Здесь представлен стандартный метод эффективной изоляции стволовых клеток и адипоцитов, полученных из жира, характеризующийся сокращением времени обработки на >90%, высокой жизнеспособностью клеток и широкой совместимостью.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Эффективная изоляция стволовых клеток, полученных из адипоза, и адипоцитов из жировой ткани свинины
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Стволовые клетки, полученные из адипоза (ADSC), стали идеальными семянными клетками в регенеративной медицине благодаря своим обильным источникам, минимально инвазивному сбору, многолинейному дифференциационному потенциалу и иммуномодуляционным свойствам. Их применения охватывают восстановление тканей, моделирование заболеваний и клеточную терапию; однако эффективная изоляция высокожизнеспособных ADSC остаётся критически важной для продвижения исследований и клинической трансляции. Традиционные методы изоляции, такие как ферментативное переваривание в сочетании с механической диссоциацией с помощью пипетирования, ограничены длительными сроками обработки (1–3 часа), низкой жизнеспособностью клеток (часто <70%) и значительной вариабельностью от партии к партии, что ухудшает последующие эксперименты.
Здесь представлена система SoniConvert (механическая система разделения клеток на основе волн), которая сочетает механическую волновую и ферментативную расщепление для решения этих задач. Система интегрирует микропроцессорный управляющий блок, регулирующий механическую волновую диссоциацию с помощью цифровой обратной связи, а также тканеспецифический реагент, оптимизированный для жировой ткани (инкубация 5–15 мин). Этот подход позволяет быстро превратить ткань в одноклеточную суспензию, при этом механическая диссоциация завершается за 3–9 секунд.
Система обладает тремя преимуществами: (1) сверхбыстрая обработка, при этом процесс выделения ядра — от ферментативного переваривания до начального разделения клеточной фракции — завершается примерно за 30 минут (>90% снижение по сравнению с традиционными методами); (2) высокая жизнеспособность сохранения, при этом трипан-синий окрашивание подтверждает жизнеспособность клетки 80–95%, превышающее традиционные протоколы; и (3) широкой совместимости, поскольку полученные суспензии из одной клетки соответствуют требованиям первичной клеточной культуры, проточной цитометрии, анализов цитотоксичности и конструкции жировых органоидов. Сокращая время обработки, повышая целостность клеток и ограничивая вариабельность, эта система предоставляет практическую платформу для исследований, связанных с жирами.
Введение
Стволовые клетки, полученные из адипозов (ADSC), критически важным подмножеством мезенхимальных стволовых клеток (MSC), выделенных из жировой ткани, обладают значительным терапевтическим потенциалом благодаря своей доступности, минимально инвазивному забору, устойчивой пролиферативной способности, многолинейному дифференциационному потенциалу и мощным паракриновым и иммуномодуляторнымсвойствам 1,2,3,4 . Эти характеристики сделали ADSC перспективными кандидатами для регенеративной медицины, тканевой инженерии и иммунотерапии. Однако трансляционная полезность ADSC зависит от способности изолировать функционально целые, высокочистые популяции — процесс, который остаётся технически сложным. Уникальная биология жировой ткани вводит два основных препятствия: (1) высокое содержание липидов в адипоцитах делает их уязвимыми к разрыву в ходе механической обработки, высвобождая свободные липиды, загрязняющие стромальную сосудистую фракцию (SVF) и снижая жизнеспособность клеток и даютих 5,6; и (2) структурная сложность ткани, включающая фасцию, эндотелиальные клетки, иммунные клетки и компонентыкрови 7, усложняет разделение клеток, полученных из жира. Эти ограничения подчёркивают острую необходимость эффективного, быстрого и сохраняющего жизнеспособность метода изоляции высококачественных ADSC и адипоцитов, которые столь же критичны для дальнейших приложений, таких как моделирование метаболических заболеваний и клеточные терапии.
