Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Секвенирование одноклеточной РНК ткани лёгких в модели острого респираторного дистресс-синдрома у крыс

442 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70491

⸱

7 апреля 2026 г.

 ,  , 
1Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье представлен стандартизированный протокол анализа секвенирования одиночных РНК (scRNA-seq) лёгких тканей в модели острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС) у крыс. В нём подробно описаны этапы от создания модели, индуцируемой LPS, до биоинформатического анализа, выявление 21 клеточных кластеров и 6 макрофаговых субпопуляций, а также выделены ключевые воспалительные пути, участвующие в патогенезе ОРДС.

Аннотация

Острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС) — это тяжёлое воспалительное заболевание лёгких с высокой смертностью, характеризующееся нарушением иммунных ответов и повреждением альвеоляр, однако его клеточная гетерогенность остаётся неполностью изученной. Секвенирование одноклеточных РНК (scRNA-seq) обеспечивает беспрецедентную разрешение для анализа механизмов, специфичных для типа клеток, но его применение в ОРДС затруднено технической вариабельностью. Здесь мы представляем стандартизированный протокол анализа SCRNA-seq лёгковой ткани в модели ARDS крыс, индуцируемой липополисахаридами (LPS). Этот метод включает оптимизированную диссоциацию тканей, строгий контроль качества, удаление дублетов, корекцию эффекта пакетов и комплексные биоинформатические конвейеры для кластеризации, аннотации и дифференциального анализа экспрессии. Наш подход надёжно выявляет 21 отдельную популяцию клеток и выявляет шесть субпопуляций макрофагов/моноцитов с уникальными транскрипционными сигнатурами в ОРДС. Субкластер-специфический дифференциальный экспрессический анализ генов и анализ функционального обогащения дополнительно выявили ключевые гены и пути, лежащие в основе патогенеза ОРДС. Этот воспроизводимый рабочий процесс позволяет глубоко характеризуть клеточное разнообразие, воспалительные пути и кандидатные терапевтические цели, обеспечивая прочную основу для механистических и трансляционных исследований в ОРДС.

Введение

Острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС) — это острое респираторное заболевание, характеризующееся диффузным воспалением лёгких и некардиогенным отёком лёгких, которое в основном проявляется как прогрессирующая гипоксемия и дыхательнаянедостаточность 1,2. Патологические механизмы ОРДС включают нарушение воспалительных каскадов, нарушение альвеолярно-капиллярного барьера, а также аномальную активацию и взаимодействие множества типов иммунныхклеток 3,4. Во время прогрессирования ОРДС иммунные клетки в ткани лёгких запускают воспалительные каскады через секрецию воспалительных медиаторов и модуляцию иммунных ответов, тем самым нарушая эндотелий лёгких, запуская активацию внешнего каскада свертывания и усугубляя повреждение лёгких 5,6,7. Однако современное понимание патологических механизмов клеточного уровня при ОРДС остаётся ограниченным, что ограничивает разработку специфических фармакологических методов, в то время как текущие стратегии управления в основном состоят из различных методов кислородной поддержки и механическойвентиляции воздуха. Глубокая характеристика клеточной гетерогенности и динамических изменений во время патогенеза ОРДС имеет первостепенное значение для выявления новых терапевтических целей и разработки новых стратегийлечения 8,9,10.

Появление технологии секвенирования одноклеточной РНК (scRNA-seq) принесло революционные прорывы в исследованиях секвенирования РНК, позволив нам разбирать клеточную гетерогенность и функциональную динамику в патогенезе заболеваний11,12. По сравнению с традиционным секвенированием объёмной РНК, технология scRNA-seq позволяет выявлять редкие, но критически важные субпопуляции клеток, выявлять динамические процессы переходов состояния клеток и выявлять сложные межклеточные сети взаимодействия — информацию, которая часто маскируется в анализах на уровнепопуляций 13, 14, 15. Недавние исследования scRNA-seq в ОРДС достигли значительных успехов, включая идентификацию специфических сигнатур экспрессии генов моноцитов, открытие аномальных поляризационных паттернов макрофагов и разъяснение профиброзных межклеточных коммуникационныхсетей 16,17,18,19 . Эти результаты не только углубляют наше понимание патофизиологических механизмов ОРДС, но и дают новые знания о разработке биомаркеров, стратификации заболеваний и точной терапии 20,21.

