Методическая статья

Синтез, инкапсуляция гемоглобина и биортогональная ПЭГилирование в иерархически пористых наночастицах UiO-66 для доставки кислорода

DOI:

10.3791/70445

⸱

8 мая 2026 г.

 , 
1Department of Health Technology, Technical University of Denmark

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол подробно описывает синтез, инкапсуляцию гемоглобина и поверхностное PEGилирование иерархически пористых наночастиц UiO-66, предназначенных для доставки кислорода. Процедура сочетает в себе инженерию дефектов с биортогональной конъюгацией, способствующей деформации, для создания высокопроницаемых и физиологически стабильных носителей, подходящих для биомедицинских применений.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Носители кислорода на основе гемоглобина (HBOCs) являются важной платформой для доставки кислорода с целью снижения гипоксии в различных биомедицинских контекстах. Однако свободный гемоглобин (Hb) нестабилен и вазоактивен вне эритроцитов. Здесь представлен воспроизводимый, масштабируемый пошаговый протокол для изготовления иерархически пористых наночастиц UiO-66 (HP-UiO-66 NP), которые инкапсулируют Hb и стабилизируются биоортогональными оболочками полиэтиленгликоля (PEG). Иерархическая мезопорость формируется модуляцией додекановой кислоты и последующим кислотным промывлением, что приводит к получению NP HP-UiO-66-NH₂ с сохраненной кристаллинностью и комбинированными изотермами типа I/IV N2 . Поверхностные амины преобразуются в азиды (HP-UiO-66-N₃ NPs), что позволяет безкатализаторно стимулированному алкиназидному циклоаддации (SPAAC) образовывать Hb@HP-UiO-66-PEG NP. Рабочий процесс включает: i) инженерию дефектов NP UiO-66-NH₂, ii) удаление модулятора, iii) установку азида, iv) загрузку Hb в буферизованных водных средах и v) PEGилирование с помощью SPAAC. Критические экспериментальные параметры, стандартные режимы отказа и стратегии устранения неисправностей подробно описываются на каждом этапе для повышения межлабораторной воспроизводимости. Протокол подходит для производства NP HP-UiO-66-NH₂ на партию по граму. Эффективность инкапсуляции ~35% (нагрузочное содержание ~24 массы%) для Hb достигается при мягких условиях, при редисперсируемых NP с гидродинамическим диаметром ~140 нм и низкой полидисперсностью после PEGилирования. Комплексная физико-химическая характеристика подтверждает целостность каркаса, мезопорость, успешную поверхностную химию и диффузную корону ПЭГ шириной до ~12 нм. Функциональные анализы показывают обратимое оксигенирование/деоксигенацию инкапсулированного Hb, что указывает на сохраняющуюся способность транспортировать кислород. PEGилирование значительно повышает коллоидную и структурную стабильность в физиологическом растворе, HEPES и сыворотке, предотвращая деградацию, вызванную фосфатами, наблюдаемую у неPEGилированных аналогов. Интегрируя подробные рекомендации по устранению неполадок, видео-визуализацию критических шагов и параметры масштабирования, этот модульный протокол предоставляет надёжный и доступный путь к HBOC на основе металлической органической структуры. Стратегия легко адаптируется к другим биомакромолекулам или ферментам, требующим защитных, но доступных микросред для терапевтического применения.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Достаточное насыщение кислородом критически важно для эффективной терапии и восстановления тканей в различных биомедицинскихусловиях. 1. При травматологии и хирургическом кровоизлиянии тяжёлая потеря кислорода может быть угрожающей жизни, что подчёркивает необходимость безопасных заменителей крови при отсутствии донорскойкрови 2. В онкологии области гипоксических опухолей ограничивают эффективность кислородозависимых методов лечения, а дополнительная доставка кислорода может значительно повысить терапевтическуюэффективность 3,4,5,6. Кислород также играет центральную роль в заживлении ран, где повышенная доступность кислорода способствует ангиогенезу и восстановлениютканей 7. Аналогично, при ишемических состояниях и при трансплантации органов носители кислорода могут уменьшить гипоксическое повреждение и повысить жизнеспособность и восстановлениетканей 8,9.

Носители кислорода на основе синтетического гемоглобина (Hb) (HBOCs) представляют собой перспективный подход к снижениюгипоксии 10. Однако Hb вне эритроцитов (эритроцитов) по своей природе нестабилен и быстро диссоциируется на димеры, которые могут вызывать нефротоксичность, окисляющее повреждение и вазоконстрикцию из-за поглощения оксидаазота. Для смягчения этих проблем были разработаны стратегии инкапсуляции для стабилизации Hb внутри биосовместимых наноносителей, таких каклипосомы 12,полимеромы 13 и полимерные наночастицы (NP)14,15,16,17. Хотя эти системы повышают устойчивость Hb, достижение высокой эффективности инкапсуляции при сохранении естественной функции связывания кислорода остаётсясложным 18. Кроме того, окислительное преобразование в метгемоглобин и утечку гема может ухудшить переносимостькислорода 19. Быстрая клиренс и преждевременная утечка Hb дополнительно ограничивают время кровообращения и клиническуютрансляцию 20.

Металлоорганические каркаси (MOF) недавно стали универсальными наноплатформами для доставки лекарств и биомакромолекул благодаря своей кристаллической архитектуре, большой площади поверхности и регулируемойпористости 21. Состоящие из металлических узлов, координированных с органическими линкерами, MOF обеспечивают молекулярную диффузию и структурную настройку, что делает их привлекательными для биомедицинских применений. Однако большинство MOF имеют преимущественно микропористые полости (<2 нм), которые сильно ограничивают постсинтетическую инкапсуляцию макромолекул, таких как белки, нуклеиновые кислоты илиферменты 22,23,24,25. Один из способов преодоления этого ограничения — это биомиметическая минерализация in situ, при которой биомолекулы выступают в роли центров нуклеации во время роста MOF, как это показано для ZIF-8 и ZIF-90 26,27,28. Несмотря на свою эффективность, эта стратегия требует мягких условий синтеза, которые ограничивают диапазон совместимых химических веществMOF до 29,30.

UiO-66, MOF на основе циркония, построенный из октаэдрических узловZr 6O4(OH)4 и линкеров 1,4-бензендикарбоксилата (BDC), выделяется своей исключительной химической стабильностью и биосовместимостью31. Её прочная конструкция устойчива к разложению в водных и физиологических средах, что делает её идеальной длябиомедицинских приложений 32. Тем не менее, её внутренняя микропористая структура ограничивает его применимость для инкапсуляции биомакромолекул. Hb с молекулярной размерностью ~5 нм не может быть размещён во внутренних порах безупречного UiO-66. Соответственно, лишь ограниченное число исследований изучало UiO-66 в системах, связанных с Hb, где MOFs в основном используются для поверхностного сенсора Hb, а не для инкапсуляциифреймворка 33,34. В результате платформы на базе UiO-66 для инкапсуляции Hb остаются относительно недоразвитыми.

Совсем недавно мы ввели иерархически пористый UiO-66 NP (HP-UiO-66 NP), который преодолевает ограничение размера пор, включая мезопористые домены, способные вмещать Hb, тем самым расширяя функциональный диапазон UiO-66 для разработкиHBOC 35. Иерархическая пористость вводится через инженерию дефектов, в частности с использованием длинноцепочечных монокарбоновых кислот, таких как додекановая кислота (DA), в качестве модуляторов присинтезе 36,37. Этот модулятор конкурирует с лиганом BDC для координации сZr 4+, что приводит к образованию дефектов и увеличению мезопор. Последующее удаление модулятора даёт HP-UiO-66 NP, содержащие сосуществующие микро- и мезопористые домены, с регулируемым размером пор за счет концентрации модулятора или длиныцепи 36.

Хотя введение мезопористости улучшает молекулярную доступность, оно также может нарушить целостность каркаса в буферах, содержащих фосфаты. Фосфатные ионы могут координироваться с кластерами Zr, что приводит к частичному или полному структурномураспаду 38,39. Соответственно, стратегии поверхностной стабилизации необходимы для сохранения коллоидной и химической стабильности в физиологическихусловиях 40. В целом стабилизация поверхности MOF может быть достигнута через нековалентные взаимодействия (например, взаимодействие ван-дер-Ваальса и водородные связи)41, координационные взаимодействия с открытыми металлическимиучастками 42 или ковалентное прикрепление к органическимлинкерам 43. Среди различных линкеров полиэтиленгликоль (ПЭГ) особенно привлекателен благодаря своей широкой доступности и минимальной синтетическойсложности 44. Важно, что модификация поверхности ПЭГ, обычно называемая ПЭГилированием, придаёт несколько положительных свойств системам доставки лекарств, включая отличную биосовместимость, снижение адсорбции неспецифических белков и снижение иммунного распознавания и поглощениямакрофагов 45,46. В совокупности эти эффекты снижают иммуногенные ответы и продлевают системноекровообращение 47.