В настоящее время доступны несколько проверенных методов для выделения клеток, полученных из жира, включая ферментативное переваривание, эксплантную культуру и механическоеразделение 8,9,10. Ферментативное пищеварение, наиболее широко распространённый подход, использует коллагеназу для разложения компонентов внеклеточного матрикса (ECM), высвобождая инкапсулированные стволовые клетки. Этот метод обычно включает измельчение тканей, расщепление коллагеназы (37 °C, 1–2 часа), выделение SVF с помощью центрифугирования и очистку приклеенной культуры. Хотя ферментное пищеварение эффективно для распада ЭКМ, оно имеет заметные недостатки: длительное время обработки (всего 3–4 часа), зависимость от больших объёмов образцов и риски ферментативной цитотоксичности или вариативности от партии к партии коллагеназ животного происхождения — всё это затрудняет клиническую трансляцию. Эксплантическая культура, использующая миграцию стволовых клеток из фрагментов ткани, даёт клетки с сохраненной жизнеспособностью, но страдает от низкой пропускной способности и задержки восстановления клеток (7–10 дней). Механическая диссоциация, основанная на физических нарушениях (например, колебаниях, сдвигах), сокращает время обработки, но часто нарушает целостность клеток, что приводит к снижению жизнеспособности и нечистым популяциям. В совокупности эти методы не совмещают эффективность, чистоту и жизнеспособность — ключевые критерии для клинической изоляции клеток. Таким образом, мы предлагаем новый метод выделения клеток, полученных из жиров (адипоцитов и ADSC), который сочетает ферментативное расщепление с механической волновой диссоциацией11. Этот подход достигает двух ключевых достижений: (1) эффективность по времени: за счёт сочетания предварительно оптимизированных ферментных коктейлей без животных с низкочастотными механическими волнами сокращает общее время обработки с 3–4 часа до ~30 минут (рисунок 1); (2) Сохранение жизнеспособности: мягкая механическая дисперсия минимизирует разрыв адипоцитов и высвобождение липидов. Важно, что 30-минутный таймпровал относится к основному процессу изоляции (переваривание, механическая диссоциация, фильтрация и начальная центрифугировка) для получения примылых фракций адипоцитов и SVF; опциональные этапы очистки, такие как лизис эритроцитов (эритроцит), требуют дополнительного времени обработки.
Наш оптимизированный метод изоляции жировых клеток демонстрирует значительный потенциал для применения в различных исследовательских и клинических областях. В фундаментальных исследованиях полученные клетки с высокой жизнеспособностью демонстрируют исключительные результаты в адипогенных и остеогенных дифференциациях, обеспечивая надёжный источник клеток для приложений в тканевой инженерии. В трансляционной медицине клинические исследования продемонстрировали терапевтический потенциал ADSC при лечении таких заболеваний, как остеоартрит12, сердечно-сосудистыезаболевания 13, рассеянныйсклероз 14 и воспалительное заболевание кишечника (IBD)/болезньКрона 15. Быстро изолированные ADSC служат идеальными строительными блоками для создания органоидов жировой ткани и внедрения приложений клеточной терапии, значительно продвигая исследования скрининга лекарств и моделирования заболеваний. Кроме того, высококачественные одноклеточные суспензии подходят для секвенирования одноклеточной РНК. В заключение, этот интегрированный подход создаёт надёжную технологическую платформу для жировой ткани, поддерживая как фундаментальные исследования, так и клиническую трансляцию в регенеративной медицине.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все исследования на животных проводились в соответствии с Правилами управления делами, касающимися экспериментальных животных (Министерство науки и технологий Китая, пересмотренное в марте 2017 года) и утверждены Комитетом по этике и благополучию животных Сычуаньского сельскохозяйственного университета (номер разрешения: 20230089). Этот протокол требует использования системы SoniConvert — коммерчески доступного устройства для механической волновой диссоциации тканей (далее — механическая диссоциация). Протокол оптимизирован для жировой ткани свиней, и его зависимость от этого специализированного оборудования является ключевым ограничением.
1. Сбор и подготовка жировой ткани
- Предоперационная дезинфекция и удаление волос
- Усыпить свинью путём внутривенной передозировки пентобарбитала натрия (100 мг/кг массы тела). Подтвердите смерть до сбора тканей.
- Примените стерильную марлю, пропитанную 2% йодофором, для спиральной дезинфекции спинной части свинины, на расстояние 15 см от средней линии. Дайте высохнуть 30 секунд.
- Используйте стерильную бритву, чтобы сбрить волосы с участка от 16 см × 8 см. Убедитесь, что все волосы удалены из операционной зоны.
- Протрите заднюю часть дважды 75% этанолом, используя стерильную марлю.
- Сбор жировой ткани
- Сделайте поперечный разрез шириной 20 см вдоль спинной средней линии с помощью стерильного скальпеля.
- Поднимите край разреза стерильными щипцами. Рассекать по естественной плоскости между жировой тканью и дермой, чтобы получить полный верхний слой подкожной жировой ткани (ULB) толщиной примерно 2–3 мм.
- Промыйте ULB один раз в ледяной стерильной физиологической жидкости и поместите в стерильную культурную чашу (рисунок 2).
Рисунок 2: Сбор ULB свиньи для выделения клеток. (A) Иллюстрация структуры жировой ткани спины свиней; (B) Место вырубки минипига Бама; (C) Представление жировой ткани спины, подкожный жир у пигбэка содержит два слоя — верхний слой (ULB) и внутренний слой (ILB); (D) Собранный ULB. Аббревиатура: ULB = верхний слой спины; ILB = внутренний слой спины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.
Точка паузы: собранная жировая ткань может храниться в ледяной стерильной физиологической жидкости или растворе D-Hanks при 4 °C в течение короткого времени перед дальнейшим вскрытием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Цель — собрать ULB. Избегайте включения нижнего слоя подкожной жировой ткани спины (ILB) во время диссекции.