Однако текущие исследования SCRNA-seq ОРДС сталкиваются с проблемами, такими как недостаточная методологическая стандартизация, значительные различия в протоколах обработки образцов и непоследовательные конвейеры анализа данных, что ограничивает воспроизводимость результатов исследований и их клинические трансляционныеприменения 22,23. Этот протокол решает технические задачи, связанные с анализом SCRNA-seq лёгких тканей ОРДС, оптимизируя процедуры обработки тканей, контроля качества и анализа данных, тем самым создавая основу для механистических исследований и терапевтических разработок. Стандартизированный подход обеспечивает воспроизводимость в разных лабораториях и способствует сравнительным исследованиям клеточной гетерогенности в ОРДС.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Двенадцать специфических самцов рода Sprague-Dawley (SD) в возрасте 6–7 недель весом 220 г ± 10 г были приобретены у Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Номер лицензии для животных: SCXK (Jing) 2025-0008). Крысы содержались в Центре лабораторных животных больницы Дунчжимэнь Пекинского университета китайской медицины в соответствии с национальным стандартом «Требования лабораторных животных к окружающей среде и жилищным объектам» (GB 14925-2010, выданному Национальным техническим комитетом по стандартизации лабораторных животных Китая). Экспериментальные процедуры были одобрены Комитетом по защите животных и этике больницы Дунчжимэнь Пекинского университета китайской медицины (номер одобрения: 24-54). Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Создание моделей и сбор образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед экспериментом всех крыс пропустите 1-недельный период акклиматизации, чтобы минимизировать стрессовые эффекты.

  1. Растворить липополисахарид Escherichia coli (LPS) в 0,9% физиологическом растворе для получения раствора LPS с концентрацией 0,4 мг/мл.
  2. Случайным образом разделите 12 самцов крыс Sprague-Dawley (SD) SPF на две группы: контрольную группу (n = 6) и модельную группу ARDS (n = 6).
  3. Вводите 0,9% физиологического раствора внутритрахеально при дозе 0,5 мл/100 г массы тела в контрольную группу.
  4. Введите раствор LPS с концентрацией 0,4 мг/ мл инъекцией внутритрахеально в том же объёме (0,5 мл/100 г) в модельную группу ARDS, а после 16 часов анестезируйте крыс с помощью изофлурана (согласно утверждённым институционально протоколам).
  5. Собирайте кровь через брюшную аорту, затем проводите центрифугу (4 °C, 1000 × г, 30 минут) для получения сыворотки.
  6. Откройте грудную полость и извлеките ткань лёгких.
  7. Проведите бронхоальвеолярную промывку через бронхиальный пень, используя шприц, чтобы получить бронхоальвеолярную жидкость для лаважа (BALF)24,25.
  8. Возьмите правую долю лёгких и прополосните её PBS для последующего патологического обследования.
  9. Взять левую долю лёгких и промыть её PBS для последующих одноклеточных секвенирования и экспериментов по молекулярнойбиологии 26,27.

2. Гистопатологическая оценка легкой ткани

  1. Погрузите добыванную правую лёгкую ткань крыс в 4% параформальдегид для фиксации на 12 часов.
  2. После фиксации обезвоживайте ткань с помощью градированной серии этанола (70%, 80%, 90%, 95%, 100% и 100%), позволяя по 2 часа при каждой концентрации.
  3. Обрабатывайте обезвоженную ткань ксилолом до прозрачности.
  4. Инфильтруйте прозрачную ткань расплавленным парафином в печи при температуре 60 °C в течение 2 часов.
  5. Поместите инфильтрированный блок ткани в форму для встраивания, налейте свежий парафин и дайте ему остыть и затвердеть в парафиновый блок.
  6. Разделите парафиновый блок на срезы толщиной 4 мкм с помощью микротома, поместите их в водяную баню при температуре 45 °C, чтобы распределить, а затем поднимите их с помощью слайдов с поли-L-лизином.
  7. Запекайте слайды в духовке при температуре 60 °C, чтобы обеспечить плотное прилипление секций к слайдам.
  8. Депарафинизируйте секции путём погружения в ксилол и регидратировать их с помощью нисходящего градиента этанола (100%, 95%, 90%, 80% и 70%).
  9. Промыйте секции PBS, проведите окрашивание гематоксилином и эозином (HE), а чехлы закрепите нейтральной смолой.
  10. Оценить повреждение лёгких на срезах с целым слайдом с использованием стандартизированной системы оценки, основанной на инфильтрации нейтрофилов, интерстициального воспаления, отёка и заложенности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый параметр оценивался от 0 до 4 на основе степени патологического вовлечения: 0 (отсутствует); 1 (≤25%); 2 (26-50%); 3 (51-75%); 4 (>75%)28,29.