Традиционные методы ПЭГилирования часто опираются на химию карбодиимида или малеимида, которые обычно требуют катализаторов или реактивных промежуточных веществ, способных повреждать чувствительные биомолекулы, такие как Hb. Чтобы обойти это ограничение, мы используем стимулируемую штаммами алкин-азидную циклоаддицию (SPAAC) — безкатализаторную биоортогональную реакцию между функционализированными видами азида и дибензилциклоктина (DBCO), что позволяет осуществлять сайт-специфическую конъюгировку в мягких водныхусловиях 35,48. Этот подход обеспечивает эффективную модификацию поверхности без ущерба инкапсулированной функции Hb.

Основываясь на ранее опубликованных HP-UiO-66NPs 35, которые были сосредоточены на структурном проектировании и биофункциональной валидации, настоящий протокол делает акцент на методологической прозрачности и воспроизводимости, предоставляя детальный, пошаговый экспериментальный рабочий процесс с определёнными диапазонами параметров и критическими аспектами обращения. Включены рекомендации по устранению неполадок для ключевых этапов синтеза, инкапсуляции Hb и PEGilation с помощью химии SPAAC, что в конечном итоге приводит к получению стабильных NP Hb@HP-UiO-66-PEG (см. рисунок 1).

Рабочий процесс включает: (i) инженерию дефектов с использованием DA в качестве модулятора для синтеза аминомодифицированных NP HP-UiO-66-NH2 ; (ii) азидная функционализация поверхностных аминовых групп; (iii) инкапсуляция Hb в мягких, водных условиях; (iv) ковалентная конъюгация PEG через SPAAC.

Для каждого основного этапа этот протокол выявляет общие экспериментальные проблемы, такие как агрегация частиц, коллапс пор или неэффективная функционализация поверхности, а также предоставляет практические стратегии устранения неисправностей для повышения межлабораторной воспроизводимости. Важно отметить, что эта статья подробно демонстрирует, что синтез NP HP-UiO-66 легко масштабируем, что обеспечивает надёжное производство в масштабе граммов на партию.

Конечные PEGилированные наноносители демонстрируют высокую коллоидную стабильность в солевом растворе, 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоте (HEPES) и сыворотке, при этом сохраняя способность Hb к связыванию и высвобождениюкислорода 35. Аналитические методы, такие как инфракрасная спектроскопия преобразования Фурье (FTIR), ядерный магнитный резонанс (NMR), порошковая рентгеновская дифракция (PXRD), сорбция азота (N2), анализ зета-потенциала (ζ), динамическое рассеяние света (DLS), сканирующая электронная микроскопия (SEM) и трансмиссионная электронная микроскопия (TEM), подтверждают химическую трансформацию, целостность каркаса, пористость, морфологию наноуровней и успешную функционализацию поверхности.

Делая акцент на воспроизводимости, масштабируемости и операционной ясности, поддерживаемой видеовизуализацией технически чувствительных этапов, эта методология обеспечивает воспроизводимый, надёжный и доступный путь для создания стабильных носителей кислорода на основе MOF. Важно, что подход модульный и легко адаптируется к другим биомакромолекулам или ферментам, которым требуется защищённая, но кислородопроницаемая микросреда для сохранения функциональности. Соответственно, NP Hb@HP-UiO-66-PEG представляют собой многообещающий шаг на пути к созданию HBOC, способных эффективно доставлять кислород, сопротивляясь разложению биологических жидкостей.

С практической точки зрения эту стратегию можно распространить и на другие биомакромолекулы, выходящие за пределы Hb, при условии, что они имеют размеры ниже примерно 20 нм, что соответствует максимальному доступному размеру мезопора, и обладают одной или несколькими из следующих характеристик: (i) чувствительность к суровым химическим условиям, способствующая мягкому синтезу и модификации поверхности; (ii) необходимость в гидратованой, кислородопроницаемой микросреде для поддержания функциональной активности; и (iii) восприимчивость к деградации MOF, вызванной фосфатами, что требует стабилизации поверхности. Подход основан на умеренной плотности дефектов для баланса доступности мезопор с целостностью каркас. Когда для сохранения функции биомолекулы требуется модификация поверхности без катализаторов, PEGилирование на основе SPAAC даёт явные преимущества. Следовательно, этот протокол хорошо подходит для эффективной загрузки биомакромолекул, функционального сохранения и долгосрочной коллоидной стабильности в физиологических условиях, тогда как значительно более крупные биомолекулы или системы, требующие экстремальной термической или кислотной стабильности, могут потребовать альтернативных платформ MOF.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Экстракция Hb (ожидаемая продолжительность: 2 дня)

ПРИМЕЧАНИЕ: Извлечение Hb из коммерчески доступной бычьей крови (SSI Diagnostica A/S, Hillerød, DK) проводится в соответствии с ранее сообщеннымпротоколом 49.

  1. Перенесите бычью кровь (обычно 10 мл за экстракцию) в коническую центрифугную трубку объемом 50 мл. Добавьте равный объём 0,9% физиологического раствора, чтобы разбавить кровь и снизить вязкость. Плавно инвертируйте несколько раз, пока не получите однородную суспензию.
  2. Центрифугуйте разбавлённую кровь при 1 500 x g в течение 20 минут при 4 °C. После центрифугирования над плотной красной гранулой (эритроцитами) появляется прозрачный жёлтый супернатант (плазма). Если полная гранулирование не достигнута, продолжайте центрифугирование по мере необходимости.
  3. Аккуратно декантуйте и сбрасывайте плазменный слой, не нарушая гранулу. Добавьте свежий физиологический раствор (10 мл), повторно суспензируйте гранулы эритроцитов путём мягкой инверсии и повторите этап центрифугирования при тех же условиях. Проведите всего два цикла промывки для удаления плазменных белков и тромбоцитов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс промывки крайне важен для получения чистых эритроцитов без плазменных загрязнителей, которые могут мешать извлечению толуола по следующему потоку.
  4. После второй промывки сбросьте супернатант и снова суспензируйте очищенную гранулу эритроцитов в смеси толуола, ультрачистой воды и физиологического раствора при соотношении объёма 1:0,4:1. Например, смешайте 10 мл толуол, 4 мл ультрачистой воды и 10 мл физиологического раствора в разделительной воронке объемом 50 мл перед добавлением гранулы.
  5. Запечатайте воронку и аккуратно переверните несколько раз, чтобы перемешать фазы. Установите воронку на 4 °C на ночь (~12-16 часов), чтобы обеспечить полное разделение фаз. Толуоловая фаза удаляет липидные мембраны, оставляя прозрачную водную фазу, обогащённую Hb.
  6. На следующий день аккуратно соберите нижний водный слой с помощью запорного крана сепаративной воронки. Этот слой кажется прозрачным и тёмно-красным.
  7. Переместить водный раствор Hb в центрифугные трубки и открутить при 8 000 x g в течение 20 минут при 4 °C, чтобы удалить остатки клеток или эмульгированный материал.
  8. Фильтруйте супернатант через диатомовую земную фрит с помощью вакуумной фильтрации. Применяйте только мягкий вакуум (избегайте высокого отрицательного давления, которое может вызвать пенение или денатурацию белка).
  9. Соберите фильтрат, содержащий Hb, свободный от стромы. Храните этот запас на льду, если используется сразу, или в аликвот (~1 мл) и заморозьте при −80 °C для длительного использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Hb аликвоты могут храниться замороженные несколько месяцев без заметного разрушения.
  10. Количественно измеряйте концентрацию Hb с помощью анализа на белки на бицинхониновой кислоте согласно протоколу производителя, используя чистый бычий Hb в качестве калибровочного стандарта. Отрегулировать итоговый запас Hb до желаемой рабочей концентрации (обычно 20 мг мл-1 в буфере HEPES, pH 7,4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидайте прозрачный красный раствор Hb без клеточного материала.
  11. Опционально: измерить спектры поглощения УФ-виз (375-700 нм) извлеченного Hb для оценки способности связываться и высвобождать кислород. Запишите начальный спектр УФ-видимости. Добавьте натрий дитионит и прочистите газомN2 в течение 10 минут для выделения кислорода и запишите спектр обезоксигенного Hb. Затем продуйте воздухом в течение 10 минут, чтобы обеспечить реоксигенацию и повторную запись спектра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наличие характерных зон Сорета и Q-зон с кислородом (~412 нм для зоны Сорета; ~541 и ~577 нм для Q-зон) и деоксигенированной (~430 нм для зоны Сорета; ~557 нм для Q-зоны) Hb после промывания воздухом иN2 соответственно, указывает на то, что Hb остаётся функциональной (Дополнительный рисунок 1).
    ВНИМАНИЕ: Осторожно обращайтесь с толуолом в вытяжке с дымом, при этом надевая соответствующие средства индивидуальной защиты, включая лабораторный халат, защитные очки и перчатки. В настоящем исследовании все отходы, содержащие толуол, были собраны и утилизированы как органические химические жидкие отходы в специализированных контейнерах (группа C), маркированных как «толуол и смесь» в соответствии с рекомендациями Министерства окружающей среды Дании. Соответствующая документация по утилизации отходов приведена в Дополнительном файле 1.