- Рассечение и очистка жировой ткани
- Добавьте 10 мл ледяного буфера D-Hanks на каждые 1,8 г ткани и убедитесь, что ткань полностью погружена под воду.
- Выявите и удалите все видимые кровеносные сосуды из ткани с помощью стерильных хирургических ножниц. Удалять соединительные ткани и фиброзные компоненты. Выбросить вырезанные материалы в специальные контейнеры для биологической опасности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте крайне осторожны при работе с острыми предметами; Всегда отрезайте от корпуса и сразу после использования выбрасывайте использованные лезвия и ножницы в контейнеры для острого изделия. - Прополосните ткани внутри буфера D-Hanks, чтобы удалить остатки крови и остатка.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для образцов с высокой гематомой замените буфер 1–3 раза по мере необходимости для визуальной чёткости. Все этапы вскрытия держать на льду для сохранения жизнеспособности тканей.
- Механическая диссоциация жировой ткани
- Перенесите 1,8 г промытых фрагментов ткани в стерильную микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл. Добавьте 800 мкл буфера диссоциации тканей типа A (A-буфера) в пробирку.
- Используя стерильные офтальмологические ножницы, измельчите ткань в трубке на мелкие кусочки размером примерно 1–2мм 3 дюйма.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если во время или после измельчения наблюдается значительная утечка липид, затем промыйте ткань 1 мл предварительно охлаждённого раствора D-Hanks перед ферментативным перевариванием для удаления липидов из поврежденных адипоцитов. Этот этап сохраняет целостность адипоцитов для дальнейшего анализа.
2. Изоляция и гомогенизация клеток
- Ферментативная обработка
- Добавьте 200 мкл агента для диссоциации тканей типа А (раствор типа А) в новую микроцентрифугную трубку. Аккуратно поверните и встряхните трубку вручную три раза, чтобы смешать содержимое и убедиться, что жировые фрагменты полностью погружены в раствор диссоциации.
- Убедитесь, что крышка трубки плотно закрыта. Поместите трубку в металлическую ванну при температуре 37 °C и инкубуйте 5–10 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за раствором, пока он не станет мутным, а фрагменты ткани не станут частично переваренными. Раствор типа A содержит коллагеназу и нейтральную протеазу. При обращении носите нитриловые перчатки, лабораторный халат и защитные очки. Избегайте контакта с кожей; Если воздействие происходит, немедленно прополосните обильной водой в течение 15 минут. A-Buffer не будет отбрасывается после добавления A-Type Solution.
- Ультразвуковая механическая диссоциация
- Переместить частично переваренные фрагменты жировой ткани вместе с окружающим буфером из микроцентрифугной трубки в стерильную микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл, предназначенную для системы механической диссоциации.
- Запустите предустановленную программу для жировой ткани в системе механической диссоциации, чтобы выполнить механическую диссоциацию с помощью синусоидальной волны 200 Гц.
3. Фильтрация для получения суспензии с одной ячейкой
- Фильтрация и центрифугирование
- Соберите суспензию клетки и пропустите её через 200-мкм клеточный фильтр в новую центрифугную трубку на 50 мл, чтобы удалить крупные мусоры и непереваренные комки тканей.
- Добавьте 5 мл предварительно охлаждённого (4 °C) раствора D-Hanks в сито. Промывайте сито раствором D-Hanks дважды, чтобы максимизировать выход клетки.
- Центрифугировать фильтрованную ячейку при 500 × г в течение 5 минут при 4 °C.
Точка паузы: после центрифугирования суспензия клетки может быть обработана немедленно или недолго держаться на льду перед отделением слоя. - Сбор адипоцитов: Для сбора адипоцитов аспирируют и удаляют супернатантный липидный слой с помощью стерильной пипетки Пастера, оставляя 1 мл буфера для защиты слоя адипоцитов. Соберите второй слой для дальнейшего анализа адипоцитов. Избегайте беспокойства третьего и четвёртого слоёв.
- Сбор SVF (стромальная сосудистая фракция): После удаления верхних слоёв аккуратно подвешивают нижний гранул, содержащий стромальную сосудистую фракцию (SVF), в 1 мл D-Hanks/PBS. Аккуратно суспензируйте клеточную гранулу в 1 мл D-Hanks/PBS, чтобы получить концентрацию клетки 2–5 × 106 клеток/мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале после центрифугирования можно наблюдать четыре слоя: липидный слой сверху; второй слой, содержащий адипоциты; третья — гидрофильный буферный слой; а нижний слой — SVF, содержащий стволовые клетки (рисунок 1).
- Лизис эритроцитов
- ПРИМЕЧАНИЕ: Если клеточная гранула проявляет значительный красный цвет, указывающий на загрязнение эритроцитами, проведите лиз эритроцитов.
Повторно суспензировать клеточную гранулу в 1–3 мл буфера лизиса эритроцитов (эритроцитов) с помощью пипетки P1000 с широкими наконечниками. Инкубировать на льду 15 минут с редким перемешиванием. - Предварительное охлаждение всех растворов и центрифуг роторов до 4 °C, чтобы минимизировать метаболическую активность во время обработки.
