$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Подготовка образца
Разделение белка из нутовой муки (МФ)
Кабулийский нут (Cicer arietinum L.), собранный в вегетационный сезон 2025 года и полученный в юго-восточной Турции, был обработан с помощью ударной системы воздушного классификатора, в которой частицы подвергались центробежным силам и повторяющимся ударам о шлифовальный диск и кольцевую шестерню. После начального этапа предварительного помола крупная зерна дополнительно измельчалась для получения CF с помощью воздушного классификатора. Во время ударной фрезерной обработки применялись расход воздуха 40-45м 3/ч, скорость классификатора 7 000–8 000 об/ч и скорость подачи 200 кг/ч в соответствии с ранее описанными условиями эксплуатации и внутренним протоколом оптимизации, описанным влитературе 8.
Белкосодержащие мелкие частицы впоследствии получались из CF путём классификации воздуха при температуре окружающей среды, используя ту же систему классификаторов воздуха. Скорость колес классификатора была установлена на 10 000 об/мин, при этом скорость подачи поддерживалась примерно на уровне 200 кг/ч, а поток воздуха — 52 м³/ч, как былоописано ранее, 8. Этот этап сепарации избирательно обогащал белковую фракцию на основе различий в размерах, плотности частицах и аэродинамических свойствах.
После классификации воздуха полученный порошок проявил мелкое распределение размеров частиц (d(0,9) = 20-22 мкм); поэтому не применялся этап просеивания для предотвращения потери материала и ненужных механических напряжений. Фракция, обогащённая белком, была непосредственно упакована в полиэтиленовые мешки массой 25 кг, промываемые газом, и хранилась при 4 °C для минимизации поглощения влаги и сохранения функциональных свойств до дальнейшей обработки.
Подготовка наноэмульсии
CPC использовался в качестве единственного эмульгирующего агента для приготовления нефтяных (O/W) NE, направленных на активную концентрацию белка 3,0% w/v в конечной формуле. Эта концентрация была выбрана на основе предварительных скринингов с показателями 1,0% ва/в, 2,0% с водой и 3,0% ч/в CPC, которые показали, что 3,0% обеспечивают наиболее эффективное уменьшение размера капель и наивысшую кратковременную физическую стабильность. Исходя из измеренного содержания белка в порошке CPC (44,8% w/w), требуемая концентрация порошка составляла 6,67% w/v. CPC функционировал как эмульгатор в непрерывной водной фазе, тогда как среднецепочечное триглицеридное масло (MCT) использовалось исключительно в дисперсной фазе масла при фиксированной концентрации 5,0% v/v, что соответствует 5,0 мл масла на 100 мл формулы. В каких-либо формулировках поверхностно-активные вещества с низкой молекулярной массой не использовались9.
Водная дисперсия CPC была подготовлена путём растворения рассчитанного количества порошка CPC в сверхчистой воде при непрерывном магнитном перемешивании на скорости 800 об/мин в течение 1800 секунд для обеспечения полной гидратации и однородного дисперсионного белка. Полное увлажнение подтверждалось отсутствием видимых частиц или осадков.
Масляная фаза затем медленно добавлялась в гидратированный раствор CPC при непрерывном перемешивании, после чего проводилась высокосдвиговая гомогенизация при 12 000 об/мин в течение 240 секунд, что приводило к образованию грубой (традиционной) эмульсии, визуально отличающейся по однородному, непрозрачному виду без видимого разделения масла. Эти условия были выбраны для предотвращения агрегации белков при обеспечении достаточного нарушения капель.
Затем NE были получены путём зондовой звуковой обработки крупной эмульсии с амплитудой 30% в течение 180 с, выполненной в ледяной водяной ванне для поддержания температуры образца ниже 30 °C и предотвращения агрегации белков. Температура контролировалась периодически во время звуковой обработки. Предварительные оптимизационные эксперименты (данные отсутствуют) оценивали время соникации в 60, 120 и 180 с, и 180 с было выбрано как оптимальное условие на основе воспроизводимого образования NE с диаметром капель менее 200 нм и низким PDI. Поэтому все NE, описанные в этом исследовании, были подготовлены с использованием оптимизированного времени соникации в 180 с.
Успешное формирование на северо-востоке подтверждалось видом стабильной, слегка опалесцентной дисперсии без фазового разделения после 1800 секунд стояния. Образцы с видимой кремовой или фазовой сепарацией были исключены из дальнейшего анализа. Все образцы были уравновешены до комнатной температуры (25 ± 2 °C) до физико-химической характеристики9.
ВНИМАНИЕ: Обработка высокоэнергетического оборудования (гомогенизатора и соникатора) проводилась в соответствии с институциональными лабораторными процедурами безопасности. Во время звуковой обработки использовались защита слуха и защита от разбрызгива. При приготовлении эмульсии не использовались кислоты или основания; поэтому не требовалось никаких химических нейтрализации или утилизации опасных отходов.