2. Изготовление NP HP-UiO-66-NH2 (ожидаемая продолжительность: 3 дня)

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ: HCl (37%) — коррозийный; Ручка внутри вытяжки с лабораторным халатом, кислотостойкими перчатками и соответствующей защитой для глаз. Добавляйте кислоту медленно и избегайте вдыхания паров.

  1. ВзвесьтеZrCl 4 (400 мг, 1,715 ммоль) в колбу с круглым дном объёмом 250 мл. Медленно добавляйте DMF (80 мл) и ультразвуковой обработку в течение 5 минут, чтобы полностью растворить ZrCl4. Добавьте DA (12 г, 60 ммоль) и проводите ультразвук ещё 30 минут, пока не получите прозрачный, однородный раствор. Измерьте общий объём раствора с помощью градуированного цилиндра и добавьте DMF по мере необходимости, чтобы скорректировать итоговый объём до 100 мл. DA выступает в роли конкурентного модулятора, вводя контролируемые дефекты решётки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При растворенииZrCl 4 постепенно добавляйте DMF, так как процесс координации экзотермический и может вызывать небольшое дымление; Выполняйте все операции в вытяжной жидкости. Учтите увеличение объёма, вызванное включением DA, используя начальный объём 80 мл DMF для растворенияZrCl 4 и DA, и регулируйте итоговый объём до 100 мл только после полного растворения для обеспечения точного контроля концентрации.
  2. Добавьте 2-амино-1,4-бензендикарбоновую кислоту (BDC-NH2, 155 мг, 0,857 ммоль) в ту же колбу и соникуйте ещё 30 минут. Продолжайте до получения однородного бледно-жёлтого раствора.
  3. Переместите смесь в автоклав с тефлоновой облицовкой объёмом 150 мл или сосуд с круглым дном, подходящий для сольвотермального синтеза. Плотно запечатайте и поместите в предварительно нагретую глушительную печь при 120 °C на 18 часов. Не беспокойте реактор во время нагрева, чтобы избежать неконтролируемого нуклеации.
  4. После реакции выключите печь и дайте сосуду естественным образом остыть до комнатной температуры (~2 часа). Обратите внимание на тонкую жёлтую суспензию, равномерно появляющуюся по всему материалу.
  5. Соберите продукт центрифугированием (11 000 x г, 10 мин, комнатной температуры) и сбросьте супернатант. Промыйте гранулу DMF (100 мл) три раза, используя те же условия центрифуга, чтобы удалить лишний лиганд и нереагированный DA. Если продукт не полностью гранулирован, продлевайте время центрифугации по мере необходимости.
  6. Приготовьте раствор для удаления кислоты, состоящий из DMF (100 мл), содержащего 0,5 мл концентрированного HCl (37%). Полностью погрузите промытый гранул в этот раствор и нагрейте её в глушительной печи при 90 °C в течение 12 часов. Этот этап удаляет модулятор DA, создавая мезопоры внутри структуры.
  7. Через 12 часов центрифугу (11 000 x g, 5 минут, комнатной температуры) и сбросьте супернатант. Повторите кислотную обработку с использованием свежей партии DMF с содержанием 0,5 мл HCl для полного удаления DA. Если продукт не полностью гранулирован, продлевайте время центрифугации по мере необходимости.
  8. Последовательно промывайте гранулы с помощью DMF, ацетона и этанола (100 мл, 11 000 x g, 5 минут, комнатной температуры), чтобы удалить остатки кислоты и растворителя. Если осадок не полностью гранулирован, при необходимости увеличивайте время центрифуга. Между каждой промывкой аккуратно перераспределите гранулы с помощью вихря или мягкой звуковой обработки.
  9. Высушите продукт в вакуумной духовке (140 °C) на ночь после высыхания в вытяжке с дымом. Конечные материалы (HP-UiO-66-NH2 NP) выглядят в виде мелкого жёлтого порошка. Ожидайте типичный выход ~428 мг.
  10. Подтвердите, что пики PXRD при 2θ = 7,3°, 8,4°, 25,7° остаются резкими (рисунок 2A), что указывает на сохранение кристаллической топологии UiO-66. Проверьте полное удаление DA с помощью 1H ЯМР после щелочного (2 M KOH вD2O) пищеварения (без пиков метилена при 1,2 ppm) (рисунок 2B).
  11. Охарактеризовать пористость с помощью адсорбции-десорбции N2 при 77K 50. Кривая показывает комбинированную изотерму типа I/IV с петлей гистерезиса (рисунок 2C), подтверждающая образование мезопор.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Неполное высыхание при высоких температурах или недостаточная масса образца приводят к неточным измерениям пористости с использованием изотерм адсорбции и десорбции N2; повторять вакуумную сушку при 140 °C и убедиться, что вес образца превышает 100 мг, если площадь Брунауэра-Эммета-Теллера (BET) < 1 000м 2 g-1.
  12. Необязательно: оценить морфологию NP с помощью SEM. NP HP-UiO-66-NH2 демонстрируют сферическую морфологию с узким размерным распределением ~100 нм (рисунок 2D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидайте NPs HP-UiO-66-NH2 , содержащие как микро, так и мезопоры, подходящие для последующего инкапсуляции Hb.
  13. Синтез NP HP-UiO-66-NH2 можно масштабировать путём пропорционального увеличения всех реагентов и растворителей, используемых на этапах 2.1–2.9, и проведения нескольких параллельных растворимых реакций. Сохраняя те же молярные соотношения, концентрации, температуру реакции и время реакции, а также увеличивая количество реагентов и растворителей в 1,5 раза, можно одновременно эксплуатировать два или более автоклава с тефлоновой облицовкой по 150 мл или сосуды с круглым дном, что позволяет производить HP-UiO-66-NH2 NPs по грамму (см. рисунок 3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте все органические растворители внутри выхлопной вытяжки, нося лабораторный халат, кислотостойкие перчатки и соответствующую защиту глаз. Собрать все отходы, содержащие ДМФ, и утилизировать их как органические химические жидкие отходы в специально отведённые контейнеры (группа C) с маркировкой «DMF и смесь» в соответствии с рекомендациями Министерства окружающей среды Дании. Отходные растворы, содержащие следовые количестваZrCl4 и HCl, были обработаны соответственно. Соответствующая документация по утилизации отходов приведена в Дополнительном файле 1.

3. Функционализация азидом NP HP-UiO-66-NH2 (HP-UiO-66-N3 NP) (ожидаемая продолжительность: 1 день)

ВНИМАНИЕ: Триметилсилилазид (TMSN₃) и трет-бутилнитрит (tBuONO) токсичны и летучи. Выполняйте все шаги в вытяжке, надевая лабораторный халат, нитриловые перчатки и защиту для глаз.

  1. Точно взвесьте HP-UiO-66-NH2 NP (50 мг) в колбу с круглым дном объемом 25 мл. Добавьте THF (10 мл) и проведите ультразвуковой анализ в течение 5 минут, чтобы полностью рассеять частицы. Подвеска становится непрозрачной, но однородной.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Равномерная дисперсия NP после соникации критически важна для эффективного контакта с реагентами. Если рассеивание неполное, увеличьте объём раствора и повторите звуковую обработку.
  2. Поместите флягу в ледяную водяную ванну (0 °C) на магнитную мехалу, установленную на 400 об/мин. Используя стеклянный шприц , добавляйтеt BuONO (0,4 мл) по капле в течение 5 минут, поддерживая температуру ниже 5 °C.
  3. Немедленно добавляйте TMSN₃ (0,35 мл) по перепаду в тех же холодных условиях. Может появиться лёгкое шипение, указывающее на прогрессирование нитрозации. Обмотайте ванну алюминиевой фольгой, чтобы защитить реакцию от света...
  4. Продолжайте перемешивать реакционную смесь ночью (~16 ч) в ледяно-водной ванне, чтобы обеспечить полное замещение азидом аминных групп на поверхности MOF.
  5. Снимите ледяную ванну и дайте суспензии достичь комнатной температуры. Центрифуга (11 000 x г, 5 минут, комнатной температуры) для сбора модифицированных NP. Если осадок не полностью гранулирован, при необходимости увеличивайте время центрифуга.
  6. Тщательно промывайте гранулы с THF (10 мл) три раза, собирая её центрифугой (11 000 x г, 5 минут, комнатной температуры) после каждой мойки. Затем проводятся три дополнительных промывки с использованием ацетона (10 мл), центрифугирование при тех же условиях, чтобы удалить остаточные реагенты и побочные продукты. Если осадок не полностью гранулирован, при необходимости увеличивайте время центрифуга.
  7. Высушите продукт (HP-UiO-66-N 3 NPs) в духовке (140 °C) в вакууме на ночь после высыхания в вытяжке с дымом. Ожидайте типичный выход ~45 мг.
  8. Проверьте химическое преобразование с помощью FTIR-спектроскопии: резкое асимметричное азидное растяжение появляется на ~2122 см-1 (рисунок 4A). Интенсивность зоны коррелирует с эффективностью поверхностного замещения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Неполное преобразование может ухудшить последующее спряжение кликов. Если азидная зона слабая, повторите функционализацию с использованием двукратных величин tBuONO и TMSN₃. Ожидайте NP с азидо-терминированными HP-UiO-66-N3 с сохраненной кристаллинностью и мезопористой архитектурой (рисунок 4B-D), готовых к инкапсуляции Hb и SPAAC PEGилированию.
    ВНИМАНИЕ: Собирайте все жидкости отходов, содержащие TMSN₃, включая смеси с другими реагентами (например, tBuONO и THF), в специально отведённые контейнеры группы O в соответствии с рекомендациями Министерства окружающей среды Дании. Чётко маркируйте все контейнеры, чтобы указать наличие TMSN₃ и его смесей. Соответствующая документация по утилизации отходов приведена в Дополнительном файле 1.