3. Ферментно-связанный иммуносорбентный анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут поддерживаться при -80 °C, если анализ нельзя провести сразу после отобрания.

  1. Растворите стандарты и дайте им постоять при комнатной температуре 15 минут, затем выполните последовательное разбавление согласно инструкциям производителя.
  2. Приготовьте рабочий раствор для биотинилированных антител, рабочее раствор с ферментом и буфер для промывки, как указано в руководстве.
  3. Добавьте 100 мкл каждого образца или 100 мкл серийно разбавленных стандартов в колодцы, покрытые антителами, и инкубировать при 37 °C в течение 90 минут.
  4. Помойте пластину 4 раза с помощью мойки, добавьте 100 мкл рабочего раствора с биотинилированными антителами и инкубуйте при 37 °C в течение 30 минут.
  5. Промыйте пластину 4 раза, добавьте 100 мкл ферментного рабочего раствора и инкубируете при 37 °C в течение 30 минут.
  6. Добавьте 100 мкл раствора субстрата в каждую скважину, инкубирайте в защите от света при 37 °C в течение 10 минут.
  7. Добавьте 100 мкл стоп-раствора в каждую скважину, аккуратно перемешайте и измерьте оптическую плотность (OD) на 450 нм с помощью считывателя микропластин.
  8. Сгенерируйте стандартную кривую, отображая значения OD по сравнению со стандартными концентрациями с помощью разработанного программного обеспечения.
  9. Определите концентрации образцов на основе измеренных значений OD и стандартной кривой.

4. Подготовка одиночных суспензий для секвенирования

ПРИМЕЧАНИЕ: После получения легкой ткани её следует поместить на лёд и оперативно обработать для поддержания жизнеспособности клеток.

  1. Промыйте ткань легких 3 раза предварительно охлаждённой до 4 °C PBS.
  2. Добавьте 2 мл предварительно охлаждённого PBS и дополнительно измельчите их на мелкие фрагменты стерильными ножницами размером примерно 0,5мм 3 дюйма.
  3. Используйте пипетку Пастера, чтобы переместить измельчённую ткань вместе с PBS в 15-мл-центрифугную трубку.
  4. Добавьте дополнительно 1 мл предварительно охлаждённого до 4 °C PBS в посевную чашу, промыйте и снова суспензуйте оставшиеся фрагменты ткани, а затем перенесите суспензию в ту же трубку.
  5. Отрегулировать объём до 6,5 мл при предварительном охлаждении PBS до 4 °C, переварить фрагменты ткани в ферментном растворе, содержащем коллагеназу I (100 U/mL) и Dispase II (1 U/mL), и инкубировать с лёгким встряхиванием при комнатной температуре в течение 30 минут.
  6. Когда фрагменты ткани становятся полупрозрачными и не остаётся отдельных твёрдых частей, профильтруйте переваренную ткань через клеточные ситечки диаметром 70 мкм и 40 мкм, затем центрифугите (4°C, 500 × г, 5 мин) и выбросьте супернатант.
  7. Немедленно суспензируйте гранулу в 3 мл буфера эритроцитов (эритроцитов), аккуратно перемешайте пипеткой и лизируйте на льде в течение 10 минут.
  8. Когда супернатант становится бледно-жёлтым или почти бесцветным, добавьте 7 мл PBS для прекращения реакции, центрифугуйте (4 °C, 500 × г, 5 мин) и отбрасываете супернатант.
  9. Добавьте 3 мл PBS для повторной суспензии клеток и определения концентрации и жизнеспособности клетки с помощью трипан-синего окрашивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если жизнеспособность клеток ниже 70%, выполните процедуру удаления мёртвых клеток.
  10. Промыйте клетки дважды буфером для промывания, содержащим 0,04% бычий сывороточный альбумин (BSA), приготовленный в DPBS.
  11. Подвесьте ячейки для подсчёта и отрегулируйте концентрацию до 1000 клеток/мкл для последующего нагрузки и обнаружения.

