Методическая статья

Оценка 3D-сфероидов для исследований трансдукции AAV

81 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70517

⸱

14 августа 2026 г.

 , 
1Office of Gene Therapy, Office of Therapeutic Products, Center for Biologics Evaluation and Research

В этой статье

Краткое содержание

Системы трехмерного культивирования сфероидов совершенствуют традиционные 2D-модели для разработки генной терапии с использованием AAV. Данная методика обеспечивает чувствительное обнаружение трансдукции AAV при низких дозах, повышенную физиологическую релевантность и надежный долгосрочный мониторинг. Платформа поддерживает оценку биологической активности, высокопроизводительный скрининг и оптимизацию векторов для различных клеточных линий и серотипов AAV.

Аннотация

Аденоассоциированные вирусы (AAV) являются мощными векторами, используемыми для доставки генов в препаратах для генной терапии. Их разработка требует систем in vitro , способных надежно определять различия в дизайне векторов, эффективности серотипов, силе регуляторных элементов и кинетике экспрессии. Эти системы также должны поддерживать такие задачи, как оценка биологической активности и оптимизация векторов. В данной работе мы описываем усовершенствованную платформу для создания трехмерных сфероидов, оптимизированную для оценки активности AAV, кинетики экспрессии трансгена и эффективности трансдукции конкретных серотипов на различных клеточных линиях. Однородные сфероиды формируются с использованием планшетов с ультранизкой адгезией и поддерживаются в условиях, обеспечивающих стабильность архитектуры и возможность длительного имиджинга. После трансдукции AAV флуоресцентные или люминесцентные показатели мониторируются в режиме реального времени с помощью систем имиджинга живых клеток. Это позволяет проводить количественную оценку сигнала репортера, дозозависимого ответа, активности регуляторных элементов и времени начала экспрессии посредством непрерывного кинетического имиджинга. Платформа эффективно дифференцирует сильные и слабые варианты дизайна генома вектора, а также различные серотипы AAV. Данный метод демонстрирует стабильную работу как с медленно, так и с быстро делящимися клеточными линиями. Полученные результаты подтверждают применимость этой системы как масштабируемого и физиологически релевантного метода для доклинической оценки и разработки средств генной терапии.

Введение

Векторы AAV стали одной из предпочтительных систем доставки генов для применения in vivo благодаря их профилю безопасности и способности обеспечивать стабильную экспрессию генов1. Генная терапия на основе AAV демонстрирует успех в лечении множества редких заболеваний, при этом сотни препаратов находятся на стадии разработки2. Кроме того, перспективные области применения включают доставку компонентов редактирования генома, таких как Cas9, in vivo, что обладает огромным потенциалом для лечения трудноизлечимых патологий3. Основные проблемы разработки включают высокую стоимость производства и ограниченную прогностическую способность современных анализов in vitro при определении качества продукта и клинической эффективности4.

Развитие терапии на основе AAV фундаментально ограничено отсутствием прогностических стандартизированных анализов активности, которые могли бы точно предсказывать клиническую эффективность4,5. Такие анализы являются критически важным компонентом процесса разработки, поскольку они используются для множества целей, включая скрининг библиотек модифицированных векторов, оптимизацию модификаций капсида для улучшения таргетинга и оценку тканеспецифичного тропизма. Они также служат для характеристики влияния регуляторных последовательностей на экспрессию трансгена6. Помимо отбора кандидатов, анализы трансдукции AAV обеспечивают критический контроль качества производства посредством тестов на биологическую активность, используемых при выпуске серий, исследованиях сопоставимости серий и оценке стабильности6,7.

Научная проблема заключается в разработке методов анализа, которые отражали бы всю сложность взаимодействий между вектором и хозяином, оставаясь при этом практически применимыми для рутинного использования7,8. Современные подходы включают использование иммортализованных клеточных линий, представляющих целевой орган в традиционных 2D-монослойных культурах. Такие условия культивирования лишены физиологической релевантности и требуют высоких доз препаратов. Это создает значительный разрыв между лабораторными прогнозами и клинической применимостью. Новые инженерные клеточные линии, такие как системы с гиперэкспрессией AAVR или системы, активированные с помощью CRISPR, представляют собой важные достижения, однако они не позволяют воспроизвести трехмерную архитектуру и взаимодействия с внеклеточным матриксом, характерные для нативных тканей9,10,11. Модели следующего поколения, которые лучше имитируют микроокружение in vivo, могли бы преодолеть этот трансляционный разрыв12,13,14.