Питательная и физико-химическая характеристика нутовой муки (CF) и концентрата белка нута (CPC)
Композиционный анализ
Пищевой состав образцов CF и CPC был определен с помощью официальных методов анализа Ассоциации официальных аналитических химиков (AOAC). Сырая клетчатка была проанализирована по AOAC 991.43, общая зола — по AOAC 923.03, сырый жир — по AOAC 920.39, а сырый белок — по AOAC 984.13, с использованием коэффициента преобразования азота в белок N × 6.25. Общее содержание углеводов во всех образцах определялось по разнице путём вычитания суммы влаги, белка, жира и пепла из 100%3.
Цветовой анализ
Цветовые параметры образцов измерялись с помощью настольного колориметра, работающего в режиме отражания. До проведения измерений прибор стандартизировался с использованием чёрно-белых калибровочных стандартов, предоставленных производителем. Для обеспечения равномерных и воспроизводимых измерений 5,0 г порошкового образца аккуратно загружали в круглую стеклянную кювету (внутренний диаметр 64,0 мм) для создания гладкой, однородной поверхности. Была нанесена достаточная толщина слоя (≥ 50,0 мм), чтобы минимизировать влияние субстрата и фоновых эффектов, а также сделать полупрозрачный порошок эффективно непрозрачным при отражательных условиях. Все измерения проводились в режиме отражения при комнатной температуре.
Цветовые координаты выражались в цветовом пространстве CIELAB, где L* — свет (0 = чёрный, 100 = белый), a* — красно-зелёная ось, а b* — жёлто-синяя ось. Дополнительные цветовые параметры, включая полную цветовую разницу (ΔE*), хрому (C*), угол оттенка (H°) и цветовой индекс (CI), были рассчитаны согласно уравнениям, описанным в11 (уравнения 1–4), следующим образом:
(Экв. 1)
(Экв. 2)
(Экв. 3)
(Экв. 4)
Анализ pH
pH образцов CF и CPC определялся с помощью цифрового pH-метра с стеклянным электродом путём непосредственного введения электрода в дисперсию образца при температуре 25,0 ± 2,0 °C. До измерения pH-метр калибровали стандартными буферными растворами (pH 4,0 и 7,0). Все измерения проводились в трёхкратном (n = 3) для обеспечения аналитической воспроизводимости.
Влажность
Остаточное содержание влаги в образцах CF и CPC было определено с помощью быстрого анализатора влажности, работавшего в контролируемых условиях нагрева. Все измерения проводились в тройных экземплярах (n = 3) для обеспечения аналитической воспроизводимости.
Структурная и функциональная характеристика CPC
XRD-анализ
XRD-анализ CPC проводился с помощью лабораторного рентгеновского дифрактометра, оснащённого излучением Cu-Kα (λ = 1,5406 Å). Дифрактограммы были записаны в диапазоне 2θ от 10° до 90° при частоте сканирования 2,5° мин-1, работая при 40 мА и 45 кВ, следуя ранее сообщеннойпроцедуре 12.
Идентификация пиков, фоновый вычитание и подгонка кривых проводились с использованием стандартного программного обеспечения для анализа XRD. Степень кристаллизации рассчитывалась как отношение интегрированной площади кристаллических отражений к общей площади под дифрактограммой согласно методу, описанномув 13, как показано в уравнении (5):
(Экв. 5)
Видимый размер кристаллита (D) был оценён по данным XRD с использованием уравнения Шеррера (уравнение 6), применённого к самым интенсивным дифракционным пикам:
(Уравнение 6)
где D — видимый размер кристаллита (нм), K — коэффициент формы (предполагается 0,9), λ — длина волны рентгеновского излучения, β — полная ширина на половине максимума (FWHM, в радианах) выбранного пика дифракции, а θ — угол Брэгга.
Анализ дифференциального сканирующего калориметрии (DSC)
Анализ дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC) для муковисцидозов и CPC проводился с использованием лабораторного дифференциального сканиирующего калориметра. Примерно 10,0 ± 0,1 мг образца тщательно взвешивали и запечатали в вогнутом алюминиевом тигле с проколотой крышкой, а пустой алюминиевый тигель использовался в качестве эталона. Измерения проводились в атмосфере азота (20 мл/мин) для минимизации окисляющего эффекта. Образцы нагревались от 0 °C до 400 °C при постоянной скорости нагрева 5 °C min-1 при динамическом сканировании. Перед анализом проводились калибровки температуры и чувствительности для обеспечения точности и воспроизводимости измерений.