5. Контроль качества данных секвенирования с одной ячейкой

ПРИМЕЧАНИЕ: Одноклеточные РНК-библиотеки были подготовлены из клеточных суспензий с использованием метода построения одноклеточной библиотеки на основе капель. Библиотеки секвенировались на высокопроизводительной платформе с использованием химии секвенирования на основе наношариков ДНК. В одну библиотеку было загружено примерно 21 000 ячеек, что достигало скорости восстановления клетки ~60%. Секвенирование генерировало в общей сложности 5,0 × 108 чтений на библиотеку, со средней глубиной от 30 000 до 40 000 чтений на ячейку. Исходные данные секвенирования были обработаны с использованием соответствующего конвейера анализа одноклеточных РНК для создания матрицы экспрессии генов для каждого образца.

  1. Постройте библиотеку Олиго с помощью ПЦР и маркировки штрихкодов, обеспечивая концентрацию >10 нг/мкл и максимальный размер 180 б.п. ±10 п.п.
  2. Постройте библиотеку cDNA с помощью фрагментации, ремонта концов, лигации адаптеров и ПЦР, обеспечивая концентрацию >10 нг/мкл и пиковый размер 350–550 п.п.
  3. Генерируйте объект Seurat для каждого образца из матрицы экспрессии генов с помощью функции Read10X в пакете Seurat (v4.3.0) в программном обеспечении R (v4.2.0).
  4. Удалять клетки низкого качества, отфильтровав клетки с долей митохондриальных генов >10% или гемоглобина >5%.
  5. Нормализуйте данные с помощью метода «LogNormalize» с коэффициентом масштабирования 10 000.
  6. Определить высоковариабельные признаки с помощью метода «vst» и сохранить 2000 лучших генов для дальнейшего анализа.
  7. Провести оценку клеточных циклов с использованием встроенных маркеров Seurat и регрессировать влияние клеточных циклов (G2M. Score и S.Score) при масштабировании данных.
  8. Обнаружить и удалить потенциальные дублеты с помощью DoubletFinder (v2.0.3) при pN = 0.25, pK = 0.09 и ожидаемой частоте дублётов 0.06, и исключить их из дальнейшей обработки.
  9. Корректировать эффекты пакета между сэмплами с помощью пакета Harmony (v0.1.1) с theta = 2 и max.iter.harmony = 20.
  10. Добавьте информационные столбцы для отдельных названий образцов и группировки групп моделей и контрольной группы ARDS в метаданные объекта Seurat.

6. Уменьшение размерности, кластеризация и аннотация типов ячеек

  1. Провести анализ главных компонентов (PCA) на высоковариабельных генах с использованием функции RunPCA в Сёра.
  2. Определите оптимальное количество основных компонентов с помощью визуализации ElbowPlot.
  3. Определите основные кластеры ячеек с помощью алгоритма Лейдена с помощью функций FindClusters Seurat и функции FindNeighbors с разрешением 0,1.
  4. Проведите уменьшение размерности UMAP с использованием выбранных основных компонентов.
  5. Аннотируйте типы клеток, идентифицируя маркерные гены с функцией FindAllMarkers.
  6. Визуализировать экспрессию генов маркеров между типами клеток с помощью функции DotPlot.
  7. Добавьте новый столбец с результатами аннотаций ячеек в метаданные и визуализируйте аннотацию типов ячейки с помощью Umap.
  8. Вычислите долю каждой экспериментальной группы внутри каждого идентифицированного типа клеток с помощью dplyr-функций для подсчёта ячеек и вычисления процентов.
  9. Генерируйте столбочные графики с ggplot2 для иллюстрации состава группы по типам ячейки, включая процентные метки и статистические сравнения между группами.

7. Анализ субпопуляций

  1. Извлеките целевую подпопуляцию ячеек с помощью функции подмножества и создайте соответствующий объект Seurat для анализа на уровне субпопуляции.
  2. Ренормализовать и перемасштабировать данные субпопуляции, одновременно регрессируя гены митохондрии, гены гемоглобина, показатели UMI и показатели клеточных циклов.
  3. Проведите вторичный анализ PCA и примените пакетную коррекцию Harmony специально для этой субпопуляции.
  4. Провести повторную кластеризацию с помощью функций FindNeighbors и FindClusters для выявления различных подтипов внутри целевых подпопуляций клеток.
  5. Генерируйте новые вложения UMAP и визуализируйте кластеры субпопуляций с аннотациями типов ячеек по тому же подходу, что и ранее.