- Центрифугу при 500 × г в течение 10 минут при 4 °C. Полностью аспирируйте супернатант.
- Промыйте ячейки ещё раз, снова суспенируя гранулу в 5 мл предварительно охлаждённого раствора D-Hanks и центрифугая при 500 × г на 5 минут при 4 °C. Отбросьте супернатант.
- ПРИМЕЧАНИЕ: Если клеточная гранула проявляет значительный красный цвет, указывающий на загрязнение эритроцитами, проведите лиз эритроцитов.
- Окончательная подвеска
- Подвесьте конечную ячейку в D-Hanks/PBS для последующих применений.
4. Последующее применение и анализ
- Жизнеспособность клеток SVF и оценка выхода клетки
- Подготовьте суспензию SVF-ячейки, полученную в микроцентрифуге объёмом 1,5 мл. Держите подвеску на льду до использования.
- Смешайте 10 мкл суспензии ячейки SVF с 10 мкл раствора 0,4% Trypan Blue в стерильной микроцентрифугной трубке объемом 0,5 мл. Аккуратно поднимайте и опускайте пипетку 3 раза, чтобы перемешивать равномерно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Итоговая концентрация Trypan Blue в смеси составляет 0,2%. Избегайте появления воздушных пузырьков во время смешивания, так как они могут мешать автоматическому подсчёту ячеек.
Перенесите 10 мкл окрашенной ячеточной смеси на подсчётное стекло, подходящее для автоматического счётчика ячеек. Убедитесь, что образец полностью заполняет камеру без переполнения. - Вставьте счётный слайд в счётчик ячеек. Выберите тип анализа Trypan Blue и при необходимости отрегулировать диапазон концентрации ячейки.
- Нажмите кнопку Count, чтобы начать автоматический подсчёт ячеек. Инструмент будет фиксировать изображения камеры счёта и автоматически различать живые клетки от мёртвых.
- Запишите процент жизнеспособности ячеек и посчитайте общее количество жизнеспособных ячеек, отображаемых на экране прибора. Проведите три независимых измерения для каждого образца и рассчитайте среднюю жизнеспособность и выход клетки на грамм жировой ткани.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очищайте подсчётный затвор и порт загрузки прибора 70% этанолом после каждого использования, чтобы предотвратить перекрёстное загрязнение между образцами.
- Наблюдение морфологии адипоцитов
- Окрашивайте изолированные адипоциты с температурой 5 мкг/мл Hoechst для ядер и 1 мкм BODIPY для липидов в D-Hanks/PBS в течение 15 минут при 37 °C.
Точка паузы: После окрашивания образцы следует быстро сфотографировать; при необходимости их можно недолго хранить от света при 4 °C перед микроскопией. - Используйте самодельную систему стеклянного стекла, удобную для адипоцитов, чтобы избежать сжатия клеток.
- Наблюдайте ядра (окрашенные Hoechst) и липидные капли (окрашенные BODIPY) под флуоресцентным микроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за большого размера (20–300 мкм) и высокого содержания липидов адипоциты хрупкие, склонны плавать и накапливаться в несколько слоёв, что делает традиционные методы крепления неподходящими для чёткого микроскопического наблюдения (см. рисунок 3A). Для решения этой проблемы была разработана самодельная система крепления, дружелюбная к адипоцитам, с использованием стандартных затворов и накладок (рисунок 3B).
- Окрашивайте изолированные адипоциты с температурой 5 мкг/мл Hoechst для ядер и 1 мкм BODIPY для липидов в D-Hanks/PBS в течение 15 минут при 37 °C.
- Очистка стромальных сосудистых компонентов и морфологическое наблюдение АДСК
- Посеять свежеизолированный SVF в термоклеточную колбу T25, содержащую 5 мл DMEM, дополненную 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицином. Инкубировать при 37 °C с 5% CO₂.
- Через 48 часов аккуратно промыйте колбу 2 раза с предварительно подогреным PBS, чтобы удалить неприлипающие клетки. Добавьте свежую культурную среду и продолжайте инкубацию.
- Заменяйте посевную среду каждые 2–3 дня. Контролируйте морфологию и слияние клетки под перевёрнутым микроскопом.
- Когда слияние клеток достигает 80–90% (обычно через 7–10 дней), отделяйте их с помощью 0,25% трипсина-ЭДТА на 3–5 минут при 37 °C. Нейтрализуйте культурной средой и собирайте суспензию клетки.
- Проведите окрашивание Trypan Blue, чтобы определить жизнеспособность клетки до обнаружения и сортировки FACS.
- Наблюдайте морфологию очищенных культивированных ADSC под оптическим микроскопом.
- Отфильтруйте собранную суспензию клетки через решето размером 70 мкм, чтобы удалить оставшиеся агрегаты. Суспензировать клетки в PBS, содержащие 2% FBS, для анализа FACS.