4. Загрузка и количественная оценка (ожидаемая продолжительность: 2 дня)

  1. Пересадите HP-UiO-66-N3 NP (5 мг) в центрифугную трубку объемом 2 мл, затем проведите ~2 минуты соникации в буфере HEPES 0,5 мл (20 мМ, pH 7,4). Добавьте 0,5 мл буфера HEPES с Hb (20 мг мл-1) и аккуратно перевернуте трубку несколько раз, чтобы полностью рассеять NP.
  2. Поставьте трубку на термошейкер и инкубуйте при комнатной температуре (22-25 °C) при 1000 об/мин, встряхивая 2 часа.
  3. После инкубации центрифугуйте 13 500 x г в течение 5 минут при комнатной температуре, чтобы гранулировать полученные Hb@HP-UiO-66-N3 NP. Тщательно соберите супернатант для количественной оценки незапечатленного Hb. Если осадок не полностью гранулирован, при необходимости увеличивайте время центрифуга.
  4. Аккуратно промыйте гранулы сверхчистой водой (1 мл), проводя пипетом вверх и вниз, чтобы удалить слабо адсорбированный Hb, и повторите промывку дважды. Тщательно соберите супернатант каждой промывки для количественной оценки незапечатленного Hb. Подвесьте финальную гранулу в сверхчистой воде с объёмом 0,5 мл для характеристики. Храните образцы в холодильнике (4 °C), чтобы предотвратить окисление.
  5. Определите незахваченный Hb в собранных супернатантах с помощью анализа на лаурилсульфат натрия (SLS)-Hb51. Пипетте 10 мкл каждого супернатанта в 96-лучную микропластину и добавьте 100 мкл реагента SLS (0,6 мг мл-1 в сверхчистой воде). Инкубировать 5 минут при комнатной температуре в темноте, затем измерить поглощение на 412 нм с помощью УФ-визуального спектрофотометра.
  6. Подготовьте стандартную кривую с использованием растворов Hb (0-10 мг мл-1) в буфере HEPES для преобразования значений поглощения в концентрацию.
  7. Рассчитайте эффективность инкапсуляции (EE) и содержимое загрузки (LC) как:
    EE (%) = [(начальный Hb - супернатант Hb)/начальный Hb] × 100
    LC (%) = [(инкапсулированный Hb)/(инкапсулированная Hb + масса NP)] × 100
  8. Для масштабирования инкапсуляции Hb инкубировать 100 мг NPs с 20 мл раствора Hb (10 мг мл⁻¹). Для оценки пористости после инкапсуляции погрузите полученные NP в этанол на 24 часа, затем высушите ночью в вакуумной печи при 140 °C и зафиксируйте изотерму адсорбции и десорбции N2 для оценки пористости. Красный цвет порошка указывает на успешную инкапсуляцию Hb (рисунок 5A), а заметное снижение усвоенияN2 подтверждает успешное заполнение мезопор Hb (рисунок 5B).
  9. Измерьте ζ-потенциал с помощью Zetasizer Nano ZS. Поверхностный заряд уменьшается с ~+40 мВ (HP-UiO-66-N3 NP) до ~+20 мВ (Hb@HP-UiO-66-N3 NPs), что соответствует адсорбции Hb (см. рисунок 5C).
  10. Опционально: приобрести микрографию SEM (рисунок 5D) и дифрактограмму PXRD (рисунок 5E) для обеспечения морфологической целостности и структурной устойчивости.
  11. Записывайте спектры УФ-видимости (375-700 нм) для оценки обратимого связывания кислорода в NP. Добавьте натриевый дитионит и продуйтеN2 в течение 10 минут для выделения кислорода, затем запишите спектр, затем продуйте воздухом в течение 10 минут для повторного связывания и снова запишите спектр (см. рисунок 5F).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наличие характерных зон Сорета и Q-зон насыщенного кислородом (~412 нм для зоны Сорета; ~541 и ~577 нм для Q-зон) и обезоксигенированного (~430 нм для зоны Сорета; ~557 нм для Q-зоны) Hb после очистки воздухом иN2 соответственно указывает на то, что Hb остаётся функциональным.
  12. Ожидайте однородные красные Hb@HP-UiO-66-N3 NP, содержащие функционально активный Hb с обратимым поведением по оксигенации.

5. Изготовление NP Hb@HP-UiO-66-PEG: PEGilation с помощью SPAAC (ожидаемая продолжительность: 2 дня)

  1. Приготовьте центрифугную трубку объемом 2 мл с Hb@HP-UiO-66-N₃ NP (10 мг), распределённую в 0,5 мл ультрачистой воде. Добавьте DBCO-PEG (МВт ~2 000, 20 мг в 0,5 мл ультрачистой воде), чтобы получить соотношение 2:1 (w/w) между PEG и NP. Плавно врезайте до полного смешения.
  2. Инкубировать смесь на термошейкере при комнатной температуре при 1000 об/мин в течение 1 часа, затем перевести в холодильник (4 °C) для ночной реакции (~16 ч). Эта реакция SPAAC без катализаторов ковалентно связывает DBCO с азидными группами, формируя стабильные триазольные связи.
  3. Центрифугу при 12 000 x g в течение 5 минут при комнатной температуре для гранулирования PEGilated Hb@HP-UiO-66-PEG NP. Если осадок не полностью гранулирован, при необходимости увеличивайте время центрифуга. Отбросьте супернатант, содержащий неотреагированный PEG.
  4. Промыйте гранулу три раза сверхчистой водой (по 2 мл каждая, пипетирая вверх и вниз) при одинаковых условиях центрифуга. Это обеспечивает удаление свободных цепей ПЭГ и мелких молекулярных побочных продуктов.
  5. Суспензировать очищенные NP Hb@HP-UiO-66-PEG в сверхчистой воде 2 мл и хранить при 4 °C.
    Коллоид выглядит однородным и слегка опалесцентным, что указывает на хорошую устойчивость дисперсии.
  6. Подтверждение успешного PEGилирования с помощью FTIR-спектроскопии (рисунок 6A): исчезновение азидной зоны на 2122 см-1 и появление сигналов метилена, полученных из PEG (−CH2−) и эфирной связи (−O−), на 2883 и 1097 см-1 соответственно.
  7. Проверять с помощью 1H ЯМР (рисунок 6B) после щелочного расщепления в 2 M KOH/D2O; PEGилированные образцы показывают дополнительный сигнал при δ = 3,53 ppm, соответствующий оксиэтиленовым протонам PEG.
  8. Измерьте гидродинамический диаметр и индекс полидисперсности (PDI) с помощью DLS (рисунок 6C).
    Увеличение с ~115 нм (PDI ~0,1) до ~140 нм (PDI ~0,17) подтверждает поверхностное покрытие тонким полимерным слоем.
  9. Необязательно: измерить потенциал поверхности ζ с помощью Zetasizer Nano ZS для проверки незначительного влияния поверхностного PEGилирования на заряд поверхности (рисунок 6D). Небольшое изменение после PEGилирования (с ~+20 мВ до ~+17 мВ) указывает на минимальное воздействие на поверхностный заряд.
  10. Наблюдаем морфологию по TEM (рисунок 6E). TEM выявляет диффузный ободок размером ~10-12 нм вокруг края частицы, представляющий корону PEG.
  11. Проведите анализ высвобождения кислорода с помощью кислородного электрода (рисунок 6F), чтобы показать, что функция Hb остаётся неизменной после PEGилирования, аналогично неPEGилированной форме. Ожидайте стабильные, красновато-коричнево-дисперсные NPs Hb@HP-UiO-66-PEG, демонстрирующие сильную коллоидную стабильность и сохраняющуюся способность связываться с кислородом, подходящие для долгосрочных физиологических испытаний.
  12. Необязательно: провести кривые диссоциации кислорода (ODC) свободных Hb и Hb, инкапсулированных в NP Hb@HP-UiO-66-PEG, чтобы определить частичное давление кислорода при 50% насыщенности кислородом Hb (p50) и коэффициенте Хилла (Hill-n) (рисунок 7).

