Методическая статья

Протокол диссоциации отдельных клеток, секвенирования РНК и изоляции миоэпителиальных клеток и фибробластов из старых слёзных и слюнных желез

DOI:

10.3791/70441

⸱

24 апреля 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, Scripps Research Institute

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает оптимизированный метод диссоциации стареющих слёзных желез мышей с целью получения жизнеспособных одиночных клеток для секвенирования одноклеточной РНК. Последовательное ферментативное пищеварение и бережное обращение сохраняют целостность клеток, обеспечивая высококачественные суспензии, подходящие для выделения по типу клеток и транскриптомического анализа изменений, связанных со старением, в популяциях слёзных желез.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Старение слёзной железы (LG) связано с уменьшением секреции слёз и хроническим воспалением, способствующим заболеваниям сухого глаза. Возрастные изменения LG включают инфильтрацию иммунных клеток, повреждение клеток, накопление липидов в ацинарных клетках, отложение внеклеточного матрикса и расширение протоков. Секвенирование одноклеточной РНК (scRNA-seq) предоставляет мощный подход к профилированию клеточной гетерогенности и транскрипционных изменений в период старения; однако получение жизнеспособных одноклеточных суспензий из устаревших тканей LG технически сложно из-за повышенного фиброза, хрупкости клеток и накопления липид. В данном исследовании представлен оптимизированный, воспроизводимый протокол для эффективной диссоциации старых мышиных LG и выделения нескольких типов клеток, подходящий для дальнейшего анализа scRNA-seq. Важно, что этот протокол также применим к молодым слёзным железам, конъюнктиве и другим экзокринным тканям. Рабочий процесс использует поэтапную ферментативную диссоциацию с использованием коллагеназы IV, Dispase II и DNase I для первичного переваривания тканей, затем аккутазы для диссоциации оставшихся клеточных кластеров и окончательное лечение ДНКазой I для получения чистой одноклеточной суспензии. Для минимизации повреждения клеток весь пластиковый материал предварительно покрыт PBS, содержащим бычий сывороточный альбумин, а обработка тканей проводится в контролируемых температурных и перемешиваемых условиях. Лиз эритроцитов и последовательная фильтрация через несколько сита дополнительно повышают чистоту клеток. Изоляция, специфичная по типу клеток, достигается с помощью репортерных мышиных линий в сочетании с флуоресцентно-активированной сортировкой клеток (FACS). Используя мышей Acta2GFP и Pdgfra EGFP, мы успешно изолировали миопителиальные клетки и фибробласты соответственно после иммунного окрашивания антителом EpCAM. FACS позволил отделить популяцию миоэпиттелиальных групп EpCAM⁺/αSMA⁺, тогда как клетки EGFP⁺ мышей PdgfraEGFPпредставляли популяцию фибробластов. Этот протокол обеспечивает высококачественные жизнеспособные суспензии на одной клеточке из старых LG и может легко адаптироваться к другим фиброзным или стареющим экзокриновым тканям, требующим мягкой диссоциации и целенаправленной изоляции клеток.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Слёзная железа (LG) — это экзокриновая тубулоацинарная железа, отвечающая за выделение водного слоя слёзной пленки. На протяжении жизни поверхность роговицы и LG подвергаются воздействию бактериальных и вирусных инфекций, что может привести к системному нарушению эпителиальных клеток, вызову хронических воспалительных реакций, проникновению иммунных клеток в LG и отсутствию регенерации. Старение сопровождается увеличением частоты хронических воспалительныхзаболеваний 1. Среди них заболевание сухого глаза (DED) является одной из десяти самых распространённых причин нарушения зрения во всем мире и является одним из основных факторов снижения самостоятельности, подвижности и повседневного функционирования у пожилогонаселения 2. Основной причиной DED является дисфункцияLG 3.

С возрастом мыши и человеческие LG подвергаются выраженным структурным и функциональным изменениям, включая атрофию ацинарных клеток, расширение протоков, инфильтрацию иммунных клеток, фиброз и липидноеотложение 4,5,6,7. Эти дегенеративные изменения также сопровождаются хроническим воспалением LG и тканевым фиброзом 3,5,8,9. Несмотря на явную связь между старением и патологией LG, молекулярные и клеточные механизмы, вызывающие эти изменения, остаются плохо изученными.

Секвенирование одноклеточной РНК позволяет всестороннее профилировать популяции клеток и их транскрипционные изменения ввозрасте 10 лет. Этот подход позволяет объективно выявлять различные типы клеток и состояния внутри слёзной железы, показывая, как старение изменяет экспрессию генов, инфильтрацию иммунных клеток и эпителиально-мезенхимальные взаимодействия.

В настоящее время доступно множество методов диссоциации тканей, включая механические методы диссоциации11 и протоколы с использованием тёплого ферментативного пищеварения при 37 °C с использованием ферментов, таких как коллагеназа, диспаза илитрипсин-12. Были описаны различные стратегии диссоциации для широкого спектра тканей, включая печень, лёгкие, почки, сердце и множественные опухоли 13,14,15. Однако подготовка жизнеспособных одноклеточных суспензий из старой ткани слёзных желез остаётся технически сложной из-за повышенного фиброза и клеточной хрупкости. Также, как мы уже сообщали ранее, восстановление хрупких ацинарных клеток может быть сложным, поскольку изменения проницаемости мембраны, связанные с диссоциацией, могут увеличить выделение окружающей среды РНК из этих крупных секреторных клеток, способствуя формированию фонового сигнала в нижних наборах одноклеточныхданных 16. Хотя несколько исследований сообщали о scRNA-seq атласах стареющих слёзных желез, качество этих наборов данных было ограничено неоптимальными методами диссоциации, что приводит к меньшей добыче эпителиальных клеток по сравнению со стромическими популяциями. Здесь мы представляем подробный, оптимизированный протокол эффективной диссоциации пожилой мышиной LG и выделения отдельных популяций клеток для анализов scRNA-seq и массового анализа РНК-секвенции (рисунок 1). Этот подход предоставляет мощный инструмент для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе возрастной дисфункции слёзных желез.

Протокол позволяет создавать высококачественные жизнеспособные суспензии для одной клетки из старых слёзных желез, обеспечивая надёжную основу для всесторонних транскриптомных анализов. Он позволяет детально идентифицировать и охарактеризовать молекулярную характеристику различных популяций клеток, включая миоэпиттелиальные клетки, фибробласты и другие типы эпителиальных и стромальных клеток, подвергающихся возрастным изменениям. Оптимизированный рабочий процесс сохраняет целостность клеток и минимизирует транскрипционные артефакты, вызванные стрессом, обеспечивая точное представление состояний клетки in vivo. Кроме того, методология широко применима и может быть адаптирована к другим экзокриновым железам или фиброзным тканям, где мягкая диссоциация тканей и точная изоляция отдельных популяций клеток имеют решающее значение для дальнейших исследований одноклеточных клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколами, утверждёнными Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) в Институте исследований Скриппса (протокол No 08-0123; утвержден 29 августа 2023 года). Уход за животными в Институте исследований Скриппса аккредитован Международной ассоциацией по оценке и аккредитации ухода за лабораторными животными (AAALAC). Мыши содержались в стандартном цикле 12 часов света и 12 часов темноты с временным предоставлением пищи и воды. Для экспериментов использовались трансгенные линии мышей PdgfraEGFP и Acta2GFP . Подробная информация о линиях для мышей приведена в разделе «Таблица материалов».

1. Общие соображения

  1. Соблюдайте универсальные меры предосторожностиNIH 17 при обращении с биологически опасными материалами и тканями животных. Выполняйте все работы с животными в соответствии с утверждёнными протоколами IACUC и установленными уровнями биобезопасности животных.
  2. Соблюдайте стандартные лабораторные меры безопасности: избегайте пипетирования изо рта, минимизируйте использование острых предметов, используйте биологический защитный шкаф для процедур с генерацией аэрозолей, носите соответствующие СИЗ, утилизируйте острые изделия в контейнеры, устойчивые к проколам, а также правильно маркируйте и дезинфицируйте все биологически опасные отходы перед утилизацией.
  3. Регулярно очищайте рабочие поверхности и оборудование с помощью соответствующих дезинфицирующих средств (например, 10% отбеливателя).
  4. Выполните все этапы центрифугации при 4 °C в предварительно охлаждённой охлаждённой центрифуге для сохранения жизнеспособности клетки и минимизации температурного стресса.
  5. Оптимизировать настройки потокового цитометра и сортировщика клеток для конкретной конфигурации прибора и корректировать параметры для каждого сопряжённого антитела и флуорофора с использованием соответствующих контрольных образцов. Используйте один и тот же цитометр и сортировочный прибор с фиксированными, оптимизированными настройками на протяжении всей экспериментальной серии, чтобы минимизировать вариабельность.
  6. Подготовьте выбранные растворы до одного дня вперёд и правильно храните до использования. Все растворы готовьте в стерильных условиях в шкафу для биобезопасности.
  7. Держать растворы с содержанием Ca2+/Mg отдельно от буферов, содержащих ЭДТА, чтобы предотвратить хелирование во время ферментативных этапов. Все реагенты, необходимые для этой процедуры, показаны в таблице материалов.

2. Пластиковая посуда

  1. В стерильных условиях предварительно наносите покрытие на чаши, трубки и шприцы с 1x PBS + 1% BSA в течение 1 часа при комнатной температуре (RT). Аспирируйте и сохраняйте стерильное состояние до использования.
  2. Предварительно нанесите наконечники пипетки. Аспирируйте и нанесите 1x PBS + 1% BSA три раза каждым наконечником, чтобы покрыть внутреннюю поверхность. Поместите покрытые наконечники обратно в стерильную коробку и дайте им высохнуть на ночь в стерильном инкубаторе. Используйте эти заранее покрытые наконечники на следующий день во время процедуры изоляции клеток.

3. Решения и буферы

  1. Запас DNase I (5 мг/мл)
    1. Подготовьте 150 мМ NaCl из приклада 5M NaCl и стерильно фильтруйте раствор.
    2. Добавьте 1 M CaCl₂ в фильтрованный раствор NaCl объемом 150 мМ, чтобы получить окончательную концентрацию 5 мМ CaCl₂.
    3. Ресуспензировать 100 мг ДНКазы I в 20 мл буфера 150 мМ NaCl / 5 мМ CaCl₂ для получения раствора ДНКазы I с содержанием 5 мг/мл.
    4. Приготовьте 500 мкл аликвотов и храните их при −20 °C до 6 месяцев. Избегайте повторяющихся циклов замораживания и оттаивания, чтобы предотвратить потерю активности ферментов.
  2. Среда для пищеварения
    1. За день до эксперимента приготовьте смесь среднего основа, смешав DMEM/F12 с 0,5% BSA, и отфильтруйте её.
    2. Добавьте 1M HEPES и 1M CaCl₂ в базовую среду DMEM/F12 / 0,5% BSA, чтобы получить конечные концентрации 15 мМ и 3 мМ соответственно.
    3. Добавьте все следующие ферменты непосредственно перед применением: коллагеназу IV (1 мг/мл; 125 U/мл), Dispase II (2,5 мг/мл; 1,25 U/мл) и DNase I (20 U/mL; 0,05 мг/мл из 5 мг/мл).
  3. Блокирующая среда 1 (BM1)
    1. Добавьте 1M HEPES и 0,5M EDTA к 1x HBSS, чтобы получить конечные концентрации 15 мМ и 3 мМ соответственно.
  4. Блокирующая среда 2 (BM2)
    1. Добавьте FBS и 1M HEPES в DMEM/F12, чтобы получить конечные концентрации 10% и 15 мМ соответственно.
  5. Среда для обработки ДНКазой
    1. За день до эксперимента подготовьте базовую среду, смешав 1x HBSS с 0,5% BSA, и отфильтруйте.
    2. Добавьте 1M HEPES, 1M CaCl₂ и 1M MgCl₂ в базовую среду 1x HBSS / 0,5% BSA для получения конечных концентраций 10 мМ, 1,5 мМ и 2 мМ соответственно.
    3. Непосредственно перед употреблением добавьте в приготовленную смесь DNase I (200 U/mL; 0,5 мг/мл из бульона 5 мг/мл).
  6. Блокирующая среда 3 (BM3)
    1. Используйте ту же фильтрированную базовую среду 1x HBSS / 0,5% BSA и добавьте 1M HEPES и 0,5M EDTA для получения конечных концентраций 10 мМ и 1 мМ соответственно.
  7. Блокирующая среда 4 (BM4)
    1. Используйте ту же фильтрированную базовую среду 1x HBSS / 0,5% BSA и добавьте 1M HEPES для получения конечной концентрации 10 мМ.
  8. Буфер FACS
    1. За день до эксперимента подготовьте базовую среду, смешав 1x DPBS с 0,5% BSA, и отфильтруйте.
    2. Добавьте 1M HEPES и 0,5M EDTA до 1x DPBS / 0,5% BSA, чтобы получить конечные концентрации 25 mM и 1 mM соответственно.
  9. Среда для scRNAseq (MSC)
    1. За день до эксперимента подготовьте среду, смешав 1x DPBS с 0,4% BSA и отфильтруйте.

4. Извлечение тканей и микродиссекция (~ 40 - 50 мин)

  1. Анестезия мыши изофлураном и эвтаназия при вывихе шейки матки в соответствии с институциональными рекомендациями IACUC.
  2. Используйте тонкие пинцеты и ножницы, чтобы разрезать кожу между глазом и ухом и аккуратно убратьте, чтобы обнажить слёзную железу.
  3. Чтобы изолировать железу, слегка приподнимите её с помощью тупого щипца и аккуратно отдельте окружающую соединительную ткань, аккуратно дразнив её круговыми движениями. Границы слёзной железы хорошо видны, что позволяет легко отделиться от соседних тканей, включая околоушную железу.
  4. Перенесите слёзную железу (каждая железа весит примерно 10-25 мг, в зависимости от веса, пола и возраста мыши) в чашку Петри диаметром 35 мм, содержащую 2 мл холодного 1x PBS на льду. Под расчленительным микроскопом удалите оставшийся жир и аккуратно откройте соединительную ткань с помощью двух щипцов.
  5. Подтвердите маркировку клеток, исследуя небольшой фрагмент ткани под флуоресцентным микроскопом и проверяя ожидаемый репортер или флуоресцентный сигнал перед переходом к ферментативному перевариванию.
  6. Поставьте стерильную чашу Петри диаметром 35 мм на лёд и добавьте 800-1000 мкл холодного 1x PBS (объём, отрегулированный под размер железы) в центр тарелки. Перенесите одну слезную железу в 1x PBS.
  7. Используя два стерильных скальпеля, мелко измельчите железу на мелкие фрагменты, пока она не достигнет мягкой, пастообразной консистенции. Убедитесь, что фрагменты ткани остаются погружёнными в PBS на протяжении всего процесса измельчения, но не позволяйте им свободно плавать по чашке.
  8. Соберите фрагменты ткани с одной стороны тарелки, аспирируйте остаточный PBS и промите фрагменты 1 мл свежего холодного PBS.
  9. Переместите промытые фрагменты ткани в пластину с 6 лунками, содержащую по 2 мл предварительно нагретой среды на каждую яму. Храните пластину на льду до тех пор, пока все образцы не будут обработаны.

5. Первое ферментное пищеварение (~1,5 - 2 часа)

  1. Инкубировать тарелку в встряхивающей водяной бане при 37 °C, 60 об/мин в течение 30 минут.
  2. Аккуратно тритурируйте ткань 15 раз с помощью широкоотворного наконечника 1 мл, затем верните пластину в трясущую водяную ванну при температуре 37 °C, 60 об/мин ещё на 30 минут.
  3. Аккуратно тритурируйте образец 10 раз с помощью обычного наконечника на 1 мл, затем верните пластину в встряхивающую водную ванну при 37 °C, 60 об/мин ещё на 30 минут.
  4. Аккуратно тритурируйте образец 10 раз и переместите суспензию клетки в микроцентрифугные трубки Dolphin объемом 2 мл.
  5. Добавьте по 1 мл холодного BM1 в каждую ячейку пластины, чтобы собрать оставшуюся пищеварительную среду, содержащую остаточные клетки. Поставьте пластину на лёд до следующего этапа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если на этом этапе всё ещё наблюдаются крупные клеточные кластеры или фрагменты ткани, удлините каждый этап инкубации ещё на 10-20 минут. Не превышайте указанное количество проходов тритурации (максимум 10-15 мягких проходов), так как дополнительный механический стресс может снизить жизнеспособность клетки.

6. Прекращение ферментативной активности и первичные промывки (~ 15 мин)

  1. Центрифугуйте трубки с суспензией ячейки при 300 × г в течение 5 минут при 4 °C.
  2. Отбросьте супернатант. Перенесите BM1 из каждой ямы начальной пластины (содержащей остаточные клетки) в соответствующую трубку и аккуратно подвесьте клеточные гранулы.
  3. Промыйте каждую колодцу дополнительно 600 мкл холодного BM1 и соедините промывку с соответствующей трубкой, чтобы собрать все оставшиеся элементы.
  4. Аккуратно подвесьте ячейку, снова центрифугуйте при 300 × г в течение 5 минут при 4 °C и выбросьте супернатант.

7. Обработка аккутазой и ДНКазой (~ 30–35 мин)

  1. Добавьте 1 мл аккутазы к клеточным гранулам и аккуратно взвешуйте. Инкубировать трубку всего 5-10 минут при 37 °C и 60 об/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время инкубации положите трубку на бок, чтобы клетки не осаждались и не прилипали к дну.
  2. Аккуратно тритурируйте 10 раз с помощью наконечника пипетки объемом 1 мл.
  3. Добавьте 1 мл холодного BM2, чтобы прекратить ферментативную реакцию путём разбавления аккутазы.
  4. Центрифугуйте при 300 × г в течение 5 минут при 4 °C и выбросьте супернатант.
  5. Суспензировать клетки в среде для обработки ДНКазой, заполняя пробирку до верхней части.
  6. Инкубировать 10 минут на RT, аккуратно подвешивать через 5 минут.
  7. Тем временем предварительно смочили сито для ячеек диаметром 70 мкм с 1 мл BM3, установленного поверх конической трубки объёмом 15 мл.
  8. Перенесите подвеску ячейки на сито.
  9. Прополосните оригинальную трубку для сбора 1 мл BM3 и перенесите промывку на то же сито.
  10. Промой сито дополнительно 5 мл BM3.

8. Проверка подсчёта клеток и жизнеспособности

  1. Возьмите 10 мкл фильтрованной ячейки в BM3 и смешайте с 10 мкл Trypan Blue. Определите концентрацию и жизнеспособность ячеек с помощью исключения Trypan Blue и количественно измеряйте с помощью ручного подсчёта или автоматического счётчика ячеек (например, автоматизированный счётчик ячеек Countess 3). Продолжайте только если жизнеспособность достигает необходимого порога для последующих приложений (обычно ≥70-80%).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При расчёте выхода рассмотрите общий объём ~7-9 мл в трубке объёмом 15 мл.
  2. Двигайтесь согласно следующему применению. Для scRNA-seq продолжайте к секции 9. Для сортировки клеток на основе цитометрии потока продолжайте к секции 10.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий процесс scRNA-seq включает лизис эритроцитов и удаление магнитных мертвых клеток для уменьшения количества мусора и окружающей РНК, а также улучшения качества данных. Однако эти шаги могут искажать представление типов клеток, преимущественно затрагивая хрупкие или редкие эпителиальные популяции, включая ацинарные клетки. Для сортировки на основе цитометрии потока эти шаги были опущены для максимизации восстановления и сохранения эпитопов поверхности клеток. Выбор рабочих процессов должен основываться на экспериментальных целях, с приоритетом качества данных для восстановления scRNA-seq или клеток и жизнеспособности для сортировки и последующих приложений.

9. Подготовка клеток для scRNA-seq (~ 1 - 1,5 ч)

  1. Приготовьте 1x раствор эритроцитов, восстановив 10x раствор с миллиQ водой.
  2. Центрифугуйте 15-мл трубку с суспензией ячейки при 400 × г в течение 5 минут при 4 °C и сбросьте супернатант.
  3. Суспензировать клеточную гранулу в буфере 5 мл 1x эритроцитов и инкубировать 5 минут при RT.
  4. Снова центрифугуйте при 300 × г в течение 5 минут при 4 °C и выбросьте супернатант.
  5. Суспензируйте клеточную гранулу в холодном BM4 объёмом 2 мл.
  6. Возьмите 10 мкл суспензии фильтрованной клетки в BM4 и смешайте с 10 мкл Trypan Blue для оценки концентрации и жизнеспособности клеток.
  7. Предварительно увлажните сито MACS 30 мкм с 1 мл 1x HBSS и отфильтруйте подвеску ячейки через сито в трубку объемом 15 мл.
  8. Промыйте предыдущую трубку для сбора 2 мл холодного BM4 и пропустите промывку через то же сито в 15 мл.
  9. Промой сито дополнительно 10 мл холодного BM4.
  10. Центрифугуйте трубку на 15 мл при 400 × г на 5 минут при 4 °C и полностью удалите супернатант.
  11. Аккуратно подвесьте гранулу в 100 мкл микрошариков MACS и инкубируем 15 минут при RT.
  12. Тем временем подготовьте 1x Binding Buffer (BB) из Dead Cell Removal Kit с использованием стерильной двойной дистиллированной воды.
  13. Промыть столбец MACS MS с 500 мкл 1x BB для уравновешения.
  14. Добавьте 400 мкл BB в образец, подвесьте клетки микрошариками и нанесите весь объём на уравновешенный столбец MS. Соберите проток в трубку объемом 15 мл.
  15. Промыйте колонну четыре раза с по 500 мкл BB каждая, собирая все проточные доли.
  16. Центрифугуйте собранный поток при 400 × г в течение 5 минут при 4 °C и сбросьте супернатант.
  17. Суспензировать ячейки в буфере MSC объемом 400 мкл и перенести подвеску в трубку объёмом 1,5 мл.
  18. Промывайте предыдущую трубку буфером MSC 700 мкл и сливайте промывку вместе с образцом.
  19. Центрифугуйте при 400 × г в течение 5 минут при 4 °C и сбросьте супернатант.
  20. Суспензируйте ячеточную гранулу в буфере MSC с помощью широкоотверсного наконечника до окончательного объёма около 1,5 мл.
  21. Снова центрифугуйте при 400 × г в течение 5 минут при 4 °C и выбросьте супернатант.
  22. Оставьте ~100 мкл супернатанта, аккуратно суспензируйте гранулу и пересчитайте клетки, смешав 6 мкл с 6 мкл Trypan Blue.
  23. Отрегулировать итоговый объём с помощью буфера MSC для достижения 700-1200 клеток/мкл и пересчитать ячейки для подтверждения концентрации клеток.
  24. Обеспечить жизнеспособность клеток после лизиса эритроцитов и удаления мертвых клеток ≥ 70% (обычно 70-95%) перед загрузкой для обработки 10x хрома (Chromium Single Cell 3' Solution V3).
  25. Применяйте базовые критерии контроля качества scRNA-seq: nUMI > 500, nGene > 200 и долю митохондриальных генов <15%. Используйте разрешительный порог митохондрий (15%) для сохранения эпителиальных популяций с более высокой метаболической активностью. Включайте только клетки, соответствующие всем критериям контроля качества, в последующие анализы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти пороги качества представляют собой примерные значения, полученные из наших наборов данных (дополнительный рисунок 1) и были представлены в нашей предыдущей публикации18.

10. Подготовка ячеек для сортировки клеток на основе потоковой цитометрии (~ 1 - 1,5 часа)

  1. Для выделения MEC и фибробластов на основе цитометрии потока использовались репортерные линии мышей PdgfraEGFP и Acta2 GFP соответственно, чтобы обеспечить точную идентификацию каждой популяции.
  2. Центрифугуйте 15-мл трубку с ячейкой суспензией при 400 × г в течение 5 минут при 4 °C и убрать супернатант.
  3. Ресуспензировать клеточную гранулу в холодном буфере FACS до конечной концентрации 5 x 10⁵ — 2 x 106 элементов на 100 мкл.
  4. Подготовьте контроль, необходимые для компенсации FACS: отрицательный контроль — неокрашенные клетки от мыши дикого типа, фоновый флуоресцентный контроль — неокрашенные клетки мышей Acta2GFP и PdgfraEGFP , одиночный контроль — клетки дикой мыши, окрашиваемые индивидуально каждым антителом, использованным в эксперименте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого контрольного образца используйте не менее 1 × 10⁵ ячейки, ресуспендированные в 100 мкл буфера FACS.
  5. Добавьте FcBlock (1:100) и инкубуйте 5 минут на льду.
  6. Добавьте моноклональное антитело CD326 (EpCAM)-APC (1:100) или CD140a (PDGFRα) (1:100). Инкубировать 45 минут на льду, защищённый от света.
  7. Аккуратно возвращайте суспендирование клеток каждые 15 минут во время инкубации антител.
  8. Заполните каждую трубку до верха холодным буфером FACS и центрифугите при 300 × г на 5 минут при 4 °C.
  9. Подготовьте рабочее решение FxCycle (1:1000) в буфере FACS.
  10. Повторная суспензия образцов в 1 мл и контроль в 500 мкл холодного буфера FACS с помощью FxCycle.
  11. Перенесите все образцы в пробирки FACS и храните их на льду, защищённых от света.
  12. Немедленно направляйтесь к центру цитометрии потока для сортировки. Собирайте отсортированные клетки в буфер FACS, среду культуры, буфер лизиса или RNAlater, в зависимости от дальнейших применений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки приборов (например, размер и давление сопла) и частота событий зависят от конфигурации сортировщика и целевой популяции ячеек; поэтому рекомендуется провести предварительный пилотный запуск для определения оптимальных параметров для каждого эксперимента.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Диссоциация стареющих экзокринных желез затруднена из-за накопления липидов и обширного отложения ЭКМ. Стареющие железы демонстрируют выраженную лимфоцитарную инфильтрацию и выраженное расширение протоков внутрисветовым материалом, что отражает структурные и воспалительные изменения, усложняющие диссоциацию тканей. Слёзная железа — это экзокринный орган, состоящий из трёх основных типов эпителиальных клеток: ацинарных, протоковых и миоэпиттелиальных клеток. Ацинарные клетки производят во...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы оптимизировали и оценили значительно улучшенный протокол для получения суспензий из экзокринных тканей, сосредоточившись на слёзной железе. Используя этот подход, мы получили чистые, высококачественные суспензии с одной клеток как из старых, так и из молодых LG, подходящие для секвенирования отдельных клеток и других последующих применений.