- Окрашить клетки фторохром-конъюгированными антителами против CD73, CD90, CD11b и CD45 в течение 30 минут при 4 °C в темноте.
- Промой клетки 2 раза с буфером для окрашивания и снова суспенгируй в PBS с 2% FBS.
- Проведите цитометрический анализ потока с использованием сопла 70 мкм при давлении 20 psi и расходе ниже 3,0.
- Исключать ячеточный мусор, используя параметры прямого рассеяния (FSC-A) и бокового рассеяния (SSC-A).
- Удалите дублеты с помощью FSC-A по сравнению с FSC-H гейтингом и выберите жизнеспособную популяцию синглетов для дальнейшего анализа.
- Анализировать закрытые клетки на основе экспрессии поверхностных маркеров. Используйте CD73 и CD90 в качестве положительных маркеров, а CD11b и CD45 — как отрицательные маркеры для подтверждения фенотипа ADSC.
- Наблюдайте морфологию обогащённых и культивируемых ADSC под оптическим микроскопом. Характерная веретенообразная, фибробластоподобная морфология указывает на успешное обогащение ADSC.
- ADSC адипогенная дифференцировка
- Сеять третье поколение ADSC с плотностью 1 × 104 ячейки/см². Когда слияние клеток достигает примерно 90%, начинайте адипогенную индукцию.
- Приготовьте адипогенную индукционную среду с использованием высокоглюкозной модифицированной среды Eagle's Medium (DMEM) от Dulbecco, содержащей 10% сыворотки плода бычьего скота (FBS), 0,5 мМ 3-изобутил-1-метилксантин (IBMX), 1 мкм дексаметазона, 10 мкг/мл инсулина и 1 мкм розиглитазона.
- После 3 дней индукции замените среду на поддерживающую среду и меняйте раствор каждые 2 дня.
- После 14 дней индукции окрашивайте клетки маслом Red O и наблюдайте за каплями липидов под перевёрнутым микроскопом.
- Остеогенная дифференцировка ADSC
- Когда слияние клеток достигает 80–90%, начинается остеогенная индукция. Сформулировать остеогенную индукционную среду с высоким содержанием глюкозы DMEM, содержащую 10% FBS, 10 мМ β-глицерофосфата, 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты, 10 мкм кальцитриола и 1 мкМ дексаметазона.
- Меняйте среду каждые 2–3 дня и продолжайте процесс индукции примерно 14 дней.
- Окрашивайте клетки с 2% ализарина Red S (pH 5,2) и наблюдайте их под перевёрнутым микроскопом.
- Построение и идентификация органоидов
- Подготовьте суспензию ADSC в полной культурной среде и отрегулируйте концентрацию клеток до 2 × 104 клеток на 20 мкл.
- Переверните крышку посевной чаши диаметром 100 мм и нанесите 20 мкл суспензии клетки на внутреннюю поверхность крышки.
- Добавьте стерильный PBS на дно блюда для поддержания влажности, аккуратно накройте крышку и инкубуйте подвесные капли в стандартных условиях культуры.
- Наблюдайте за каплями ежедневно и позволяйте клеткам собираться и формировать сфероиды в течение 6 дней.
- Аккуратно соберите сфероиды с помощью пипетки и переложите их в заранее охлаждённый матригель на льду.
- Внедрить сфероиды в Matrigel и разместить смесь в культивные пластины перед инкубацией в стандартных условиях.
- Регулярно заменяйте среду и контролируйте рост органоидов до 18–28 дней, когда структуры станут компактными и созрели.
- Зафиксируйте органоиды 4% параформальдегида, пермеабилизируйте их с помощью 0,1% тритона X-100 и блокируйте неспецифическое связывание с помощью 5% BSA.
- Инкубировать образцы первичными антителами против CD73, CD90, CD11b и CD45, а затем инкубировать их соответствующими флуоресцентными вторичными антителами.
- Окрашивайте органоиды Hoechst и BODIPY для визуализации ядра и липидных капель соответственно, и наблюдайте окрашенные образцы под флуоресцентным микроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите сортировку клеток и все манипуляции с открытыми культурами, включая посев, подкормку и окрашивание, в строгих асептических условиях в шкафу для биобезопасности.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Рисунок 1: Схематическая иллюстрация процесса изоляции клеток, полученных из жира. Диаграмма изображает традиционный метод и настоящий метод как иллюстративные рабочие процессы. Для выделения клеток, полученных из жира, проходят три основных этапа: первый — предварительная обработка; второй — диссоциация жиро...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В данном исследовании представлен новый интегрированный подход к выделению клеток, полученных из жира (в основном адипоцитов и ADSC), который учитывает критические ограничения традиционных методов. Сочетая тканево-специфическое ферментативное расхлабывание с точной механической волновой диссоциацией, эта система достигает быстрого (общее время обработки ~30 мин), высокой жизнеспособности (80–95%) и воспроизводимой изоляции клеток.