6. Оценка стабильности NPs (ожидаемая продолжительность: 7 дней)

  1. Раздайте Hb@HP-UiO-66-PEG NP (~5 мг) в семь центрифугных трубок по 2 мл. Добавьте по 2 мл каждого материала: сверхчистую воду, физиологический раствор (0,9% NaCl), HEPES (20 мМ), мышиную сыворотку, человеческую плазму, модифицированный Eagle's средне-высокий уровень глюкозы (DMEM) от Dulbecco и фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS). Убедитесь, что крышки трубок центрифуг плотно закрыты, чтобы предотвратить испарение среды во время инкубации. Сыворотка CD-1 для мышей и человеческая плазма закупаются у Innovative Research (Нови, Мичиган, США).
  2. Инкубировать образцы при 37 °C в термошейкере при 1000 об/мин до 7 дней.
  3. Через 3 и 7 дней соберите частицы центрифугой (12 000 г, 10 минут, комнатной температуры), промыйте один раз сверхчистой водой и высушите для PXRD (рисунок 8A). Если осадок не полностью гранулирован, при необходимости увеличивайте время центрифуга.
  4. При 0, 24, 72 и 168 h убирайте аликвоты (~50 мкл) и разбавляйте их в 20 раз для анализа DLS (размер и PDI) (рисунок 8B).
  5. По желанию: подготовить образцы SEM через 48 часов в PBS для визуальной проверки морфологии (рисунок 8C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавление суспензии NPs (в PBS) ультрачистой водой крайне важно для анализа SEM, так как это снижает фоновые помехи от компонентов буфера и облегчает чёткое изображение NP.
  6. Сравните с неPEGилированнымиHb@HP-UiO-66-N 3 NP при идентичных условиях; быстрое исчезновение характерных кристаллических отражений и появление широких аморфных рассеяющих особенностей свидетельствуют о нестабильности без покрытия PEG.
    ПРИМЕЧАНИЕ: PEGилированные образцы остаются структурно целыми через 7 дней во всех средах, тогда как неPEGилированные разлагаются в течение 24 часов в PBS или DMEM.

7. Физико-химическая характеристика (ожидаемая продолжительность: ~15 дней)

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описаны аналитические методы, необходимые для подтверждения морфологии, состава, пористости и целостности Hb NP. Эти методы характеристики в совокупности подтверждают воспроизводимость процессов синтеза и модификации.

  1. PXRD
    1. Высушите ~5 мг каждого образца NP в морозильнике на ночь перед измерением, чтобы удалить адсорбированную влагу.
    2. Загрузите образец на плоский силиконовый держатель с нулевой фоном и аккуратно расплющите с помощью чистого стеклянного затвора, чтобы получить тонкий равномерный слой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте слишком сильного нажатия, так как это может вызвать эффекты предпочтительной ориентации.
    3. Фиксируйте PXRD с помощью настольного дифрактометра, оснащённого излучением Cu Kα (λ = 1,5418 Å). Установите параметры сканирования на 2θ = 4-50°, размер шага = 0,02°, dwell = 1 с на шаг.
    4. Сравните полученные узоры с смоделированной структурой UiO-66, сгенерированной с помощью программного обеспечения Mercury на основе ранее представленных кристаллическихданных 31. Наличие резких пиков под углом 7,3°, 8,4° и 25,7° свидетельствует о кристаллической целостности.
  2. N2 Адсорбция-десорбция (распределение площади поверхности и размера пор BET)
    1. Дегаз ~100 мг каждого образца NP при 140 °C в вакууме в течение 24 часов с использованием системы Micromeritics Smart VacPrep с ультра-высокочистой N2.
    2. Немедленно переместите дегазированные образцы в анализатор анализатора поверхности Micromeritics Tristar. ЗафиксироватьN2 изотермы при 77 K в пределах относительного диапазона давлений (P/P₀) от 0 до 1.
    3. Вычислите площади поверхности с помощью метода BET согласно расширенным критериямРукероля 52. Рассчитывать распределение размера пор с помощью нелокальной теории функционала плотности, реализуемой в программном обеспечении Micromeritics.
    4. Генерируйте графики распределения размеров пор и адсорбционных кривых/десорбционных и с помощью Origin 2022. Импортировать данные адсорбции/десорбции в программное обеспечение с относительным давлением (P/P₀) по оси X и адсорбированным объёмом N2 по оси Y.
    5. Постройте данные о распределении размера пор с шириной пор как осью X, а инкрементальный объём пор — осью Y. Результаты представлены в виде графиков «Линия + символ». Выполняйте все анализы с использованием стандартных программных настроек.
  3. Спектроскопия FTIR
    1. Измельчите ~5 мг каждого высушенного образца в мелкий порошок в чистой ступке агата. Поместите порошок на кристалл ATR спектрометра ALPHA-P Bruker53.
    2. Собирайте спектры в диапазоне 4000-400 см-1 с разрешением 2 см-1 .
    3. Определить характерные пики: Появление растяжения N3 на ~2122 см-1 подтверждает формирование азида (рисунок 4A). После PEGилирования наблюдайте полосы −CH 2− и C-O-C на ~2883 см-1 и ~1097 см-1 соответственно, а также исчезновение растяжения N3 (рисунок 6A). Ожидается, что исчезновение азидной зоны и появление сигналов метилена (−CH2−) и эфирной кости (−O−), полученных из PEG, подтвердит завершение реакции SPAAC.
    4. Постройте FTIR кривые с помощью Origin 2022. Импортируйте исходные данные в программу с значениями X (волновое число) и Y (пропускаемость). Генерируйте графики в формате «Line» с использованием стандартных настроек программы.
  4. 1H NMR
    1. Добавьте ~10 мг NPs к 0,5 мл 2 M KOH в D2Oв стеклянном флаконе и нагрейте при 80 °C в течение 1-2 часов для переваривания карка.
    2. Центрифуга (12 000 x g, 10 минут, комнатная температура) для отжимания нерастворённых остатков. Перенесите супернатант на 5-мм ЯМР-трубку.
    3. Запишите ЯМР-спектры 1H на спектрометр Bruker Avance с частотой 400 МГц.
    4. Назначьте характерные химические сдвиги, включая ароматические протоны BDC-NH2 (δ = 6-8 ppm) и сигналы PEG (δ = ~3,53 ppm, рисунок 6B), с помощью программного обеспечения MestReNova. Проанализируйте данные ЯМР с помощью модуля обработки ЯМР-программы с его настройками по умолчанию.
  5. SEM
    1. Осадка ~5 мкл NP-суспензии на кремниевую пластину; Дайте высохнуть на воздухе в шкафу без пыли. Если происходит заряжание, нанесите распылительный слой 5 нм золота.
    2. Изображение на FEI Quanta 200 SEM при ускоряющем напряжении 10-20 кВ.
    3. Анализируйте изображения с помощью ImageJ. Импортируйте оригинальные TIFF-изображения с встроенной информацией о масштабе в программное обеспечение и регулируйте яркость и контраст исключительно для визуализации. Не применяйте дополнительную обработку, которая может повлиять на информацию о размерности. Генерируйте шкалы с помощью функции Analyze в программном обеспечении.
  6. TEM
    1. Разместите ~5 мкл NP-дисперсии на сетку Cu с кружевным углердом (300 меш). Промокните лишнее фильтрующей бумагой и высушите в условиях окружающей среды.
    2. Проверьте под FEI Tecnai T20 G2 TEM при напряжении 200 кВ.
    3. Анализируйте изображения с помощью ImageJ. Обработка изображений следует процедурам, описанным в разделе 7.5.3.
  7. DLS и ζ-Потенциал
    1. Разбавлять NP ~20-кратно в ультрачистой воде для анализа размера и PDI; для ζ-потенциала разбавлять в буфере HEPES (20 мМ, pH 7,4).
    2. Измерьте с помощью Zetasizer Nano ZS при 25 °C. Подготовляются как минимум три независимых образца (n = 3), и каждый образец измеряется в тройном экземпляре.
    3. Постройте график данных DLS и ζ потенциала с помощью Origin 2022. Представить распределение размеров частиц с взвешенным по интенсивности в виде графиков «Линия + Символ», а результаты ζ потенциала — как графики «Столбца». Данные указываются как средние ± стандартное отклонение (n = 3). Выполняйте все анализы, используя стандартные настройки программы.
  8. UV-vis спектроскопия для функциональности Hb
    1. Распределить 3 мг свободного Hb или соответствующее количество NP (то есть содержащее эквивалентное количество инкапсулированного Hb) в 3 мл ультрачистой воде. Перенесите подвески на кварцевую кювет. Записывайте спектры УФ-видимости от 375 до 700 нм с помощью УФ-2600 УФ−вис спектрофотометра.
    2. Добавьте щепотку натрия дитионита в раствор Hb или NP-суспензию и продуйтеN2 в течение 10 минут для обезоксигенирования образца. Запишите смещение диапазона Соре с 412 на 430 нм и слияние Q-диапазонов. Насыщайте образец кислородом пузырьками воздуха в течение 10 минут, чтобы наблюдать обратную реакцию (рисунок 5F и дополнительный рисунок 1).
    3. Постройте данные с помощью Origin 2022. Спектры представлены в виде «линейных» графиков с длиной волны по оси X и поглощением по оси Y.
  9. Количественная оценка высвобождаемого кислорода
    1. Диспергировать 1 мг свободного Hb или соответствующее количество Hb@HP-UiO-66-N3 и Hb@HP-UiO-66-PEG NPs (содержащие эквивалентное количество инкапсулированного Hb) в 600 мкл ультрачистой воде. Переложите подвески в стеклянные флаконы объёмом 2 мл и плотно запечатайте их резиновыми крышками.
    2. Аккуратно введите игольчатый зонд кислородного электрода через резиновую крышку в подвеску, чтобы отслеживать уровень растворённого кислорода с помощью игольчатого O2-метра .
    3. Быстро добавьте в суспензию растворK 3[Fe(CN)6] (10% массы в 100 мкл ультрачистой воде) с помощью иглы шприца и непрерывно фиксируйте изменение уровня кислорода.
    4. Вычислите высвобождение кислорода, вычитая максимальное значение, наблюдаемое после сложения K3[Fe(CN)6], от исходного значения до его сложения. Нормализуйте полученные значения кислорода, высвобождаемого из того же количества свободного Hb (рисунок 6F), используя Origin 2022. Измерьте три независимых образца (n = 3) для свободного Hb или каждого NP.
      ПРИМЕЧАНИЕ: NP Hb@HP-UiO-66-N3 и Hb@HP-UiO-66-PEG демонстрируют сопоставимый выброс кислорода, каждая выделяя ~60% кислорода, выделяемого свободным Hb.
  10. Измерение ODC и расчёт p50 и Hill-n
    1. Приготовьте свободные бычьи рогатые продукты Hb или Hb@HP-UiO-66-PEG NPs с конечной концентрацией Hb ~1 мг мл-1 в буфере HEPES-физиологического раствора объемом 3 мл (20 мМ HEPES, 0,9% (с в/в) NaCl, pH 7,4). Перенесите образец в кварцевую кювету с магнитным перемешивателем.
    2. Поместите кювету в анализатор Hemox. Установите температуру измерения на 37 °C и дайте системе уравновеситься при непрерывном перемешивании до достижения стабильной базовой линии.
    3. Фиксируйте ODC постепенно деоксигенированным в диапазоне парциального давления от 1 до 148 мм рт. ст. Используйте предустановленное программное обеспечение анализатора Hemox для измерения ODC и вычисления p50 и Hill-n с использованием стандартных настроек анализа. Измерьте три независимых образца (n = 3) для каждого образца.
    4. Экспортируйте обработанные данные и нарисуйте ODC с помощью Origin 2022 в стандартном формате графа «Line».

