 100 мкл NSG. Смешивайте пипеткой, а не вихрь. Центрифугуйте вторичный раствор антител в течение 60 секунд (на максимальной скорости) перед разбавлением, так как агрегаты антител могут неспецифически связываться с поверхностью ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное разбавление вторичных антител может различаться в зависимости от производителя. Антитела, конъюгированные с Alexa- или цианином, доступны, вычитаемые для других видов для облегчения многократной маркировки.
  3. Добавьте 13 мкл вторичного раствора антитела в следующий (5-й) столбец колодцев.
  4. Переносите образцы во вторичное антитело с помощью петли или крючка.
  5. Закройте пластину крышкой и запечатайте парапленкой, чтобы ограничить испарение. Инкубировать на льду 4 часа ночью.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное время и температура инкубации антител зависят от самого антитела. Во многих случаях достаточно 1–2 часа при комнатной температуре, но некоторые антитела дают лучшие результаты после инкубации при 4 °C, и часто удобно инкубировать при 4 °C ночью. Герметизация крышки микроколодца необходима только при инкубациях длительностью более ~4 часа.

5. Стирка и монтаж тканей для микроскопии

  1. Подготовьте следующие три колонны колодцев после вторичного антитела с 13 мкл NSG. Перенесите образцы через каждую скважину на 5 минут.
  2. Переместите образцы в финальную промывку в9-й скважине с использованием 13 мкл буфера фосфата натрия с концентрацией 0,1 М (pH 7,2). Этот буферный промыв необходим, когда в буферах есть компоненты, осаждающиеся в монтажной среде.
  3. . Добавьте 13 мкл монтажной среды к финальной (10-й) колонне скважин. Монтажная среда получается растворением 2% n-пропилгаллята в 75% глицерине и 25% буфера фосфата натрия с концентрацией 0,1 М, pH 7,2. Каждую неделю готовьте свежую монтажную среду, смешивая компоненты на вращающейся платформе. Дайте пузырькам воздуха очиститься перед использованием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Монтажные носители также доступны в коммерческом ассортименте.
  4. Пипетта 20 мкл монтажной среды на чистом микроскопическом стекле. Перенесите образцы в среду на слайде. Это последняя возможность удалить нежелательные ткани. Кутикулярные ротовые части необходимо удалить из глазно-антеннальных дисков.
  5. Чтобы разместить образцы так, чтобы они не смещивались при наложении стекла на крышку, используйте проволочный инструмент, чтобы вытащить образцы из основной капли монтажа. Аккуратно опустите чистое крышное стекло толщиной #1.5 размером 22 мм x 40 мм на затвор с помощью щипцов, не появляя воздушных пузырьков.
  6. Дайте затворам постоять 1 час в картонном держателе затвора, чтобы монтажный материал осялся. Избегайте беспокойства стекла, так как хрупкие образцы могут повредиться при движении стекла крышки.
  7. Когда стекло осест, запечатайте края лаком для ногтей. Не двигайте и не нажимайте на стекло крышки во время этого. Дайте лаку высохнуть не менее 1 часа перед фотографией.
    ПРИМЕЧАНИЕ: К сожалению, большинство косметических лаков сейчас используют растворители, которые неравномерно распределяются по стеклянным стеклам и не полезны, поэтому необходимо получить научный лак.
  8. Храните горки при 4 °C. Образцы обычно можно снимать и повторять в течение нескольких месяцев.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды также можно хранить при -20 °C.