8. Анализ дифференциальной экспрессии генов

  1. Определить дифференциально экспрессированные гены (DEG) между модельной и контрольной группой ARDS для каждого подкластера с помощью метода статистики MATT.
  2. Включать регрессию латентных переменных для контроля эффектов глубины секвенирования во время дифференциального тестирования экспрессии.
  3. Фильтруйте DEG на основе заранее определённых порогов изменения логарифмичных сгибов и скорректированных p-значений с помощью функции FindMarkers.
  4. Генерируйте вулканические графики с функцией ggplot для каждого подкластера, чтобы визуализировать дифференциальные паттерны экспрессии генов с меткой значимости.
  5. Экспортировать результаты DEG и создавать комплексные сводные таблицы для облегчения функционального обогащения и других последующих анализов.

9. Анализ обогащения

  1. Сопоставьте символы генов с идентификаторами ENTREZ с помощью организации. Rn.eg.db база данных аннотаций для совместимости анализа путей.
  2. Объединить DEG из всех подкластеров и отфильтровать значимые гены на основе порогов изменения логарифмических свержений и скорректированных p-значений (тест Уилкоксона с суммой ранга, logfc.threshold = 0,25, p_val < 0,05).
  3. Проведите анализ обогащения генной онтологии (GO) с использованием функции обогащения GO с использованием категорий биологических процессов, молекулярной функции, онтологии клеточных компонентов и метода коррекции Бенджамини-Хохберга.
  4. Провести анализ обогащения путей Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG) с использованием функции обогащения KEGG с базой данных крысиных организмов и применять статистические пороги значимости.
  5. Генерируйте точечные диаграммы для результатов обогащения GO и KEGG с помощью функции dotplot, отображая топ-15 значительно обогащённых терминов с генными соотношениями и скорректированными p-значениями.
  6. Экспортируйте результаты обогащения в виде CSV-файлов и сохраняйте графики визуализации для комплексной интерпретации анализа путей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Окрашивание HE ткани лёгких крыс показало чёткие альвеолярные структуры с минимальным воспалением у контрольных групп, тогда как в группе модели ARDS наблюдались искажённые альвеолярные полости, утолщённые стенки и значительную инфильтрацию воспалительных клеток, что показано соответствующими показателями повреждений лёгких (рисунок 1A–E). Повышенные уровни IL-6, TNF-α и IL-1β в BALF и сыворотке подтвердили успешное моделирование и системный...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол представляет стандартизированный подход к анализу секвенирования одноклеточной РНК лёгкой ткани в модели острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС) у крыс. Эти результаты демонстрируют успешное создание модели ОРДС, индуцированной ЛПС, что подтверждается гистопатологическим исследованием, повышенными показателями повреждений легких и повышенным уровнем воспалительных цитокинов в BALF и сыворотке. Одноклеточный транскриптомический анализ выявил 21 отдельную популяцию кл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы выражают признательность поддержке Горизонтального проекта больницы Дунчжимэнь Пекинского университета китайской медицины (HX-DZM-202114).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,4% раствор Trypan blueGibco, США15250061
4% параформальдегидServicebio, КитайG1101
Бычий сывороточный альбумин (BSA)Sangon Biotech, КитайA600332-0005
Коллагеназа IЙЕСЕН, Китай40507ES60
CurveExpertРазработка Hyamsv1.4
Dispase IIЙЕСЕН, Китай40104ES60
Escherichia coli липополисахарид (LPS) Сигма, СШАL6511
Окрашивание гематоксилином и эозином (HE)Соларбио, КитайG1120
Высокопроизводительный генный секвенсор и bbsp;MGI Tech Co., LtdMGISEQ-2000RS
Ингибитор фосфатазыBeyotime Biotechnology, КитайP1081
Раствор с фосфатным буферомСоларбио, КитайP1020
PMSFСоларбио, КитайR0010
R software Lucent Technologies, СШАv4.2.0
крыса IL-1β Комплект ELISA4abio, КитайCRE0006
набор ELISA для крыс IL-64abio, КитайCRE0005
крыса TNF и альфа; Комплект ELISA4abio, КитайCRE0003
Буфер лизиса эритроцитов (эритроцитов)Соларбио, КитайR1010
Буфер лизиса эритроцитовTiangen Biotech, КитайRT122-1
Вода без РНазыАмбион, СШАAM9937
TE буфер, pH 8.0Амбион, СШАAM9858
Буфер переноса триглицинаServicebio, КитайG2017

Ссылки

  1. Meyer, N. J., Gattinoni, L., Calfee, C. S. Acute respiratory distress syndrome. Lancet. 398 (10300), 622-637 (2021).
  2. Gragossian, A., Siuba, M. T. Acute respiratory distress syndrome. Emerg Med Clin North Am. 40 (3), 459-472 (2022).
  3. Bos, L. D. J., Ware, L. B. Acute respiratory distress syndrome: causes, pathophysiology, and phenotypes. Lancet. 400 (10358), 1145-1156 (2022).
  4. Huang, Q., Le, Y., Li, S., Bian, Y. Signaling pathways and potential therapeutic targets in acute respiratory distress syndrome (ARDS). Respir Res. 25 (1), 30(2024).
  5. Cutolo, M., Campitiello, R., Gotelli, E., Soldano, S. The role of M1/M2 macrophage polarization in rheumatoid arthritis synovitis. Front Immunol. 13, 867260(2022).
  6. Scozzi, D., Liao, F., Krupnick, A. S., Kreisel, D., Gelman, A. E. The role of neutrophil extracellular traps in acute lung injury. Front Immunol. 13, 953195(2022).
  7. Zheng, J., Li, Y., Kong, X., Guo, J. Exploring immune-related pathogenesis in lung injury: providing new insights into ALI/ARDS. Biomed Pharmacother. 175, 116773(2024).
  8. Qiao, Q., Liu, X., Yang, T., Cui, K., Kong, L., Yang, C., Zhang, Z. Nanomedicine for acute respiratory distress syndrome: The latest application, targeting strategy, and rational design. Acta Pharm Sin B. 11 (10), 3060-3091 (2021).
  9. Bonaventura, A., et al. Endothelial dysfunction and immunothrombosis as key pathogenic mechanisms in COVID-19. Nat Rev Immunol. 21 (5), 319-329 (2021).
  10. Yıldırım, F., Karaman, İ, Kaya, A. Current situation in ARDS in the light of recent studies: classification, epidemiology and pharmacotherapeutics. Tuberk Toraks. 69 (4), 535-546 (2021).
  11. Huminiecki, Ł Bulk and single-cell RNA sequencing elucidate the etiology of severe COVID-19. Int J Mol Sci. 25 (6), 3280(2024).
  12. Riemondy, K. A., et al. Single cell RNA sequencing identifies TGF-β as a key regenerative cue following LPS-induced lung injury. JCI Insight. 5 (8), e123637(2019).
  13. Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: a brief overview. Clin Transl Med. 12 (3), e694(2022).
  14. Li, X., Wang, C. Y. From bulk, single-cell to spatial RNA sequencing. Int J Oral Sci. 13 (1), 36(2021).
  15. Cheng, C., Chen, W., Jin, H., Chen, X. A review of single-cell RNA-seq annotation, integration, and cell-cell communication. Cells. 12 (15), 1970(2023).
  16. Zhang, F., Wei, K., Slowikowski, K. Defining inflammatory cell states in rheumatoid arthritis joint synovial tissues by integrating single-cell transcriptomics and mass cytometry. Nat Immunol. 20 (7), 928-942 (2019).
  17. Mulder, K., Patel, A. A., Kong, W. T. Cross-tissue single-cell landscape of human monocytes and macrophages in health and disease. Immunity. 54 (8), 1883-1900.e5 (2021).
  18. Chakarov, S., et al. Two distinct interstitial macrophage populations coexist across tissues in specific subtissular niches. Science. 363 (6432), eaau0964(2019).
  19. Kang, Z. Y., et al. Heterogeneity of immune cells and their communications unveiled by transcriptome profiling in acute inflammatory lung injury. Front Immunol. 15, 1382449(2024).
  20. Wang, H. P., et al. Single-cell transcriptome analysis of the mouse lungs during the injury and recovery periods after lipopolysaccharide administration. Inflamm Res. 73 (12), 2087-2107 (2024).
  21. Yao, C., et al. Cell-type-specific immune dysregulation in severely ill COVID-19 patients. Cell Rep. 34 (1), 108590(2021).
  22. Cheng, C., Chen, W., Jin, H., Chen, X. A review of single-cell RNA-seq annotation, integration, and cell-cell communication. Cells. 12 (15), 1970(2023).
  23. Su, M., et al. Data analysis guidelines for single-cell RNA-seq in biomedical studies and clinical applications. Mil Med Res. 9 (1), 68(2022).
  24. Yang, Q., et al. The interaction of macrophages and CD8 T cells in bronchoalveolar lavage fluid is associated with latent tuberculosis infection. Emerg Microbes Infect. 12 (2), 2239940(2023).
  25. Zheng, L., et al. Single-cell transcriptome sequencing reveals the immune microenvironment in bronchoalveolar lavage fluid of checkpoint inhibitor-related pneumonitis. Cancer Immunol Immunother. 74 (4), 128-145 (2025).
  26. Shi, X. Y. Single-cell transcriptomic analysis of radiation-induced lung injury in rat. Biomol Biomed. 24 (5), 1331-1349 (2024).
  27. Huang, H., et al. Single-cell RNA sequencing uncovered the involvement of an endothelial subset in neutrophil recruitment in chemically induced rat pulmonary inflammation. Int J Med Sci. 19 (4), 669-680 (2022).
  28. Kosaka, J., et al. Effects of biliverdin administration on acute lung injury induced by hemorrhagic shock and resuscitation in rats. PLoS One. 8 (5), e63606(2013).
  29. Hassan, N. H., El-Wafaey, D. I. Histopathological scoring system role in evaluation of electronic cigarette's impact on respiratory pathway in albino rat: Biochemical, histo-morphometric and ultrastructural study. Tissue Cell. 79, 101945(2022).
  30. Wang, P., et al. Single-cell suspension preparation from Nile Tilapia intestine for single-cell sequencing. J Vis Exp. (192), e64321(2023).
  31. Wang, F., et al. Integrating bulk and single-cell sequencing reveals the phenotype-associated cell subpopulations in sepsis-induced acute lung injury. Front Immunol. 13, 981784(2022).
  32. Zi, S. F., et al. Endothelial cell-derived extracellular vesicles promote aberrant neutrophil trafficking and subsequent remote lung injury. Adv Sci Weinh. 11 (38), e2400647(2024).
  33. Zi, S. F., Wu, X. J., Tang, Y., Liang, Y. P. Endothelial cell-derived extracellular vesicles promote aberrant neutrophil trafficking and subsequent remote lung injury. Adv Sci Weinh. 11 (38), e2400647(2024).
  34. Hurskainen, M., et al. Single cell transcriptomic analysis of murine lung development on hyperoxia-induced damage. Nat Commun. 12 (1), 1565(2021).
  35. Zhou, X., Zhang, C., Yang, S. Macrophage-derived MMP12 promotes fibrosis through sustained damage to endothelial cells. J Hazard Mater. 461, 132733(2024).
  36. Zhao, C. Q., et al. Heterogeneity of T cells and macrophages in chlorine-induced acute lung injury in mice using single-cell RNA sequencing. Inhal Toxicol. 34 (13-14), 399-411 (2022).
  37. Liu, D., Zhang, Y., Bai, B., Xiong, X. Integration of single-cell RNA sequencing and network pharmacology to elucidate the effect of Yantiao Formula on alleviating ALI by regulating the polarization of alveolar macrophages. J Ethnopharmacol. 343, 119436(2025).
  38. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology-based strategy to investigate the mechanisms of Cibotium barometz in treating osteoarthritis. Evid Based Complement Alternat Med. 2022, 1826299(2022).
  39. Chen, G. Y., et al. Integrating network pharmacology and experimental validation to explore the key mechanism of Gubitong Recipe in the treatment of osteoarthritis. Comput Math Methods Med. 2022, 7858925(2022).
  40. Dun, Y., et al. PTTG1 promotes CD34+CD45+ cells to repair the pulmonary vascular barrier via activating the VEGF-bFGF/PI3K/AKT/eNOS signaling pathway in rats with phosgene-induced acute lung injury. Biomed Pharmacother. 162, 114654(2023).
  41. Liu, Z., Wei, J., Sun, H., Xu, L. Plumbagin ameliorates LPS-induced acute lung injury by regulating PI3K/AKT/mTOR and Keap1-Nrf2/HO-1 signalling pathways. J Cell Mol Med. 28 (13), e18386(2024).
  42. Guo, Y., Zhang, H., Lv, Z., Du, Y. Up-regulated CD38 by daphnetin alleviates lipopolysaccharide-induced lung injury via inhibiting MAPK/NF-κB/NLRP3 pathway. Cell Commun Signal. 21 (1), 66(2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.