Недавно нами была разработана система 3D-сфероидов, оптимизированная для трансдукции AAV, с целью повышения трансляционной значимости анализов трансдукции AAV. Эта система значительно увеличивает эффективность трансдукции AAV для множества клеточных линий и серотипов AAV по сравнению с «золотым стандартом» — 2D-анализами. Помимо повышения чувствительности и экономии используемого в анализе продукта, данные модели превосходят 2D-монослои, обеспечивая реалистичные межклеточные взаимодействия, которые варьируются в зависимости от расположения клеток внутри сфероида. Они также позволяют проводить полноценные исследования проникновения препаратов, имитируя условия в реальных органах11,15,16. Кроме того, подход с использованием сфероидов дает практические преимущества перед более сложными системами органоидов или кокультивирования, так как он опирается на стандартное лабораторное оборудование и не требует специализированных сред или каркасов. Такая простота обеспечивает воспроизводимость и масштабируемость, что делает данный метод подходящим для рутинного тестирования препаратов для генной терапии и процессов разработки векторов17.

Данная платформа для создания 3D-сфероидов особенно хорошо подходит для приложений, требующих высокочувствительного детектирования трансдукции AAV при низких дозах, а также для сравнительной оценки вариантов дизайна генома вектора. Она также позволяет оценивать серотип-зависимый тропизм. Система особенно выгодна для клеточных линий с относительно низкой эффективностью трансдукции, которые в традиционных 2D-культурах требуют высоких доз AAV. В таких случаях повышенная чувствительность и улучшенная физиологическая релевантность 3D-платформы имеют решающее значение. Однако эта система может быть менее подходящей для исследований, требующих наличия иммунных компонентов, сосудистой доставки или полной сложности ткани, поскольку сфероиды не полностью воспроизводят условия in vivo .

Таким образом, мы представляем простой протокол создания 3D-сфероидов, оптимизированный для анализов трансдукции AAV, с двумя критически важными и взаимодополняющими показателями: эффективностью трансдукции (определяемой здесь как общий сигнал репортера на один сфероид) и кинетикой трансдукции. Данный метод представляет собой экономически эффективную, физиологически релевантную и информативную платформу для оценки активности AAV, разработки векторов и проведения анализов на нейтрализацию.

Протокол

В данном исследовании использовались общепринятые линии клеток человека (HEK293T, HeLa, Huh7, HEP3B, HEPG2 и A375), полученные из коммерческих источников или из ранее опубликованных материалов. Первичные образцы человека или животных не использовались, в связи с чем этическое одобрение не требовалось.

1. Стерильная установка эксперимента и предварительная подготовка вытяжного шкафа

  1. Активируйте бокс биологической безопасности.
  2. Включите микробиологический бокс безопасности II класса с ламинарным потоком воздуха за 15 мин до начала работы, чтобы обеспечить достаточное время для стабилизации воздушного потока.
  3. Опрыскайте все внутренние поверхности бокса 70% (об/об) этанолом.
  4. Приготовьте в стеклянном стакане объемом 500 mL 5% (об/об) раствор дезинфицирующего отбеливателя для утилизации супернатанта и клеточного дебриса.
  5. Очистите оборудование, тщательно продезинфицировав все микропипетки и накопители для наконечников 70% (об/об) этанолом.

2. Приготовление сред для культивирования клеток

  1. Приготовьте 500 mL базовой среды DMEM (модифицированная среда Игла в модификации Dulbecco) с высоким содержанием глюкозы.
  2. Добавьте в базовую среду 10 mL термоинактивированной фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1 mL раствора пенициллина/стрептомицина (100 units/mL пенициллина и 100 µg/mL стрептомицина) и 5 mL 2 mM L-глутамина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении всех процедур необходимо соблюдать правила асептики. Для каждого эксперимента требуется приготовление свежей среды. Спецификации оборудования приведены в Таблице материалов.

3. Подготовка сфероидов

  1. Приготовьте полную среду DMEM, как описано выше.
  2. Подогрейте культуральную среду на водяной бане при 37 °C в течение 10–15 мин.
  3. Извлеките интересующие клеточные линии из контейнера с жидким азотом.
  4. Быстро разморозьте криоконсервированные клетки HEK293T, Huh7, HEP3B, HEPG2, A375 и HeLa, поместив их в водяную баню при 37 °C.
  5. Немедленно извлеките из водяной бани, как только растает последний кристалл льда.
  6. Разведите 1 mL размороженных клеток в 9 mL полной среды DMEM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все клеточные линии, используемые в данном протоколе, поддерживаются в одной и той же среде DMEM и в одинаковых условиях культивирования.
  7. Центрифугируйте клетки при 350 × g в течение 5 мин при комнатной температуре.
  8. Удалите супернатант.
  9. Ресуспендируйте осадок в 5 mL полной среды DMEM.
  10. Посейте клетки в флакон для культивирования T75.
  11. Поместите посеянные флаконы в инкубатор для культур клеток при 37 °C, 5% CO2 и влажности 95%.

4. Мониторинг роста клеток

  1. Добавляйте 15 mL питательной среды каждые 3 дня.
  2. Пересевайте клетки HEK293T, Huh7, HEP3B, HEPG2, A375 и HeLa при достижении 70% конфлюэнтности, аспирируя полную среду DMEM из флаконов T75. 
  3. Промойте клетки, добавив 5 mL PBS во флаконы T75 с клетками. 
  4. Аспирируйте 5 mL PBS через 30 s после добавления во флаконы T75. 
  5. Повторите этот этап промывки еще один раз.  
  6. Проведите трипсинизацию клеток, используя 5 mL 0.05% раствора трипсина-EDTA в течение 5 min. 
  7. Инкубируйте флаконы в инкубаторе при 37 °C в течение 5 min для полного открепления клеток. 
  8. Добавьте 5 mL полной среды DMEM для нейтрализации трипсина. 
  9. Центрифугируйте клетки при 350 × g. в течение 5 min для удаления трипсина. 
  10. Ресуспендируйте клеточный осадок в 5 mL DMEM. 
  11. Рассейте клетки в разведении 1:10 для рутинного пересева. 
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется пересевать клетки 2 раза перед проведением экспериментов, чтобы клетки достигли логарифмической фазы роста и стали метаболически активными. 
  12. Продолжайте инкубацию в этих контролируемых условиях до достижения клетками 70% конфлюэнтности, после чего приступайте к последующим экспериментальным процедурам.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо регулярно контролировать морфологию и характер роста клеток. Обеспечьте правильное положение флаконов для оптимального газообмена. На протяжении всего периода инкубации крайне важно соблюдать стерильность.

5. Сбор клеток и их первичная подготовка

  1. Удалите культуральную среду, аспирировав имеющуюся среду из флаконов T75.
  2. Промойте клетки HEK293T, Huh7, HEP3B, A375,  HEPG2 и HeLa 3 раза с помощью PBS для удаления остатков среды и клеточного дебриса.
  3. Добавьте к клеткам 5 mL предварительно нагретого 1× раствора трипсина, чтобы открепить адгезивные клетки от поверхности флакона.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что трипсин предварительно нагрет для поддержания оптимальной ферментативной активности. Поместите флаконы в инкубатор при 37 °C на 5 min для полного открепления клеток. Тщательно контролируйте время трипсинизации, чтобы предотвратить чрезмерный протеолиз.
  4. Добавьте 5 mL полной культуральной среды для инактивации фермента трипсина.
  5. Перемешайте смесь, несколько раз пропустив ее через дозатор, для гомогенизации раствора.
  6. Соберите каждую клеточную суспензию, перенеся ее в индивидуально промаркированные центрифужные пробирки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При ресуспендировании с клетками следует обращаться осторожно для сохранения их жизнеспособности.
  7. Центрифугируйте клетки при 350 × g в течение 5 min при комнатной температуре для получения клеточного осадка.
  8. Удалите супернатант и осторожно ресуспендируйте клеточный осадок в 5 mL свежей культуральной среды.

6. Подсчет клеток и оценка их жизнеспособности с помощью автоматического счетчика клеток

  1. Гомогенизируйте суспензию, осторожно перенося её пипеткой вверх и вниз, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток по всей центрифужной пробирке.
  2. Подготовьте пробирки для подсчета клеток HEK293T, Huh7, HEP3B, HEPG2, A375 и HeLa.
  3. Приготовьте разведение образца 1:10 в полной культуральной среде DMEM. Например, добавьте 40 µL суспензии клеток в 360 µL полной среды DMEM.
  4. Осторожно перемешайте смесь пипетированием вверх и вниз четыре раза для обеспечения однородности разведения.
  5. Зарегистрируйте образец в журнале, указав используемый тип клеток, разведение и название образца.
  6. Поместите образец в автоматический счетчик клеток, установив пробирку с разведенной суспензией клеток в соответствующий номер слота.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Автоматический счетчик клеток самостоятельно аспирирует образцы клеток и смешивает их с трипановым синим, что снижает вариабельность результатов между разными операторами.
  7. Дайте суспензии клеток отстояться в течение 1 min перед началом подсчета образца.
  8. Перед подсчетом равномерно ресуспендируйте клетки для получения точных результатов.
  9. Рассчитайте общее количество клеток.
  10. Используйте общую концентрацию жизнеспособных клеток для определения плотности посева клеток в экспериментах.
  11. Используйте жизнеспособные клетки с жизнеспособностью > 90%.
  12. Отличайте жизнеспособные (неокрашенные) клетки от нежизнеспособных (окрашенных в синий цвет).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во всех образцах должны соблюдаться единообразные критерии подсчета.