Традиционное ферментное пищев...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы Цзыи Чжао и Цзяин Ю сотрудничают с компанией Chengdu DosSense Biotech Co., Ltd, которая производит систему SoniConvert (SC-L1W) и набор для диссоциации жировой ткани (TM008), используемый в этом протоколе. Остальные авторы не заявляют о конкурирующих интересах.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (Ли М: 32421005 и 32225046, Лу Л: 32472857); научно-технические проекты автономного района Сицзан Китая (XZ202501ZY0147 до М.Л.); Китайский фонд постдокторских наук (Lu L: 2024M763881); специальное финансирование постдокторских исследований в Чунцине (Lu L: 2023CQBSHTB3098); Национальную/провинциальную программу подготовки студентов бакалавриата по инновациям и предпринимательству (Lu L: 202510626001); и основной проект по сельскохозяйственной науке и технике.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Набор для диссоциации типовых тканей | Docsense | TM001 | Содержит типовый тканевой диссоциационный агент (раствор типа A) и типовый буфер для диссоциации тканей (A-буфер). |
| Набор для адипогенной дифференциационной среды | OriCell | GUXMD-90031 | Используется для адипогенной дифференцировки, включая высокосодержательную глюкозу — модифицированную среду Eagle's Eagle (немодифицированную) и поддерживающую среду Dulbecco |
| Ализарин Ред С | OriCell | A5533ALIR-10001 | Окрашивание минерализации для остеогенной дифференцировки (pH 5.2) |
| Аскорбиновая кислота | Сигма-Олдрич | A4544 | L-аскорбиновая кислота, тестированная клеточная культура, для остеогенной индукции |
| Минисвинки Бама | Компания Chengdu Dossy Experimental Animals Co., Ltd | Однолетние, самцы, животные класса SPF, содержащиеся в соответствии со стандартизированными процедурами вакцинации, дегельминтивы и чистки.https://www.cd-dossy.cn/animalpl_detail/12606067609851863 04.html | |
| Автоматический счётчик клеток Bio-Rad TC20 | Био-Рад Лаборатории | 1450011 | Автоматический счётчик ячеек для оценки жизнеспособности и дохода |
| БОДИПИ | Термо Фишер Сайентифик | D3922 | Нейтральная липидная морилка |
| BSA (5%) | Сигма-Олдрич | A9418 | Бычий сывороточный альбумин, лиофилизированный порошок, для блокировки |
| Кальцитриол | Сигма-Олдрич | C9756 | 1&альфа;,25-дигидроксивитамин D<суб>3 для остеогенной индукции |
| Клеточное сито (70 & Mu; m) | Корнинг | 352350 | Falcon 70 &m; Сито m-ячей, стерильное, для подготовки образца FACS |
| Клеточное сито (200 μ m) | pluriSelect | 43-50200-03 | pluriStrainer, PET-сетка, подходит для трубок объемом 50 мл, стерильно и bbsp; |
| центрифугная трубка (50 мл) | Корнинг | 352098 | Коническая трубка Falcon 50 мл высокой прозрачности, стерильная, полипропилен |
| Счётный слайд (для Bio-Rad TC20) | Био-Рад Лаборатории | 1450011 | Двухкамерный счётный слайд для автоматического счётчика ячейок TC20 и nbsp; |
| Культурное блюдо (100 мм) | Корнинг | 430167 | Стерильная полистироловая тарелка для подвесной формации капель-органоидов |
| Дексаметазон | Сигма-Олдрич | D4902 | ≥ 98% для адипогенной и остеогенной индукции |
| Сбалансированный сольный раствор D-Hanks или PBS | Gibco | 10010015 | Предварительное охлаждение до 4 градусов; C, pH 7,4. |
| DMEM | Gibco | 11965084 | Это используется для выращивания свежей изолированной SVF |
| DNase I | Beyotime | D7073 | Необязательно, рекомендуется при наблюдаемом скуплении. |
| этанол | Сигма-Олдрич | 459836 | 75% — для дезинфекции поверхности. |
| Сыворотка для плода быка (FBS) | Gibco | A4736201 | Утверждена система Tet, американского происхождения, стерильная |
| Потоковый цитометр | BD Biosciences | BD FACSCanto II | 3 лазера (405 нм, 488 нм, 633 нм), 8 флуоресцентных каналов для анализа поверхностных маркеров (CD73, CD90, CD11b, CD45), соответствует 70  m требуется сопло при давлении 20 psi |
| Флуоресцентный микроскоп | Олимп | Инвертированная или вертикальная модель, способная использовать наборы фильтров FITC и DAPI. | |
| Флуоресцентные вторичные антитела | Термо Фишер Сайентифик | A-11001 (против мышей), A-11008 (против кролика) | Конъюгированная Alexa Fluor для иммунофлуоресценции |
| Антитела, конъюгированные с фторхромом (CD73, CD90, CD11b, CD45) | BD Biosciences | 561254 (CD73), 561970 (CD90), 557321 (CD11b), 555485 (CD45) | Для проточного цитометрического анализа фенотипа ADSC |