8. Воспроизводимость и статистический анализ

  1. Выполните все процедуры, описанные в этом протоколе, как минимум три независимых раза. Сообщайте результаты как типичные результаты, наблюдаемые в этих повторениях. Поддерживайте ключевые экспериментальные параметры, такие как время реакции и температуры, в разумном диапазоне для обеспечения воспроизводимости и надёжности для других пользователей.
  2. Представлена структурная характеристика (PXRD, N2 адсорбция-десорбция, FTIR, 1H NMR, SEM, UV-vis) как репрезентативные данные для качественного подтверждения без проведения статистического анализа.
  3. Сообщайте количественные измерения (DLS, ζ-потенциал, p50, Hill-n) как среднее ± SD (n ≥ 3). Определите статистическую значимость с помощью непарного двуххвостого t-теста Уэлча или одностороннего ANOVA, если это уместно. Указывайте уровни значимости как ns (без значимости), * = p < 0,05, ** = p < 0,005, *** = p < 0,001, **** = p < 0,0001.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Успешный синтез NP HP-UiO-66-NH2 был подтверждён PXRD (рисунок 2A), который демонстрировал характерные дифракционные пики при 2θ = 7,3°, 8,4° и 25,7°, что хорошо совпадает с моделируемой структурой UiO-6636. Небольшое расширение пика относительно смоделированного рисунка было связано с наноразмерностями частиц и подтверждено сохранением кристаллической целостности послесинтеза 54. Полное удаление DA ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол предлагает надёжный и воспроизводимый путь для синтеза, функционализации и характеристики NP HP-UiO-66, предназначенных для инкапсуляции Hb и доставки кислорода. Применяя подход «изнутри наружу», эта работа создаёт обобщённую основу для проектирования НП MOF для биомедицинских приложений, включая биомакромолекулы и доставку лекарств. Хотя базовая концепция материала и функциональные характеристики уже были ранее представлены, настоящий протокол значительно расширяет предыду...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не заявляют о конкурирующем финансовом интересе.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы с благодарностью выражаем поддержку Европейского исследовательского совета в рамках программы исследований и инноваций Horizon 2020 Европейского союза (грант No 101002060).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-амино-1,4-бензендикарбоновая кислота&nsp;Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)381071-25G
4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновая кислотаMerck Life Science A/S (Sø borg, DK)H3375-100G
Ацетон (99%)VWR International (Sø borg, DK)23J244030
Анализ белков на бицинчониновой кислоте Термо Фишер Сайентифик (Роскилде, ДК)23235
Бычья кровь SSI Diagnostica A/S (Hiller ø d, DK)77667
Центрифугная трубка
Центрифуга Thermo Fisher Scientific Inc (Массачусетс, США)75009903Megafuge ST Plus серия 
Оксид дейтерияMerck Life Science A/S (Sø borg, DK)151882
Дибензоциклоктин-полиэтиленгликольBroadPharmBP-23949
Додекановая кислота Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)L556-1KG
Дульбекко Модифицированный орёл s medium− высокий уровень глюкозы и НСП;Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)11965092
Этанол (100%)VWR International (Sø borg, DK)24L044013
Инфракрасная спектроскопия преобразования Фурье Bruker (Биллерика, США)
Анализатор Hemox TSC Scientific CRP (Пенсильвания, США)
Цитратная плазма человекаTebuBioSER-PLP25
Соляная кислота (37%)Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)320331-500ML
Программное обеспечение ImageJНациональные институты здравоохранения (США)Версия 1.47t
Кружевно-углеродная Cu сетка (300 mesh)Agar Scientific Ltd., (Стэнстед, Эссекс, Великобритания)AGS166-3H
Магнитный мешальIKA-Werke GmbH и Рота KG (,DE)Идентификатор. Нет.: 0010011496
MestReNova sofewareИсследования Mestrelab (Испания)Версия 12
Анализатор поверхности Tristar MicromeriticsThermo Fisher Scientific IncASAP 2020 Plus
Мини-центрифугаEppendorf Nordic (Hø rsholm, DK)Каталог No.  5452000010
Сыворотка для мышейИнновационные исследования (Нови, Мичиган, США)IGMSCD1SER10ML
Глушительная печь Nabertherm GmbH (Бремен, Делавер)Заглушительная печь LE 6/11
N,N′-диметилформамид (99,9%)VWR International (Sø borg, DK)250131a008
Оборудование Nanodrop 2000c Термо Фишер
Ядерный магнитный резонанс Bruker (Биллерика, США)
O2 meter PreSens (Регенсбург, Германия)
Программное обеспечение Origin 2022OriginLab Corporation (Массачусетс, США)Версия 2022 
Датчик кислородаPreSens (Регенсбург, Делавер)Трасса OXY-1 ST
Фосфатный буферный физиологический раствор  Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)P4417-50TAB
Считыватель пластинTecan Group Ltd.  (Mä nnedorf, CH)
Калиев гексацианофератMerck Life Science A/S (Sø borg, DK)60299-100G
Гидроксид калияMerck Life Science A/S (Sø borg, DK)221473-500G
Порошковая рентгеновская дифракция Malvern Panalytical Ltd., (Малверн, Великобритания)Модель: Malvern Panalytical Aeris Research 600W XRD для измерений порошка (выпущено в 2020 году)
Сосуд с круглым дном давлением Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)SYNP170004-1EA
Сканирующая электронная микроскопия Рота FEI (Хиллсборо, США)Двухлучевой FEI Helios Nanolab 600
хлорид натрия Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)71376
Натрий дитионит Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)71699-250G
Натрий додецилсульфат  Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)L4509-100G
Synthware и trade; Сосуд с круглым дном под давлениемMerck Life Science A/S (Sø borg, DK)SYNP170003
Терт-бутилнитрит Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)20370-100ml-F
Тетрагидрофуран (99,7%)VWR International (Sø borg, DK)201022A004
ТермошейкерGrant Instruments (Кембридж) Ltd (Великобритания)PHMT-PSC18 (01012015020119)
Трансмиссионная электронная микроскопия Рота FEI (Хиллсборо, США)FEI Tecnai T20
Триметилсилилазид Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)155071-10G
Система TSC HEMOX DAQTSC Scientific CRP (Пенсильвания, США)Программное обеспечение для анализаторов Hemox 
Ultrosound sonicator Branson Ultrasonics Corporation (Дэнбери, США)SKU: 2410240003
UV-Vis спектрофотометр и bbsp;Симадзу (Киото, Япония)
Вакуумная духовка Thermo Fisher Scientific Inc (Массачусетс, США)
Zetasizer Nano ZSMalvern Panalytical Ltd., (Малверн, Великобритания)Серийный номер. MAL1188530
Цирконий(IV) хлоридMerck Life Science A/S (Sø borg, DK)357405-100G