Тепловые переходы характеризулись определением начальной температуры (T o), пиковой температуры (Tp), конечной температуры (Te) и изменения энтальпии (ΔH), связанного с каждым переходом. Кроме того, были рассчитаны эндотермическая пиковая ширина (EPW) и индекс пиковой высоты (PHI) согласно эквивалентам. (7) и (8) соответственно:
EPW= (Te−Tp) (Уравнение 7)
PHI =ΔH/(Tp− To) (экв. 8)
Пеноспособность (FC) и стабильность (FS)
Пеноспособность (FC) и устойчивость пены (FS) водной дисперсии CPC (3,0 г/л) оценивались при pH 7,0 с необходимостью с использованием 0,1 N соляной кислоты (HCl). 30 мл аликвота белка была передана в полипропиленовые центрифугные трубки объемом 50 мл и гомогенизирована с помощью высокоскоростного гомогенизатора, работающего на 11 000 об/мин в течение 120 секунд для получения пены. Образование пены было визуально подтверждено быстрым увеличением объёма образца и формированием стабильного слоя пены сразу после гомогенизации.
FC рассчитывался как процентное увеличение объёма сразу после гомогенизации, тогда как FS определялся на основе удерживаемого объёма пены после 600 с, 1 800 с, 3 600 с и 7 200 с. Все измерения проводились в трёхкратном (n = 3), а значения FC и FS рассчитывались по уравнениям. (9) и уравнения. (10), соответственно14:
(Экв. 9)
(Экв. 10)
ВНИМАНИЕ: Разбавленная соляная кислота была обработана с использованием соответствующих лабораторных мер безопасности, включая перчатки и защиту глаз. Отходные растворы утилизировались в соответствии с институциональными рекомендациями по химической безопасности.
Физико-химическая стабильность КПК и НЭ на основе КПК
Средний размер частиц и распределение размеров частиц
Распределение размеров частиц и Z-средний гидродинамический диаметр образцов определялись с помощью динамического светового рассеяния (DLS). Для характеристики среднего размера капли и равномерности распределения размеров размера (PDI) были зафиксированы Z-средний гидродинамический диаметр и индекс полидисперсности (PDI) соответственно15,16.
Перед измерением образцы разбавлялись дистиллированной водой в соотношении 1:100 (v/v) для минимизации множественного рассеяния и обеспечения надёжных измерений рассеяния света. Анализы проводились при контролируемой температуре 25 ± 2 °C. PDI использовался как индикатор однородности распределения размеров капель, при этом более низкие значения PDI соответствовали более узким распределениям размеров. Измерения проводились на 0-й день (свежеприготовленные NE) и после 7 дней хранения для оценки краткосрочной физической стабильности системыNE 16. Образцы, имеющие видимое кремирование, осаждение или фазовое разделение до измерения, были исключены из анализа DLS.
ζ-потенциал частиц
Был определен ζ-потенциал образцов для оценки суммарного поверхностного заряда и электростатической устойчивости капель с помощью электрофоретического рассеяния света (ELS), следуя ранее описаннымметодологиям 15,16. Измерения проводились при контролируемой температуре 25,0 ± 2 °C, а неразбавленные образцы использовались для сохранения исходной ионной среды NE.
Средние значения ζ-потенциала и соответствующие стандартные отклонения были рассчитаны для каждого образца для оценки электростатических взаимодействий и коллоидной устойчивости эмульсий. Все измерения проводились с использованием воды в качестве диспергатора, согласно установленным условиям
Внутренняя стандартная операционнаяпроцедура 15. Образцы, показывающие видимое фазовое разделение или креминг до анализа, были исключены из измерений ζ-потенциала.
Валидация методов и ожидаемые результаты
Валидация метода была достигнута путём оценки ключевых физико-химических параметров, включая Z-средний гидродинамический диаметр, PDI, ζ-потенциал и физическую устойчивость при напряжении. Успешное выполнение протокола поддерживалось воспроизводимым образованием NE с размером капель ниже 200 нм и PDI ≤0,30. Для дальнейшей проверки устойчивости за пределами простого хранения был проведён стресс-тест центрифугирования при 4000 об/мин в течение 900 секунд. Отсутствие видимой фазовой сепарации или крема после центрифугирования, в сочетании с стабильными профилями ζ-потенциала и pH за 7 дней хранения, в совокупности подтверждает надёжную эмульсифицирующую способность CPC и воспроизводимость предлагаемого протокола.
Статистический анализ
Составные и функциональные измерения проводились в тройных экземплярах (n=3), а структурные анализы (XRD и DSC) проводились как единичные измерения, репрезентативные забеги. Результаты представлены как среднее значение ± стандартного отклонения (SD). Статистические оценки проводились с использованием одностороннего анализа дисперсии (ANOVA) в программном обеспечении SPSS. Для всех анализов p-значение < 0,05 считалось статистической значимостью. В случаях, когда были выявлены значимые различия, для множественных сравнений применялся пост-фактический тест Tukey Honestly Significant Difference (HSD). Статистические связывающие буквы (например, a, b, c), представленные в таблицах и рисунках, были получены на основе результатов теста Tukey HSD; Означает, что использование одной буквы не существенно отличается на уровне значимости 5%.