6. Вскрытие и фиксация воображаемых дисков крыла

  1. Чтобы расчленить воображаемые диски крыльев, а не глазно-антеннских, следуйте следующим шагам вместо шагов 2.3–2.5 выше.
  2. Под вскрытием микроскопа захватите ротовые органы личинок тонкими щипцами. С помощью микродиссекционных ножниц разрежьте личинку на 30–40% от передней части.
  3. Перевернуть переднюю часть личинки, раздвинув открытый, срезанный конец личинки с помощью второй пары щипцов и протолкнуть голову и ротовые органы, подобно инвертированию носка
  4. С помощью щипцев переместить перевёрнутые передние личинки в фиксатор в небольшую чашку Петри диаметром 35 мм, содержащую фиксатор с ~2,5 мл, например, 3,7% формальдегида в буфере фосфата натрия объёмом 0,1 М (pH 7,2), полученный путём разбавления 37% раствора формальдегида в PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При желании перевёрнутые туши могут быть перенесены в 400 мкл фиксатива в микрофужной трубке, что облегчает фиксацию в выхлопчике. Те же фиксативные опции, доступные для фиксации диска глазом-воображаемым, применимы и к фиксации диска крыла (см. ПРИМЕЧАНИЕ на шаге 2.4). Оптимальная фиксация и маркировка воображаемых дисков глаз-антенна обычно одинаковы для дисков крыла.
  5. Через 15–20 минут при комнатной температуре переместите расчленённую ткань в другую чашку Петри с буфером натрия фосфатом 0,1 M (pH 7,2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Те же варианты буфера мойки, доступные для фиксации диска с воображаемым глазом, также применимы к фиксации диска крыла (см. ПРИМЕЧАНИЕ по шагу 2.4). Оптимальный буфер для промывания дисков глаз-антенна обычно одинаков для дисков крыла.
  6. Удалять диски крыльев с личинок с помощью тонких щипцов. Если они всё ещё присутствуют, меньший диск на халтере и диске ноги можно либо удалить сейчас, либо остаться прикреплёнными к дискам крыла для облегчения переноса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Диски крыла могут быть незаметны в туше, пока жировое тело или другая ткань не будут удалены (всегда определяйте ткань перед её удалением). Диски крыльев — самые крупные воображаемые диски, прикреплённые к стенке тела, тесно связанные с трахеей. Они имеют форму слезы, как контур SouthAmerica 1 (рисунок 4).
  7. Продолжайте шаги 3–5, как указано выше.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Процедура Томлинсона и Реди регулярно даёт отличные результаты окрашивания антител. Здесь показаны тройные маркированные диски глаза, усиков и крыльев. На рисунке 5A воображаемый диск третьего возраста глаз-антенна был тройно помечен для обнаружения транскрипционного фактора Senseless (синий), маркера нейронного предшественника Elav (красный) и анти-GFP маркировки клеточных клонов, экспрессирующих РНКи для транскрипта Ocho (зелёный).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Окрашивание тканей дрозофилы антителами с использованием 60-ядровых конических пластин методом Томлинсона и Реди даёт отличные результаты и является очень надёжным, поскольку каждый воображаемый диск отслеживается под микроскопом во время каждой манипуляции. Метод требует лишь небольших количества реагентов с антителами и обменивается растворами более полно на каждом этапе, поскольку образцы передаются с очень малым количеством сопутствующей жидкости. Он особенно подходит для об...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конкурирующих интересах.

Благодарности

NEB благодарит Эндрю Томлинсона за то, что поделился методом, и Люси Ферт за доработки. Благодарим Абхишека Бхаттачарью за вклад в рисунок 5A. Мы благодарим Джойнера Круза, Джонатана Гонсалеса, Челси Нгуен и Дженсена Нортрупа. Исследования в лаборатории авторов финансируются грантами NIH (GM120451 и CA284362). Рисунок 2 и Рисунок 4 были созданы с помощью Biorender.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Динодордий фосфатФишер7558-79-4Na2HPO4 — безводный фосфат натрия. Можно использовать и другие гидратационные режимы, но изменяющие молекулярную массу
Щипцы: Дюмон #5 Biologie щипцыТонкие научные инструменты11252-20Стиль: #5
           Форма кончика: прямой
               Длина: 11 см
           Автоклавный сейф: Да
           Советы: биология
           Размеры кончиков:
         0,05 x 0,02 мм
           Сплав / Материал: Inox
ФормальдегидФишерBP531-500Молекулярная биология — 37% формальдегид. 500 мл
Фиксатив формальдегидовФишерBP531-5003,7% формальдегид в буфере pH7.2 с содержанием натрия с содержанием 0,1 м, получаемого путём разбавления из 37% запаса.
ГлицеринБиореагенты FisherBP229-1
ЛёдПредпочтения пользователя
L-лизин — 98%ТермонаучныеJ62225.22
mAb40-1DHSB40-1a-sАнтибета-галактозидаза
Микроцентрифугальные трубкиUSA scientific1615-5520Пробирки объемом 1,5 мл для хранения образцов.
Микродиссекционные ножницыТонкие научные инструменты15003-08Режущая кромка 5 мм, прямой кончик, 8,5 см
Фосфат мононатрияФишер7558-80-7NaH2PO4 — монобазовый натрий фосфат безводный. Если использовать гидратированную форму, вес, необходимый для приготовления раствора размером 0,1 м, изменится.
Монтажная среда75% раствор глицерина в буфере pH7.2 с концентрацией 0,1 млн натрий фосфат с 2,5% n-пропил-галлатом. Смешивайте по инверсии, чтобы минимизировать пузырьки.
NSGБуфер pH7.2 с натрием фосфатом 0,1 млн, 0,1% сапонина, 5% NGS
n-пропил-галлатMP Biomedicals210274780
Лак для ногтейТед Пелла, купленный у ФишераNC0381432Для герметизации затворов
Держатель для иглыФишерNC0099380Для микродиссекцияции игл. Полая нержавеющая сталь; Длина рукоятки: 4 3/4" в длину
Nunc Microwell MiniTraysThermo Scientific12565155MicroWell MiniTray для серологических применений. Счёт 60
ПарафильмStatLabPM996Самозапечатывающаяся гибкая пленка StatLab ParaFilm M
ПараформальдегидPolysciences, Inc.00380-250
10x PBSПредпочтения пользователяПодготовьте 800 мл дистиллированной воды в подходящем сосуде.
           Добавьте в раствор 1,37 м хлорида натрия.
             Добавьте в раствор 26,8 мМ хлорида калия.
             Добавьте в раствор 101 мМ дибазового натрия фосфата.
         Добавьте в раствор 18,0 мМ монобазического калия фосфата.
         Скорректируйте раствор до желаемого pH (обычно pH и asymp; 7.4).
           Добавьте дистиллированную воду до 1 л.
PBTПредпочтения пользователяБуфер pH7.2 с натрием фосфатом 0,1 млн, 0,1% бычьей сыворотки альбумина и 0,2% тритон X-100.
PDTПредпочтения пользователяБуфер натрия фосфата 0,1 млн (pH = 7,2), 0,3% дезоксихолата и 0,3% тритона x-100
Чашка ПетриFalconCorning 351007Чаша Петри; 60 мм; Необработанные
Чашка ПетриFalconCorning 351008Чаша Петри; 35 мм; Необработанные
ПлоскогубцыПредпочтения пользователя
PLPн/д2% параформальдегид 1,35% лизин в буфере pH7.2 с фосфатом натрия с уровнем 0,05 млн
Вторичные антителаJackson ImmunoResearch715-545-1510,5 мг Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG.
Обложки слайдовVWR48393-172VWR Coverglass #1.5 22x40 (КЕЙС)
СлайдыФишер125442Стеклянные слайды Fisher Glass 10bx/CS
Дезоксихолат натрияThermo Fisher Sci89904деоксихолат натрия; 5 мг
Периодат натрияСигма Олдрич71859-25GПериодат натрия и даш; 25 граммов
Буфер фосфата натрияpH буфера NaPO4 0,1M 7,2. Смешайте 28 мл 0,1М любого мононатриевого фосфата (11,998 г NaH2PO4 до 1 л дистиллированной воды) с 72 мл 0,1М любоводного динатриево-фосфата (14,196 г Na2HPO4 до 1 л дистиллированной воды) для получения 100 мл 0,1М буфера NaPO4. В качестве альтернативы может использоваться PBS.
Вольфрамовая проволокаТед Пелла27-11.005" Диа.
Triton x-100Thermo Fisher SciA16046AE
ВихрьПредпочтения пользователя

Ссылки

  1. Bate, M., Martinez Arias, A. The development of Drosophila melanogaster. , CSHL Press. 747-841 (1993).
  2. Tripathi, B. K., Irvine, K. D. The wing imaginal disc. Genetics. 220 (4), iyac020(2022).
  3. Baker, N. E., Li, K., Quiquand, M., Ruggiero, R., Wang, L. H. Eye development. Methods. 68 (1), 252-259 (2014).
  4. Treisman, J. E. Retinal differentiation in Drosophila. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (4), 545-557 (2013).
  5. Beira, J. V., Paro, R. The legacy of Drosophila imaginal discs. Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).
  6. Held, L. I. J. Imaginal discs: The genetic and cellular logic of pattern formation. , Cambridge University Press. (2002).
  7. Tomlinson, A., Ready, D. F. Neuronal differentiation in the Drosophila ommatidium. Developmental Biology. 120, 366-376 (1987).
  8. Rubin lab methods book. , Wellcome Collection. https://wellcomecollection.org/works/u7msrkak (1990).
  9. Rubin lab manual. , The Rubin Lab. https://www.yumpu.com/en/document/view/12357776/rubin-lab-manual-jfly-home-page (1990).
  10. Mitchison, T. J., Sedat, J. Localization of antigenic determinants in whole Drosophila embryos. Dev Biol. 99 (1), 261-264 (1983).
  11. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila protocols. , Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  12. Mclean, I. W., Nakane, P. K. Periodate-lysine-paraform-aldehyde fixative a new fixative for immunoelectron microscopy. J. Histochem. Cytochem. 22, 1108-1077 (1974).
  13. Jarman, A. P., Grell, E. H., Ackerman, L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Atonal is the proneural gene for Drosophila photoreceptors. Nature. 369, 398-400 (1994).
  14. Worley, M. I., Setiawan, L., Hariharan, I. K. Tie-dye: A combinatorial marking system to visualize and genetically manipulate clones during development in Drosophila melanogaster. Development. 140 (15), 3275-3284 (2013).
  15. Blanco, J., Cooper, J. C., Baker, N. E. Roles of c/ebp class bzip proteins in the growth and cell competition of rp ('minute') mutants in Drosophila. Elife. 9, e50535(2020).
  16. Jennings, B., Preiss, A., Delidakis, C., Bray, S. The notch signalling pathway is required for enhancer of split bhlh protein expression during neurogenesis in the Drosophila embryo. Development. 120 (12), 3537-3548 (1994).
  17. Kiparaki, M., Baker, N. E. Protocol for assessing translation in living Drosophila imaginal discs by o-propargyl-puromycin incorporation. STAR Protoc. 4 (4), 102653(2023).
  18. Spratford, C. M., Kumar, J. P. Dissection and immunostaining of imaginal discs from Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (91), e51792(2014).
  19. Yan, S. J., Li, W. X. Using Drosophila larval imaginal discs to study low-dose radiation-induced cell cycle arrest. Methods Mol Biol. 782, 93-103 (2011).
  20. Klein, T. Immunolabeling of imaginal discs. Methods Mol Biol. 420, 253-263 (2008).
  21. Phalle Bde, S. Immunostaining of whole-mount imaginal discs. Methods Mol Biol. 247, 373-387 (2004).
  22. Morimoto, K., Tamori, Y. Induction and diagnosis of tumors in Drosophila imaginal disc epithelia. J Vis Exp. (125), e55901(2017).
  23. Brown, N. L. Confocal microscopy methods and protocols. Methods in molecular biology. Paddow, S. W. , Humana Press. 75-91 (1999).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Drosophila60

Похожие статьи