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sen Gupta, A., Doctor, A. Oxygen Carriers. Damage Control Resuscitation. , Springer International Publishing. Cham, Switzerland. (2020).
  2. Sen Gupta, A. Bio-inspired nanomedicine strategies for artificial blood components. WIREs Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (6), e1464(2017).
  3. Ding, L., et al. Engineered Red Blood Cell Biomimetic Nanovesicle with Oxygen Self-Supply for Near-Infrared-II Fluorescence-Guided Synergetic Chemo-Photodynamic Therapy against Hypoxic Tumors. ACS Applied Materials & Interfaces. 13 (44), 52435-52449 (2021).
  4. Sang, W., et al. Oxygen-Enriched Metal-Phenolic X-Ray Nanoprocessor for Cancer Radio-Radiodynamic Therapy in Combination with Checkpoint Blockade Immunotherapy. Advanced Science. 8 (4), 2003338(2021).
  5. Kim, H., et al. Upconverting nanoparticle-containing erythrocyte-sized hemoglobin microgels that generate heat, oxygen and reactive oxygen species for suppressing hypoxic tumors. Bioactive Materials. 22, 112-126 (2023).
  6. Wang, Y., et al. Highly Penetrable and On-Demand Oxygen Release with Tumor Activity Composite Nanosystem for Photothermal/Photodynamic Synergetic Therapy. ACS Nano. 14 (12), 17046-17062 (2020).
  7. Liu, L., et al. Hemoglobin based oxygen carrier and its application in biomedicine. Coordination Chemistry Reviews. 532, 216508(2025).
  8. Mohanto, N., Mondal, H., Park, Y. -J., Jee, J. -P. Therapeutic delivery of oxygen using artificial oxygen carriers demonstrates the possibility of treating a wide range of diseases. Journal of Nanobiotechnology. 23 (1), 25(2025).
  9. Cao, M., et al. Hemoglobin-Based Oxygen Carriers: Potential Applications in Solid Organ Preservation. Frontiers in Pharmacology. 12, 760215(2021).
  10. Jansman, M. M. T., Hosta-Rigau, L. Recent and prominent examples of nano- and microarchitectures as hemoglobin-based oxygen carriers. Advances in Colloid and Interface Science. 260, 65-84 (2018).
  11. Coll-Satue, C., Bishnoi, S., Chen, J., Hosta-Rigau, L. Stepping stones to the future of haemoglobin-based blood products: clinical, preclinical and innovative examples. Biomaterials Science. 9 (4), 1135-1152 (2021).
  12. Taguchi, K., Maruyama, T., Otagiri, M. Pharmacokinetic properties of hemoglobin vesicles as a substitute for red blood cells. Drug Metabolism Reviews. 43 (3), 362-373 (2011).
  13. Rameez, S., Alosta, H., Palmer, A. F. Biocompatible and Biodegradable Polymersome Encapsulated Hemoglobin: A Potential Oxygen Carrier. Bioconjugate Chemistry. 19 (5), 1025-1032 (2008).
  14. Pacheco, M. O., et al. Silk Fibroin Particles as Carriers in the Development of Hemoglobin-Based Oxygen Carriers. Advanced NanoBiomed Research. 3 (9), 2300019(2023).
  15. Taguchi, Y., Cu, Y., Fei, J., Dai, L., Li, J. Yang Construction and Evaluation of Hemoglobin-BasedCapsules as Blood Substitutes. Advanced Functional Materials. 22, 1446-1453 (2012).
  16. Coll-Satue, C., Jansman, M. M. T., Thulstrup, P. W., Hosta-Rigau, L. Optimization of Hemoglobin Encapsulation within PLGA Nanoparticles and Their Investigation as Potential Oxygen Carriers. Pharmaceutics. 13 (11), 1958(2021).
  17. Jansman, M. M. T., et al. Hemoglobin-based oxygen carriers camouflaged with membranes extracted from red blood cells: Optimization and assessment of functionality. Biomaterials Advances. 134, 112691(2022).
  18. Liu, X., Jansman, M. M. T., Hosta-Rigau, L. Haemoglobin-loaded metal organic framework-based nanoparticles camouflaged with a red blood cell membrane as potential oxygen delivery systems. Biomaterials Science. 8 (21), 5859-5873 (2020).
  19. Grzegorzewski, W., et al. Hemoglobin-Based Oxygen Carriers: Selected Advances and Challenges in the Design of Safe Oxygen Therapeutics (A Focused Review). International Journal of Molecular Sciences. 26 (19), 9775(2025).
  20. Zhu, K., et al. Nanomaterial-related hemoglobin-based oxygen carriers, with emphasis on liposome and nano-capsules, for biomedical applications: current status and future perspectives. Journal of Nanobiotechnology. 22 (1), 336(2024).
  21. Lawson, H. D., Walton, S. P., Chan, C. Metal-Organic Frameworks for Drug Delivery: A Design Perspective. ACS Applied Materials & Interfaces. 13 (6), 7004-7020 (2021).
  22. Lian, X., Chen, Y. -P., Liu, T. -F., Zhou, H. -C. Coupling two enzymes into a tandem nanoreactor utilizing a hierarchically structured MOF. Chemical Science. 7 (12), 6969-6973 (2016).
  23. Jin, W., et al. Surface engineering of metal-organic framework nanoparticles-based miRNA carrier: Boosting RNA stability, intracellular delivery and synergistic therapy. Journal of Colloid and Interface Science. 677, 429-440 (2025).
  24. Wang, Q., et al. Hemoglobin coated oxygen storage metal-organic framework as a promising artificial oxygen carrier. Journal of Materials Chemistry B. 9 (19), 4002-4005 (2021).
  25. Jin, W., et al. Small RNA stabilization via non-covalent binding with a metalloporphyrin nanocage to accomplish synergistic gene and photodynamic therapy. Cell Reports Physical Science. 3 (12), 101187(2022).
  26. Douka, D., et al. Hemoglobin-loaded ZIF-8 nanoparticles functionalized with human serum albumin as stealth, stable, and biocompatible oxygen carriers. Nanoscale Advances. 7 (24), 8058-8073 (2025).
  27. Liang, K., et al. Biomimetic mineralization of metal-organic frameworks as protective coatings for biomacromolecules. Nature Communications. 6 (1), 7240(2015).
  28. Douka, D., Jin, W., Cantallops-Iglesias, C., Dieste-Izquierdo, A., Thulstrup, P. W., Hosta-Rigau, L. Optimization and Investigation of Hemoglobin-Loaded ZIF-90 Metal-Organic Framework Nanoparticles as Artificial Oxygen Carriers. Particle & Particle Systems Characterization. 42 (3), 2400189(2025).
  29. Noori, R., Maarof, N. N. N., Alshatteri, A. H. High-efficiency encapsulation and pH-triggered release of docetaxel from folic acid-functionalized ZIF-90 nanocarriers. RSC Advances. 15 (53), 45347-45358 (2025).
  30. Poryvaev, A. S., et al. Guest Leakage from ZIF-8 Particles under Drug Delivery Conditions: Quantitative Characterization and Guest-Induced Framework Stabilization. The Journal of Physical Chemistry C. 125 (28), 15606-15613 (2021).
  31. Valenzano, L., et al. Disclosing the Complex Structure of UiO-66 Metal Organic Framework: A Synergic Combination of Experiment and Theory. Chemistry of Materials. 23 (7), 1700-1718 (2011).
  32. Jarai, B. M., Stillman, Z., Attia, L., Decker, G. E., Bloch, E. D., Fromen, C. A. Evaluating UiO-66 Metal-Organic Framework Nanoparticles as Acid-Sensitive Carriers for Pulmonary Drug Delivery Applications. ACS Applied Materials & Interfaces. 12 (35), 38989-39004 (2020).
  33. Hou, T., Huang, Y., Wang, X., Hu, X., Guan, P. Preparation of lysozyme-imprinted mesoporous Zr-based metal-organic frameworks with remarkable specific recognition. Talanta. 265, 124896(2023).
  34. Parvizifard, G., Alipour, E., Soltani, S., Hosseini, M. G. Development of a novel voltammetric aptasensor for highly sensitive detection of cardiac troponin I, utilizing ciprofloxacin-loaded UIO-66 metal-organic frameworks. Talanta. 296, 128471(2026).
  35. Jin, W., et al. Biorthogonal PEGylation of Hierarchical Porous Metal-Organic Frameworks as Robust, Functional Nanocarriers for Hemoglobin-Based Oxygen Delivery. Journal of the American Chemical Society. 147 (47), 43400-43414 (2025).
  36. Cai, G., Jiang, H. -L. A Modulator-Induced Defect-Formation Strategy to Hierarchically Porous Metal-Organic Frameworks with High Stability. Angewandte Chemie International Edition. 56 (2), 563-567 (2017).
