Экспериментальный проект и подготовка сюжета
Эксперимент проводился в июле и начале августа 2023 и 2024 годов. Обычно сезон роста сои в Огайо длится примерно с апреля по ноябрь. Участки, использовавшиеся в сезоне роста 2023 года, находились в округе Клинтон (39.488, -83.769) и округе Юнион (40.296, -83.283), штат Огайо. Участки, использованные в сезоне роста 2024 года, находились в округе Клинтон (39.489, -83.762), округе Пребл (39.893, -84.611) и округе Ликинг (39.948, -82.501), штат Огайо.
Эксперимент использовал рандомизированную полную блоковую конструкцию для контроля пространственных эффектов внутри соевого поля. В каждом блоке было выделено 5 участков для конкретного лечения. Лечение включало две стадии роста (R3 и R5) и два срока применения (в середине утра и в середине дня), а также нелеченный контрольный период. Это привело к следующим четырём применениям пестицидов на участках в каждом блоке: R3 в середине утра, R3 в середине дня, R5 в середине утра, R5 в середине дня. Заявки в середине утра или в середине дня происходили в течение ~2 часов, при этом заявки в середине утра примерно сосредоточены около 10:00, а в середине дня — около 12:30. В дополнение к пяти участкам обработки в каждом блоке, 3 участка были выделены как запасные, которые можно было переставить в обрабатывающие участки в случае плохого роста сои. Стадии растений сои определялись с помощью руководств по этапам, таких как то, опубликованное Extension39 Университета Миннесоты.
Блоки соевых участков были расположены примерно на расстоянии 1,016 м (40 дюймов) друг от друга, чтобы исследователи могли легко переходить между ними. Участки сои имели размеры 1,9 м на 8,5 м (0,0016 га; 6,25 фута на 28 футов), а сорт сои, использовавшийся на всех участках, был Pioneer P35T155E (Кортева, Индианаполис, Индиана). На каждом участке было высажено 6 рядов, расположенные на расстоянии 38 см (15 дюймов). Использовалась норма посева 370 658 семян на гектар (150 000 семян на акро). Все пчёлы, участвовавшие в эксперименте, были из местных популяций. Исследователи не добавляли дополнительных пчёл. Авторы не знали ни о стационарных, ни о мигрирующих пасеках вблизи мест проведения экспериментов. Все материалы, использованные для эксперимента, перечислены в Таблице материалов.
Подготовка пестицидов
Использовались пестициды: фунгицид Fitness (активное вещество 41,8% пропиконазола) и инсектицид Fastac EC (активное вещество 10,9% альфа-циперметрина). Нормы применения пестицидов составляли 6 fl oz/ac (438,47 мл/га) для фунгицида SBI и 3,8 fl oz/ac (277,70 мл/га) для пиретроидного инсектицида. Для подготовки пестицидов к применению 9,375 мл фунгицида SBI и 5,937 мл пиретроидного инсектицида смешали с водой, чтобы получить итоговый объём 3 л в качестве смеси в резервуарах. При приготовлении смеси надевали перчатки, устойчивые к химикатам. Итоговая концентрация фунгицида SBI в резервуаре составила 3,125 мл на л. Итоговая концентрация пиретроидного инсектицида в резервуаре составила 1,979 мл на л.
Применение пестицидов
Эта смесь наносилась на отдельные участки сои внутри каждого блока с помощью специально изготовленного ручного рюкзака-распылителя. Смесь пестицидов применялась на верхней части кроны сои со скоростью ~5 км в час. После начала процесса нанесения пестицидов на конкретную обработку требовалось ~10 минут, чтобы все участки получили применение. Для каждого резервуара на 3 л можно покрыть площадь ~0,027 га смесью пестицидов. Объём распыления на гектар составляет примерно 113 л. Это означает, что на каждый участок было нанесено ~0,18 л смеси из резервуара. Чтобы избежать переноса пестицидов на другие участки из-за ветра, в ветреные дни их применение избегалось. При нанесении пестицида носили полные средства индивидуальной защиты (рубашка с длинным рукавом и длинные брюки, химически стойкие перчатки, обувь и носки и защитные очки). Если после завершения применения пестицидов была избыточная смесь, она утилизировалась согласно рекомендациям государственного агентства по контролю окружающей среды.
Настройка/использование блокфлейты
Общая настройка и использование аудиорекордеров схожи с протоколом, описанным другимиавторами 40. Портативные аудиорекордеры (Sony ICD-PX370) крепились к пластиковым электрическим колышкам забора с помощью ленты с помощью крючка и петли, а на микрофон наносилась открытая пена в качестве лобового стекла. Конусообразный 3D-печатный дождевик был прикреплен к колю в высоте ~3 см над блокфлейтом для защиты от погодных условий.
Затем в центре каждого участка размещались аудиорекордеры за ~24 часа до первого применения пестицидов и оставляли работать не менее 24 часов после каждого применения. Двенадцать регистраторов были развернуты на каждый день применения, по четыре — для каждой группы по времени суток (в середине утра, в середине дня, контроль) как в R3, так и в R5.