| Hoechst | Термо Фишер Сайентифик | H3570 | Ядерное окрашивание для оценки живых/мёртвых клеток. |
| IBMX | Сигма-Олдрич | I5879 | ≥ 99% (ВЭЖХ), для адипогенной индукционной среды |
| Ледяной стерильный физиологический раствор | Бакстер | 2F7124 | Инъекция хлорида натрия 0,9%, USP, для промывания салфеток |
| Инсулин | Сигма-Олдрич | I9278 | Рекомбинант, выраженный в дрожжах, для адипогенной индукции |
| Йодофор | Сигма-Олдрич | 25104 | 2% дезинфицирующий раствор. |
| Матригель | Корнинг | 354230 | Фактор роста снижен, фенол без красного цвета, для вложения сфероидов и bbsp; |
| Металлическая ванна | Servicebio | SMB-H | Используется для инкубации при 37°C. |
| Oil Red O | OriCell | OILR-10001 | Липидное окрашивание для дифференцировки адипоцитов |
| Оптический микроскоп | Олимп | Стандартный яркий микроскоп с 10x– 40-кратных целей. | |
| Набор для остеогенной дифференциационной среды | OriCell | GUXMD-90021 | Используется для остеогенной дифференцировки, включая высокоглюкозный средний материал Dulbecco (немодифицированный) и поддерживающий материал Dulbecco |
| Пипетка P1000 с широкими наконечниками | Бекман Коултер | B01113 | Biomek P1000 Span-8 широкие наконечники, стерильные |
| Параформальдегид (4%) | Термо Фишер Сайентифик | J61899 | Водный раствор для фиксации органоидов |
| Пипетка Пастера | Корнинг | 7095S-5C | Стерильный, одноразовый. |
| Пенициллин-стрептомицин | Gibco | 15070063 | 10 000 U/mL пенициллина, 10 000 и мл; g/mL стрептомицин, стерильный и nbsp; |
| Пентобарбитал натрий | Hikma Pharmaceuticals USA Inc. | 24201-010-20 | Инъекционный для эвтаназии (100 мг/кг массы тела, внутривенно). ANDA 203619 |
| Первичные антитела (CD73, CD90, CD11b, CD45) | BD Biosciences | 561254 (CD73), 561970 (CD90), 557321 (CD11b), 555485 (CD45) | Для органоидного иммунокрашивания |
| Буфер лизиса эритроцитов (эритроцитов) | Solarbio | R1010 | Если требуется для последующих приложений. |
| Рефрижераторная центрифуга | Эппендорф | 5702R | Используется для этапов центрифугации при 4°C. |
| Розиглитазон | Cayman Chemical | 71740 | ≥ 98%, PPAR и гамма; агонист для адипогенной индукции |
| Контейнер для острых предметов | Бектон Дикинсон | 305270 | Устойчивый к проколам контейнер для использованных лезвий и ножниц |
| Система подготовки подвески с одной ячейкой SoniConvert | Docsense | SC-L1W | Используется для механической диссоциации тканей. |
| Буфер для окрашивания (буфер для окрашивания проточной цитометрии) | eBioscience (Thermo Fisher Scientific) | 00-4222-57 | 200 мл, готовый к использованию, содержит FBS и 0,09% натриевый азид в качестве консерванта для разбавления антител и клеток, поверхностного окрашивания и промывки в проточной цитометрии |
| Стерильная трубка Эппендорфа объёмом 1,5 мл | Эппендорф | 30121.517 | Стерильная микроцентрифугная трубка с безопасным замком для измельчения тканей |
| Стерильная культурная тарелка | Корнинг | 430167 | Стерильная посевная чаша размером 100 мм x 20 мм, для сбора тканей |
| Стерильные щипцы | Склар | 96-1719 | Стерильные щипцы для большого пальца, зубчатые, для обработки тканей |
| Стерильная марля | Корпорация Dukal | 7060033 | Стерильные марлевые прокладки для дезинфекции и протирания |
| Стерильные офтальмологические ножницы | Склар | 10023-580 | Пружинные ножницы в стиле Ваннаса для измельчения тканей на 1-2 мм и sup3; Произведения |
| Стерильная бритва | 3M | 9681 | Хирургическая подготовка бритвы для удаления волос из операционной зоны |
| Стерильный скальпель | Integra Miltex | 4-415 | Стерильный одноразовый скальпель для нанесения разреза |
| Стерильные хирургические ножницы | Склар | 10022-580 | Merit Sterile Iris Scissors, для вскрытия кровеносных сосудов и соединительной ткани |
| Фляжка с культурой клеток T25 | Корнинг | 430639 | Колба для культуры клеток Falcon T25, вентиляционная крышка, стерильная |
| Triton X-100 (0,1%) | Сигма-Олдрич | T8787 | Лабораторный класс, для проницаемости |
| Trypan Blue | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Решение 0,4% для подсчёта жизнеспособности клеток. |
| Трипсин-ЭДТА (0,25%) | Gibco | 25200056 | 0,25% трипсина, 1 мМ EDTA, для отсоединения ADSC |
| &бета;-глицерофосфат | Сигма-Олдрич | G9422 | Пентагидрат соли динатрия для остеогенной индукции |
Ссылки
- Qin, Y., et al. An update on adipose-derived stem cells for regenerative medicine: where challenge meets opportunity. Adv Sci. 10 (20), 1-27 (2023).