Несмотря на наличие многочисленных протоколов диссоциации тканей, нам было необходимо модифицировать и оптимизи...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами 5R01EY026202, R01EY035333; грантами Национального института стоматологических и черепно-лицевых исследований (NIDCR) R01DE031044, 2R01DE014756, и грантом Национального института рака (NCI) 5R01CA271500.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<Сильный>Материал
BSA Сигма-ОлдричA4919
CaCl2 (1  Решение M)BioVisionB1010-100
Коллагеназа IVСигма-ОлдричC5138
Набор для удаления мёртвых клетокMiltenyi biotec130-090-101
Набор для удаления мёртвых клетокMiltenyi biotec130-090-101
Dispase IIРошC756V28
DNase IСигма-ОлдричDN25-100 МГ
DPBS Gibco, Thermo Fisher Scientific14190-144
Сыворотка для плода, ультранизкий IgGGibco# 16250078
Сбалансированный сольный раствор Хэнка (HBSS)Корнинг (Thermo Fisher Scientific)21-022-CV
HEPES (1  Решение M)Сигма-ОлдричH0887
Раствор изофлуранаКовертус# 11695067772
MACS® SmartStrainers (30 & micro; m)Miltenyi biotec130-098-458
MACS® SmartStrainers (70 и микро; m)Miltenyi biotec130-110-916
Средний/F12 (DMEM/F12)МиллипорDF-042-B
MgCl2 1MСигма-ОлдричM1028-100ML
Колонки MSMiltenyi biotec130-042-201
NaCl (запас 5M)Invitrogen™AM9759
Таблетки с фосфатным буфером физиологического раствора (PBS)Сигма-ОлдричP8920-500ML
Раствор для лиза эритроцитав (10 раз;)Miltenyi biotec130-094-183
StemPro Accutase Gibco, Thermo Fisher ScientificA1110501
Раствор Trypan Blue, 0,4%Gibco, Thermo Fisher Scientific15250061
Ультрачистый ЭДТА (0,5 м, pH 8,0)Инвитроген15575020
<сильные>антитела
CD140a (PDGFRA) Моноклональное антитело (APA5), APC-eFluor™ 780, Rat / IgG2a, каппаeBioscience47-1401-82; RRID:AB_2784706
FcBlock (CD16/CD32 блокировщик Fc)BD Biosciences 553141; RRID:AB_394656
FxCycle™ Фиолетовое пятноТермо Фишер СайентификF10347
Крыса CD326 (EpCAM)-моноклональное антитело APC (G8.8), крыса IgG2a, каппаeBioscience17-579182; RRID:AB_2716944
<сильные>мыши
Acta2GFP  Добрый подарок от доктора Иво КалайзичаПМИД: 18571490
PdgfraEGFP  - B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/JЛаборатория ДжексонаRRID:IMSR_JAX:007669
<Сильно>Снаряжение
Invitrogen™   Графиня и торговля; 3 Автоматизированный счётчик ячеекFisher ScientificA49862; RRID:SCR_026963

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Guo, J., et al. Aging and aging-related diseases: from molecular mechanisms to interventions and treatments. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 391(2022).
  2. Zhang, X., Wang, L., Zheng, Y., Deng, L., Huang, X. Prevalence of dry eye disease in the elderly: A protocol of systematic review and meta-analysis. Medicine (Baltimore). 99 (37), e22234(2020).
  3. Donthineni, P. R., et al. Aqueous-deficient dry eye disease: Preferred practice pattern guidelines on clinical approach, diagnosis, and management. Indian J Ophthalmol. 71 (4), 1332-1347 (2023).
  4. Yuksel, S., et al. Aging Affects Lipid Homeostasis in Lacrimal Glands by Upregulating Lipogenesis and Changing Its Specificity. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (13), 1(2025).
  5. Galletti, J. G., et al. Ectopic lymphoid structures in the aged lacrimal glands. Clin Immunol. 248, 109251(2023).
  6. Delcroix, V., et al. Lacrimal Gland Epithelial Cells Shape Immune Responses through the Modulation of Inflammasomes and Lipid Metabolism. Int J Mol Sci. 24 (5), 4309(2023).
  7. Mauduit, O., et al. Spatial transcriptomics of the lacrimal gland features macrophage activity and epithelium metabolism as key alterations during chronic inflammation. Front Immunol. 13, 1011125(2022).
  8. Prasad, D., et al. Assessing the Independent and Combined Effects of Hyperosmolarity and Inflammatory Stress on Human Corneal Epithelial Cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (13), 47(2025).
  9. Scholand, K. K., et al. Heterochronic Parabiosis Causes Dacryoadenitis in Young Lacrimal Glands. Int J Mol Sci. 24 (5), 4897(2023).
  10. Molla Desta, G., Birhanu, A. G. Advancements in single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics: transforming biomedical research. Acta Biochim Pol. 72, 13922(2025).
  11. Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator. J Vis Exp. (29), e1266(2009).
  12. Jankelow, A., Almeida-Porada, G., Atala, A., Sawyer, S. W., Porada, C. D. Recent advancements in tissue dissociation techniques for cell manufacturing single-cell analysis and downstream processing. Stem Cells Transl Med. 14 (11), szaf055(2025).
  13. Duong, A., et al. A Rapid Human Lung Tissue Dissociation Protocol Maximizing Cell Yield and Minimizing Cellular Stress. Am J Respir Cell Mol Biol. 71 (5), 509-518 (2024).
  14. Koenitzer, J. R., Wu, H., Atkinson, J. J., Brody, S. L., Humphreys, B. D. Single-Nucleus RNA-Sequencing Profiling of Mouse Lung: Reduced Dissociation Bias and Improved Rare Cell-Type Detection Compared with Single-Cell RNA Sequencing. Am J Respir Cell Mol Biol. 63 (6), 739-747 (2020).
  15. Ikeuchi, T., et al. Dissociation of murine oral mucosal tissues for single cell applications. J Immunol Methods. 525, 113605(2024).
  16. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130(2020).
  17. Kahwaji, N. Universal Precautions. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2024).
  18. Delcroix, V., et al. The First Transcriptomic Atlas of the Adult Lacrimal Gland Reveals Epithelial Complexity and Identifies Novel Progenitor Cells in Mice. Cells. 12 (10), 1435(2023).
  19. Mauduit, O., et al. A closer look into the cellular and molecular biology of myoepithelial cells across various exocrine glands. Ocul Surf. 31, 63-80 (2024).
  20. Zyrianova, T., Basova, L. V., Makarenkova, H. P. Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands. J Vis Exp. (148), e59602(2019).
  21. Montanari, M., et al. Automated-Mechanical Procedure Compared to Gentle Enzymatic Tissue Dissociation in Cell Function Studies. Biomolecules. 12 (5), 701(2022).
  22. Liang, F., et al. Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques. J Immunol Methods. 425, 69-78 (2015).
  23. Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
  24. Reichard, A., Asosingh, K. Best Practices for Preparing a Single Cell Suspension from Solid Tissues for Flow Cytometry. Cytometry A. 95 (2), 219-226 (2019).
  25. Volovitz, I., et al. A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells. BMC Neurosci. 17 (1), 30(2016).
  26. Lai, T. Y., et al. Different methods of detaching adherent cells and their effects on the cell surface expression of Fas receptor and Fas ligand. Sci Rep. 12 (1), 5713(2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Single Cell RNA SequencingLacrimal Gland DissociationMyoepithelial Cell IsolationFibroblast IsolationFlow CytometryAged Lacrimal GlandTissue DigestionCell SortingEpCAM ImmunostainingPDGFR Alpha Fibroblasts

Похожие статьи