Обработка аудиоданных
Все аудиозаписи обрабатывались с помощью инструмента машинного обучения "buzzdetect"41 , который доступен по адресу: https://github.com/OSU-Bee-Lab/buzzdetect. Этот инструмент обучен различать жужжание насекомых от других звуков, часто встречающихся в экспериментальных условиях, таких как автомобили, комбайны или самолёты. Программа не способна отличить жужжащий Apis mellifera от других видов пчёл. Однако buzzDetect способен отличать жужжащие звуки от некоторых других не жужжащих звуков насекомых, хотя отдельные звуки (например, крики сверчков, в основном ночью) всё ещё трудно различить. Более подробные инструкции по запуску buzzDetect можно найти по адресу: https://buzzdetect.readthedocs.io/en/latest/gui/. После аудиоанализа R42 использовался для расчёта частоты обнаружения с интервалами в 1 и 8 часов.
Данные о дефолиации
Оценки листьев были проведены с помощью визуальной оценки листьев верхнего слоя сои на 10 растениях на каждом участке, участвующем в эксперименте, включая все процедуры и необработанные контрольные участки, как рекомендовано Расширением Университета Небраски43. Эти оценки проводились через 24 часа после применения пестицидов в фазе роста R5.
Данные о выходе
Собрали сою, а урожайность измерялась в бушелях на акр с помощью участкового комбайна и системы взвешивания зерна. Измерения выхода были скорректированы до 13% влажности. Участки имели по 6 рядов; только 4 центральных ряда были собраны для измерения выхода.
Статистический анализ
Вся статистика проводилась вR 42. Данные анализировались либо с помощью линейных моделей смешанных эффектов через пакетlme4 44 , либо бета-регрессии через пакет glmmTMB45. Исходные данные BuzzDetect доступны в дополнительных материалах. Для этого исследования были проанализированы три основных типа данных. Средние данные о активности пчёл за 1 и 8 часов после применения пестицидов, урожайность каждого участка сои и ослоение сои на стадии роста R5.
Средняя активность пчёл была получена путём вычисления доли положительного количества времени для жужжания пчёл в 8-часовом или 1-часовом окне. Часовое окно предназначено для оценки острого воздействия применения пестицидов на активность пчёл, тогда как 8-часовое окно — для оценки острых и остаточных эффектов. Остаточные данные о токсичности альфа-циперметрина отсутствуют, но остаточная токсичность для других пиретроидов составляет ~8 часов после первоначальногоприменения 46. Поскольку расчёт активности пчёл является пропорционным, различия в активности анализировались с помощью бета-регрессии, проведённой с помощью пакета R «glmmTMB». Модели изучали средние показатели обнаружения за 1 или 8 часов после применения пестицидов и то, как они различались при сравнении обработанных участков с контролируемыми (условие «опрыскивания»), стадию роста сои, время суток, применяемый пестицид, или стадию роста и время взаимодействия. Сравнение между обработанными и контрольными графиками ссылается на переменную, «распыленную» как в формулах модели за 1, так и на 8 часов.
В модели 1-часового окна фиксированными эффектами были состояние «распыления», стадия роста, время суток, а также этап роста и время взаимодействия. Модель имела как год, так и год по объектам как случайные эффекты. Полная формула модели была следующей:
(1)
Переменная скорость обнаружения отражает средние наблюдения пчёл относительно общего окна наблюдения — в данном случае 1 час. Переменная распыления соответствует тому, был ли участок обработан пестицидами или необработанным контролируемым участком. Переменная time_of_day соответствует тому, были ли обнаружения зафиксированы после утра или после нанесения пестицидов в течение нужного времени. Переменная стадия соответствует стадии роста, на которой были зафиксированы обнаружения.
В модели 8-часового окна фиксированными эффектами были стадия роста и состояние «распыления». 8-часовая модель включает ночные часы для дневного распыления, что делает сравнение между утренним и днём в середине дня. Это связано с тем, что время нанесения в середине дня не проверяет полные 8 часов остаточной токсичности из-за неактивности пчёл вечером, что является значительной частью этих 8-часовых окна. Таким образом, термины «время суток » и «время суток:этап » были исключены из модели. Полная формула этой модели была следующей:
(2)
Переменные — частота обнаружения, распыление и стадия — имеют те же значения в этой формуле, что и в формуле, используемой для часовых окна. Единственное отличие в том, что переменная скорость обнаружения рассчитывается для 8-часового окна. Данные о выходе были проанализированы с помощью линейной модели смешанных эффектов. Модель рассматривала бушели на акр для каждого участка и то, как урожай варьировался в зависимости от обработки. Фиксированным эффектом в модели было лечение, а место и год подбирались как случайные эффекты. Полная формула модели записывается как:
(3)
Ослоение листьев сои измерялось как средний процент отсутствующей площади листьев на каждом участке. Для сравнения влияния времени внесения пестицида на процент дефолиации использовалась линейная модель смешанного эффекта. Фиксированным эффектом в модели было время суток, когда участки распылялись. Сайт и год были подгонены как случайные эффекты. Полная формула модели выглядит так:
(4)
Все протоколы, использованные в этом исследовании, собраны в Дополнительный файл 1.