- Wang, L., et al. A review of adipose-derived mesenchymal stem cells’ impacts and challenges: metabolic regulation, tumor modulation, immunomodulation, regenerative medicine and genetic engineering therapies. Front Endocrinol. 16, 1606847(2025).
- Suchanecka, M., et al. Adipose derived stem cells – sources, differentiation capacity and a new target for reconstructive and regenerative medicine. Biomed Pharmacother. 186, 118036(2025).
- Su, H., et al. Bridging the gap: clinical translation of adipose-derived stem cells - a scoping review of clinical trials. Stem Cell Res Ther. 16 (1), 288(2025).
- Alexandersson, I., Harms, M. J., Boucher, J. Isolation and culture of human mature adipocytes using membrane mature adipocyte aggregate cultures (MAAC). J Vis Exp. (156), e60485(2020).
- Attané, C., Estève, D., Moutahir, M., Reina, N., Muller, C. A protocol for human bone marrow adipocyte isolation and purification. STAR Protoc. 2 (3), 100629(2021).
- Emont, M. P., Rosen, E. D. Exploring the heterogeneity of white adipose tissue in mouse and man. Curr Opin Genet Dev. 80, 102045(2023).
- Uguten, M., et al. Comparing mechanical and enzymatic isolation procedures to isolate adipose-derived stromal vascular fraction: a systematic review. Wound Repair Regen. 32 (6), 1008-1021 (2024).
- Villanueva-Carmona, T., Cedó, L., Núñez-Roa, C., Maymó-Masip, E., Vendrell, J., et al. Protocol for the in vitro isolation and culture of mature adipocytes and white adipose tissue explants from humans and mice. STAR Protoc. 4 (4), 102693(2023).
- Cohen, M., et al. Adipose tissue explant culture using PDMS flow chambers: an alternative to static explant culture. Adipocyte. 14 (1), (2025).
- Liu, Y., Zhao, H., Yu, J., et al. A novel laboratory-based strategy for single adipocyte and adipose-derived stem cells extraction for transplantation: an experimental research. Aesthet Plast Surg. 49, 367-379 (2025).
- Tangkanjanavelukul, P., et al. Cartilage regeneration potential in early osteoarthritis of the knee: a prospective, randomized, open, and blinded endpoint study comparing adipose-derived mesenchymal stem cell (ADSC) therapy versus hyaluronic acid. Int J Mol Sci. 26 (17), 8476(2025).
- Qayyum, A. A., et al. Effect of allogeneic adipose tissue-derived mesenchymal stromal cell treatment in chronic ischaemic heart failure with reduced ejection fraction – the SCIENCE trial. Eur J Heart Fail. 25 (4), 576-587 (2023).
- Arab, F. L., et al. Safety and feasibility of intravenous fresh adipose-derived mesenchymal stem cells in secondary progressive multiple sclerosis: phase I/IIa clinical results. Stem Cell Res Ther. 17, 120(2026).
- Sheykhhasan, M., et al. Therapeutic potential and mechanistic insights into adipose-derived stem cells and mesenchymal stem cell-derived exosomes in patients with Crohn’s disease-associated fistulas: challenges and future perspectives. Stem Cell Res Ther. 16, 664(2025).
- Dufau, J., et al. In vitro and ex vivo models of adipocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 320 (5), C822-C841 (2021).
- Ghazal, S. K., et al. Adipose tissue-derived stem cells: a comparative review on isolation, culture, and differentiation methods. Cell Tissue Bank. , 1-16 (2021).
- Zhu, R., et al. Isolation methods, proliferation, and adipogenic differentiation of adipose-derived stem cells from different fat depots in bovines. Mol Cell Biochem. , (2023).
- Benitez, G. J., Shinoda, K. Isolation of adipose tissue nuclei for single-cell genomic applications. J Vis Exp. (160), e61230(2020).
- Basatvat, S., Bach, F. C., Barcellona, M. N., et al. Harmonization and standardization of nucleus pulposus cell extraction and culture methods. JOR Spine. 6 (1), e1238(2023).
- Escudero, M., et al. Scalable generation of pre-vascularized and functional human beige adipose organoids. Adv Sci. 2301499, 1-20 (2023).
- Mandl, M., et al. An organoid model derived from human adipose stem/progenitor cells to study adipose tissue physiology. Adipocyte. 11 (1), 164-174 (2022).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