  37. Wen, S., Fu, Q., Yan, L., Zhao, X. Hierarchically porous three-dimensional-ordered macro-microporous metal-organic frameworks: Design, precise synthesis, and applications. Coordination Chemistry Reviews. 517, 215996(2024).
  38. Bunzen, H. Chemical Stability of Metal-Organic Frameworks for Applications in Drug Delivery. ChemNanoMat. 7 (9), 998-1007 (2021).
  39. Bůžek, D., Adamec, S., Lang, K., Demel, J. Metal-organic frameworks vs. buffers: case study of UiO-66 stability. Inorganic Chemistry Frontiers. 8 (3), 720-734 (2021).
  40. Chen, X., Argandona, S. M., Melle, F., Rampal, N., Fairen-Jimenez, D. Advances in surface functionalization of next-generation metal-organic frameworks for biomedical applications: Design, strategies, and prospects. Chem. 10 (2), 504-543 (2024).
  41. Sanità, G., Carrese, B., Lamberti, A. Nanoparticle Surface Functionalization: How to Improve Biocompatibility and Cellular Internalization. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 587012(2020).
  42. Chen, X., et al. Formulation of Metal-Organic Framework-Based Drug Carriers by Controlled Coordination of Methoxy PEG Phosphate: Boosting Colloidal Stability and Redispersibility. Journal of the American Chemical Society. 143 (34), 13557-13572 (2021).
  43. Wang, S., McGuirk, C. M., d'Aquino, A., Mason, J. A., Mirkin, C. A. Metal-Organic Framework Nanoparticles. Advanced Materials. 30 (37), 1800202(2018).
  44. Abánades Lázaro, I., Haddad, S., Sacca, S., Orellana-Tavra, C., Fairen-Jimenez, D., Forgan, R. S. Selective Surface PEGylation of UiO-66 Nanoparticles for Enhanced Stability, Cell Uptake, and pH-Responsive Drug Delivery. Chem. 2 (4), 561-578 (2017).
  45. Verhoef, J. J. F., Anchordoquy, T. J. Questioning the use of PEGylation for drug delivery. Drug Delivery and Translational Research. 3 (6), 499-503 (2013).
  46. Sheffey, V. V., Siew, E. B., Tanner, E. E. L., Eniola-Adefeso, O. PLGA's Plight and the Role of Stealth Surface Modification Strategies in Its Use for Intravenous Particulate Drug Delivery. Advanced Healthcare Materials. 11 (8), 2101536(2022).
  47. Suk, J. S., Xu, Q., Kim, N., Hanes, J., Ensign, L. M. PEGylation as a strategy for improving nanoparticle-based drug and gene delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 99, 28-51 (2016).
  48. Siegel, N., et al. Universal Click-Chemistry Approach for the DNA Functionalization of Nanoparticles. Journal of the American Chemical Society. 146 (25), 17250-17260 (2024).
  49. Chen, J., Liu, X., Jansman, M. M. T., Thulstrup, P. W., Hosta-Rigau, L. Metal-Phenolic Networks as Broad-Spectrum Antioxidant Coatings for Hemoglobin Nanoparticles Working as Oxygen Carriers. Chemistry of Materials. 34 (20), 9200-9211 (2022).
  50. Evans, T. G., Salinger, J. L., Bingel, L. W., Walton, K. S. Determining Surface Areas and Pore Volumes of Metal-Organic Frameworks. Journal of Visualized Experiments. (205), e65716(2024).
  51. Coll-Satue, C., Jansman, M. M. T., Hosta-Rigau, L. Comparative Evaluation of UV-Vis Spectroscopy-Based Approaches for Hemoglobin Quantification: Method Selection and Practical Insights. Biomolecules. 14 (9), 1046(2024).
  52. Osterrieth, J. W. M., et al. How Reproducible are Surface Areas Calculated from the BET Equation. Advanced Materials. 34 (27), 2201502(2022).
  53. Drenchev, N. L., et al. In situ FTIR Spectroscopy as a Tool for Investigation of Gas/Solid Interaction: Water-Enhanced CO2 Adsorption in UiO-66 Metal-Organic Framework. Journal of Visualized Experiments. (156), e60285(2020).
  54. Li, F., Zheng, K., Zhang, H., Duan, C., Xi, H. Nanoscale Hierarchically Porous Metal-Organic Frameworks: Facile Synthesis, Mechanism Research, and Application. ACS Sustainable Chemistry & Engineering. 7 (13), 11080-11087 (2019).
  55. Liu, G., Luo, Q., Wang, H., Zhuang, W., Wang, Y. In situ synthesis of multidentate PEGylated chitosan modified gold nanoparticles with good stability and biocompatibility. RSC Advances. 5 (86), 70109-70116 (2015).
  56. Ben-Haim, A. E., et al. DNA Delivery to Intact Plant Cells by Casein Nanoparticles with Confirmed Gene Expression. Advanced Functional Materials. 34 (16), 2314756(2024).
  57. Gourianov, N., Kluger, R. Conjoined Hemoglobins. Loss of Cooperativity and Protein−Protein Interactions. Biochemistry. 44 (45), 14989-14999 (2005).
  58. Doustkhah, E., Hassandoost, R., Khataee, A., Luque, R., Assadi, M. H. N. Hard-templated metal-organic frameworks for advanced applications. Chemical Society Reviews. 50 (5), 2927-2953 (2021).
  59. Li, C., et al. Metal Organic Framework Cubosomes. 62 (11), Angewandte Chemie International Edition. e202215985(2023).
  60. Peng, S., et al. Metal-Organic Framework Encapsulating Hemoglobin as a High-Stable and Long-Circulating Oxygen Carriers to Treat Hemorrhagic Shock. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (39), 35604-35612 (2019).
  61. Gu, X., Palmer, A. F. ZIF-8 Metal-Organic Framework Nanoparticles Loaded with Hemoglobin as a Potential Red Blood Cell Substitute. ACS Applied Nano Materials. 5 (4), 5670-5679 (2022).
  62. Pullen, S., Clever, G. H. Mixed-Ligand Metal-Organic Frameworks and Heteroleptic Coordination Cages as Multifunctional Scaffolds-A Comparison. Accounts of Chemical Research. 51 (12), 3052-3064 (2018).
  63. Pastore, V. J., Cook, T. R., Rzayev, J. Polymer-MOF Hybrid Composites with High Porosity and Stability through Surface-Selective Ligand Exchange. Chemistry of Materials. 30 (23), 8639-8649 (2018).
  64. Obeso, J. L., Huxley, M. T., De Los Reyes, J. A., Humphrey, S. M., Ibarra, I. A., Peralta, R. A. Low-Valent Metals in Metal-Organic Frameworks Via Post-Synthetic Modification. Angewandte Chemie International Edition. 62 (49), e202309025(2023).
  65. Zhang, X., Malhotra, S., Molina, M., Haag, R. Micro- nanogels with labile crosslinks - from synthesis to biomedical applications. Chemical Society Reviews. 44 (7), 1948-1973 (2015).
  66. Biscarat, J., Charmette, C., Masquelez, N., Sanchez, J., Pochat-Bohatier, C. Crosslinking of gelatin membranes with ferulic acid or glutaraldehyde: Relationship between gas permeability and renaturation level of gelatin triple helices. Journal of Polymer Science Part B: Polymer Physics. 53 (4), 280-287 (2015).
  67. Kurian, P., et al. Synthesis, permeability and biocompatibility of tricomponent membranes containing polyethylene glycol, polydimethylsiloxane and polypentamethylcyclopentasiloxane domains. Biomaterials. 24 (20), 3493-3503 (2003).
  68. Liu, X., Jansman, M. M. T., Li, W., Kempen, P., Thulstrup, P. W., Hosta-Rigau, L. Metal-organic framework-based oxygen carriers with antioxidant protection as a result of a polydopamine coating. Biomaterials Science. 9 (21), 7257-7274 (2021).
  69. Srinivasu, B. Y., Bose, B., Mitra, G., Kurpad, A. V., Mandal, A. K. Adsorption Induced Changes of Human Hemoglobin on Ferric Pyrophosphate Nanoparticle Surface Probed by Isotope Exchange Mass Spectrometry: An Implication on Structure-Function Correlation. Langmuir. 33 (32), 8032-8042 (2017).
  70. Chen, K., et al. Low Modulus Biomimetic Microgel Particles with High Loading of Hemoglobin. Biomacromolecules. 13 (9), 2748-2759 (2012).
  71. Dyachenko, A., Gruber, R., Shimon, L., Horovitz, A., Sharon, M. Allosteric mechanisms can be distinguished using structural mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (18), 7235-7239 (2013).
  72. Coll-Satue, C., et al. A novel PEG-mediated approach to entrap hemoglobin (Hb) within ZIF-8 nanoparticles: Balancing crystalline structure, Hb content and functionality. Biomaterials Advances. 163, 213953(2024).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи