Исследовательская статья

Выделение и характеристика обогащённых экзосомами внеклеточных везикул из клеток млекопитающих, инфицированных вирусом денге типа 2

DOI:

10.3791/70437

⸱

27 марта 2026 г.

 ,  ,  ,  , 
1Medical Laboratory Science Program, Texas State University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем выделение внеклеточных везикул, обогащённых экзосомами, из супернатанта, инфицированной вирусом денге типа 2, затем характеристику целостности и распределения размеров везикул, а также оценку отсутствия обнаруживаемого инфекционного вируса с помощью анализа бляшек в определённых экспериментальных условиях.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Обогащённые экзосомами EV — это везикулы, выделяемые различными типами клеток в внеклеточные жидкости, такие как плазма, моча, слюна, среда культуры клеток и другие биологические жидкости. Их диаметры варьируются от 30 нм до 150 нм. Они участвуют в различных клеточных процессах, включая клеточную коммуникацию и иммунную модуляцию во время инфекции. На основе этих эффектов они были использованы для изучения патогенеза нескольких вирусов. Изолировать обогащённые экзосомами EV из вирусно-инфицированных клеточных супернатантов с помощью современных методов очистки сложно. Это в значительной степени связано с пересечением размеров некоторых вирусов и EV, обогащённых экзосомами. Здесь мы стремимся очистить экзосомные EV из супернатантного клеточного культуры, инфицированного Денге типа 2. Электромобили, обогащённые экзосомами, изолировали с помощью коммерческого комплекта для изоляции экзосом. Для изолированных EV, обогащённых экзосомами, в этом протоколе ни один инфекционный вирус не был обнаружен при тестируемых условиях. Очищенные экзосомами обогащённые ЭВ были охарактеризованы с использованием вестерн-блоттинга для тетраспанинов, анализа отслеживания наночастиц и трансмиссионной электронной микроскопии для подтверждения размера. Мы показали, что наши экзосомные EV целы и находятся в пределах нормального диаметра экзосом 30-150 нм. В целом, наш протокол предоставляет недорогой метод очистки электромобилей, обогащённых экзосомами, из вирусно-инфицированного клетчатого супернатанта, который может использоваться для дальнейших функциональных анализов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экзосомно-обогащённые EV — это наноразмерные везикулы, которые высвобождает каждая клетка организма. Они являются подтипами внеклеточных везикул (ЭВ) эндоцитарного происхождения. Экзосомно-обогащённые ЭВ впервые были обнаружены в среде культуры ретикулоцитов1. За последние несколько десятилетий электромобили, обогащённые экзосомами, были очищены из различных биологических жидкостей, включая кровь, мочу, слюну, грудное молоко, семенные жидкости и амниотическиежидкости 2,3,4,5. Их диаметр варьируется от 30 нм до 150нм6. Их высвобождение в внеклеточный компартмент происходит путём слияния мультивезикулярных тел (MVB) с плазматической мембраной клетки. В контексте инфекций и иммунного ответа известно, что экзосомные EV вызывают специфический ответ у млекопитающих. К таким реакциям относятся выделение цитокинов или изменение восприимчивости к инфекции 7,8,9.

Содержание EV, обогащённых экзосомами, зависит от нескольких факторов, в том числе от типа и состояния клетки, которая ихпроизводит 10,11. Кроме того, их содержание определяет влияние на наивные клетки-реципиенты. В настоящее время используются несколько методов для выделения ЭВ, обогащённых экзосомами, из биологических жидкостей. Распространённые методы включают дифференциальную ультрацентрифугировку, осаждение, иммуноаффинный захват, хроматографию исключения размеров, магнитную изоляцию и микрофлюидную изоляцию.

Дифференциальная ультрацентрифугировка считается одним из самых часто используемых методов12, 13, 14. Метод ультрацентрифугной очистки дорогой и требует значительных технических навыков. Этот метод также приводит к значительной потере электромобилей из-за множества этапов ультрацентрифугирования. Наконец, полученные экзосомные EV не свободны от активных вирусных частиц из-за схожих фенотипических свойств. Это затрудняет очистку электромобилей, обогащённых экзосомами, от вирусно-инфицированных клеточных супернатантов. Поэтому важно разработать оптимизированный протокол для эффективного снижения уровня вируса денге (DENV) до необнаруживаемых уровней в растворе EV, обогащённом экзосомами, поскольку вирусы имеют схожие размеры и плотности сэкзосомами 15,16.

По сравнению с другими широко используемыми методами, этот протокол обладает рядом преимуществ, включая сокращение времени очистки, зависимость от недорогого и широко доступного лабораторного оборудования, а также возможность изолировать электромобили, обогащённые экзосомами, без обнаружения живого вирусного загрязнения. Кроме того, хотя такие методы, как центрифугирование градиента плотности и магнитная изоляция, могут иметь преимущества, включая повышение выхода и более высокую чистоту, эти подходы требуют начального этапа ультрацентрифугирования. Цель этой статьи — представить метод изоляции электромобилей, обогащённых экзосомами, из инфицированных супернатантов без выявления инфекционного вируса с помощью теста на бляшки в проверенных условиях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка среды без экзосом

  1. Подключите фильтр 0,1 мкм к основанию приемника внутри шкафа биологической безопасности класса II (BSC).
  2. Асептически залить на фильтр сыворотку для плода (FBS), инактивированную теплом, и подключить её к вакуумному насосу внутри BSC.
  3. Повторите шаг 1.2 с протоком ещё два раза.
  4. Подготовьте полную среду с содержанием 10% тройной фильтрации FBS, 1% пенициллина/стрептомицина и 1% L-глутамина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Метод тройной фильтрации используется для предотвращения необходимости использования таких приборов, как ультрацентрифуга.

2. Инфекция клеток млекопитающих вирусом денге

  1. Выращивать клетки Vero за ночь в колбе размером T75cm 2 внутри инкубатора тканевой культуры при 37 °Cс содержанием CO2 5%.
  2. На следующий день проверьте, что клетка сливается от 70% до 80%, и инфицируйте клетки мультипликатностью инфекции (MOI) DENV-2 в 5 мл полной среды и инкубируйте при 37 °C с 5%CO2 в течение 2 часов.
  3. Через 2 часа удалите супернатант и промойте флягу 3 раза стерильным физиологическим раствором с буфером фосфатов (PBS).
  4. Добавьте 50 мл полного материала в колбу и инкубуйте при 37 °C с 5%CO2 в течение 4 дней (непосредственно перед наблюдением цитопатических эффектов).

3. Очистка экзосом на основе наборов

  1. Перенесите клеточную культурную среду из колбы в коническую трубку объёмом 50 мл и центрифугуйте при 200 × г в течение 15 минут при комнатной температуре.
  2. Перенесите среду в новую коническую трубку. Добавьте 125 мкл реагента для осадки ЭВ, затем 600 мкл смолы. Вихрь на 10 секунд и оставь его 10 минут внутри BSC при комнатной температуре.
  3. Вихрь ещё 10 секунд и центрифуга при примерно 450 × г в течение 2 минут при комнатной температуре. Перенесите на BSC, сбросьте супернатант и нанесите 600 мкл буфера ресуспензии на гранулу.
  4. Вихрь 10 секунд и инкубация при комнатной температуре в течение 15 минут.
  5. Вихрь ещё 10 секунд и центрифуга примерно при 25 × г в течение 2 минут при комнатной температуре.
  6. Перенесите супернатант в колонку Filter Spin и центрифугите при примерно 4 500 × г в течение 1 минуты при комнатной температуре. Соберите проток электромобилей, содержащих целые экзосомные электромобили, и храните при -80 °C до готовности к использованию.
  7. Убедитесь, что экзосомный электромобиль свободен от живого вируса, проведя анализбляшек 17.
  8. Охарактеризовать обогащённый экзосомами EV с помощью электронной микроскопии для анализа размеров и анализа отслеживания наночастиц для распределения размеров иконцентрации 18.

4. Характеристика экзосомно-обогащённого EV с помощью западного блота

  1. Определите концентрацию белка в EV, обогащённом экзосомами, с помощью анализов, таких как BCA.
  2. Смешайте равные объёмы электромобильного раствора и буфера RIPA и добавьте 4x LDS загрузочный буфер (4:1).
  3. Отделить экзосомно-обогащённые EV белки с помощью геля Bis-Tris 4-12%.
  4. Перенесите белки в нитроцеллюлозную мембрану.
  5. Блокируйте 1 час с использованием 5% обезжиренного молока, растворённого в буфере 1x TBS-Tween при комнатной температуре.
  6. Разведите первичные антитела с помощью 5% обезжиренного сухого молока до разбавления 1:1 1000 и проследите мембрану на наличие экзосомных белков, таких как CD63 и CD9, при 4 °C за ночь.
  7. Удалите первичное антитело и промывайте 5 x 5 минут с 1x TBS-Tween буфером на коромысле.
  8. Разведите вторичное антитело (анти-Rabbit IgG HRP) обезжиренным сухим молоком до разбавления 1:5 000 и инкубуйте мембрану этим раствором в течение 1 часа при комнатной температуре.
  9. Удалите вторичное антитело и промывайте 5 x 5 минут с 1x TBS-Tween буфером на коромысле.
  10. Разработать мембрану с помощью реагента для обнаружения ECL и обнажить белковые сигналы с помощью устройства хемилюминесцентной визуализации.

5. Характеристика ЭВ, обогащённых экзосомами, с помощью трансмиссионной электронной микроскопии

  1. Добавьте 5 мкл образцов экзосом к медным сеткам из 200 сеток с формваром и углеродной оболочкой и дайте высохнуть на воздухе при комнатной температуре.
  2. Окрашивайте сетку 1% водным уранилацетатом в течение 60 секунд и сушите на воздухе.
  3. Захватите изображение с помощью TEM при напряжении 80кВ 18.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы проанализировали изолированный экзосомный EV, описанный в протоколе, с помощью теста на бляшки, чтобы определить, можно ли обнаружить активные частицы DENV-2 в смеси. Как показано на рисунке 1, при тестируемых условиях по сравнению с положительным контролем бляшек не обнаружено. Эти результаты показывают, что инфекционный вирус находился ниже порога обнаружения по анализу бляшек. Анализ бляшек проводился в биологических тр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Недавние достижения в исследовании инфекционных заболеваний показали, что обогащённые экзосомами электромобили, выделяемые из вирусно-инфицированных наивных клеток, играют критическую роль в модулировании иммунного ответа хозяина 7,8,9. Обогащённые экзосомами EV могут либо усиливать иммунную защиту, стимулируя соответствующий противовирусный ответ, либо, наоборот, способствовать уходу от вируса,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликтов интересов, которые нужно раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано грантом Американского общества клинических лабораторных наук (ASCLS) и фондом программы улучшения исследований (REP) Техасского государственного университета

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Антитела, связанные с IgG-HRP против кроликаКлеточная сигнализация7074SВторичные антитела
CD63Клеточная сигнализация52090-ЕПервичное антитело
CD9Клеточная сигнализация13174SПервичное антитело
Набор для очистки экзосомных сред для клеточной культурыНорген60600Набор для очистки экзосом
Вирус денге 2ATCCVR-1584Вирус
DMEMФишер Сайентифик11-995-073Культурные медиа
EMEMATCC30-2003Культурные медиа
Трансмиссионный электронный микроскоп FEI Talos F200XThermofisher Scientific
Эмбриональный бычий EerumНейромикаFBS002Медиа-приложение
Анализатор отслеживания наночастицЧастица Метрикс
Клетки ВероATCCCCL-81Клеточная линия млекопитающих

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. Vesicle formation during reticulocyte maturation: Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes). J Biol Chem. 262 (19), 9412-9420 (1987).
  2. Keller, S., Ridinger, J., Rupp, A. K., Janssen, J. W., Altevogt, P. Body fluid derived exosomes as a novel template for clinical diagnostics. J Transl Med. 9, 86(2011).
  3. Lässer, C., et al. RNA-containing exosomes in human nasal secretions. Am J Rhinol Allergy. 25 (2), 89-93 (2011).
  4. Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int Immunol. 17 (7), 879-887 (2005).
  5. Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (36), 13368-13373 (2004).
  6. Hessvik, N. P., Llorente, A. Current knowledge on exosome biogenesis and release. Cell Mol Life Sci. 75 (2), 193-208 (2018).
  7. Sampey, G. C., et al. Exosomes from HIV-1-infected cells stimulate production of pro-inflammatory cytokines through trans-activating response (TAR) RNA. J Biol Chem. 291 (3), 1251-1266 (2016).
  8. Fleming, A., et al. The carrying pigeons of the cell: Exosomes and their role in infectious diseases caused by human pathogens. Pathog Dis. 71 (2), 109-120 (2014).
  9. Olanrewaju, A. A., Hakami, R. M. The messenger apps of the cell: Extracellular vesicles as regulatory messengers of microglial function in the CNS. J Neuroimmune Pharmacol. 15 (3), 473-486 (2020).
  10. Tauro, B. J., et al. Two distinct populations of exosomes are released from LIM1863 colon carcinoma cell-derived organoids. Mol Cell Proteomics. 12 (3), 587-598 (2013).
  11. Pallet, N., et al. A comprehensive characterization of membrane vesicles released by autophagic human endothelial cells. Proteomics. 13 (7), 1108-1120 (2013).
  12. Coumans, F. A. W., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circ Res. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  13. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  14. Ter-Ovanesyan, D., et al. Framework for rapid comparison of extracellular vesicle isolation methods. Elife. 10, e70725(2021).
  15. Sampey, G. C., et al. Exosomes and their role in CNS viral infections. J Neurovirol. 20 (3), 199-208 (2014).
  16. Jeppesen, D. K., et al. Reassessment of exosome composition. Cell. 177 (2), 428-445.e18 (2019).
  17. Shi, L. Z., et al. N-butanol extract of Glycyrrhizae radix et rhizoma inhibits dengue virus through targeting envelope protein. Pharmaceuticals (Basel). 16 (2), 263(2023).
  18. Alem, F., et al. Exosomes originating from infection with the cytoplasmic single-stranded RNA virus Rift Valley fever virus (RVFV) protect recipient cells by inducing RIG-I mediated IFN-β response that leads to activation of autophagy. Cell Biosci. 11 (1), 220(2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Exosome Enriched EVsExtracellular VesiclesDengue VirusVirus Infected CellsExosome IsolationCell Culture SupernatantWestern BlottingNanoparticle TrackingTransmission Electron MicroscopyImmune Modulation

Похожие статьи