7. Посев сфероидов и оптимизация их размера

  1. Перемешайте клеточную суспензию путем многократного всасывания и выпуска жидкости из пипетки для гомогенизации раствора.
  2. Высейте клетки HEK293T, Huh7, HEP3B, HEPG2 или HeLa с различной плотностью.
  3. Для начала высейте 1 x 104 клеток в 200 µL в 96-луночный планшет с круглым дном и ультранизкой адгезией (ULA).
  4. Выполните серийное двухкратное разведение клеток из лунки с концентрацией 1 x 104 клеток/лунка до достижения плотности клеток, необходимой для экспериментов.
  5. Добавьте 1 объем полной среды во все ряды (1B-1H), кроме верхнего ряда.
  6. Добавьте 2 объема суспензии с концентрацией 1 x 104 клеток/лунка в ряд 1A (верхний ряд).
  7. Выполните серийное разведение ряда 1A, перенося 1 объем из лунки 1A в лунку 1B и так далее. Пример схемы расположения эксперимента приведен ниже на Дополнительном рисунке 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения равномерного ресуспендирования осторожно постучите по стенкам планшета.
  8. Центрифугируйте ULA-планшет при 350 × g в течение 5 мин, чтобы сместить клетки к центру и способствовать межклеточному контакту.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании клеточных линий, отличных от описанных здесь, может потребоваться оптимизация параметров, так как разные клеточные линии характеризуются различной скоростью роста и формирования сфероидов.
  9. Не беспокойте планшеты в течение первых 24–48 ч для обеспечения начального формирования сфероидов. Позвольте сфероидам созревать в течение 3 дней до достижения диаметра ~400 µm.
  10. Проверьте однородность размера сфероидов. Убедитесь, что клетки ресуспендированы равномерно и планшеты не деформированы.
    Примечание: Не используйте планшеты со сфероидами разных размеров. Убедитесь, что сфероиды в каждой лунке имеют относительно одинаковый диаметр.
  11. Следите за морфологией сфероидов.
    Примечание: Правильно сформированные сфероиды имеют округлую форму с четкими краями.
  12. Получайте зрелые сфероиды с плотной межклеточной адгезией, а не рыхлые клеточные агрегаты.
  13. Увеличьте плотность высева или продлите время формирования. Если сфероиды недостаточно компактны, увеличьте плотность высева или продлите время формирования.
  14. Минимизируйте появление множества мелких агрегатов, снизив плотность высева или увеличив время центрифугирования.

8. Мониторинг сфероидов в режиме реального времени на живых клетках

  1. После центрифугирования клеточных суспензий перенесите планшет в инкубатор при 37 °C (5% CO2, влажность 95%), в котором размещен прибор для визуализации живых клеток для автоматического получения изображений.
  2. Установите параметры визуализации живых сфероидов в соответствии с требованиями эксперимента:
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для всех протестированных клеточных линий использовались следующие параметры.
  3. Войдите в программное обеспечение для сбора данных.
  4. Выберите следующие команды: |Schedule To Acquire | Launch Add Vessel | Scan On Schedule | Create Vessel: New.
  5. |Select Scan Type|: Spheroid. |Select the channels of interest|: Phase + Brightfield (для мониторинга роста сфероидов), Green/Red (для мониторинга трансдукции AAV, время экспозиции 300 ms или 400 ms соответственно).
  6. Выберите необходимое увеличение: 10x.
  7. Выберите модель планшета и его положение в лотке.
  8. Выберите положение лунок для визуализации и количество требуемых изображений на одну лунку.
  9. Введите описание эксперимента: название, тип клеток, количество клеток.
  10. В настройках анализа выберите Defer Analysis Until Later.
  11. Щелкните правой кнопкой мыши по временной шкале и выберите опцию Set Selected Scan Group Interval.
  12. Установите добавление сканирований каждые 6 h и бессрочное сканирование. Установите желаемое время начала (минимум через 1 h после инкубации в автоматическом приборе для визуализации).
  13. Ежедневно проверяйте рост сфероидов, входя в программное обеспечение для визуализации.
  14. Выберите опцию View Recent Scans и дважды щелкните по нужному эксперименту. |Выберите Brightfield на панели каналов изображения| и затем используйте инструмент |Measure image| функций для измерения диаметра сфероидов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения компактных сфероидов из соответствующих клеток может потребоваться оптимизация времени созревания.
  15. Извлеките планшет в день оптимального формирования сфероидов и используйте его для трансдукции AAV.

9. Трансдукция AAV

  1. Приобретите или синтезируйте серотипы AAV3 и интересующие трансгены.
  2. Приготовьте среду DMEM с добавлением 2% FBS для трансдукции AAV, добавив 10 mL FBS к 490 mL среды DMEM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для скрининга капсидов или геномных регуляторных элементов высокоэффективным является трансген GFP, как показано в разделе с репрезентативными результатами. Разведите интересующий AAV в среде DMEM с 2% FBS без антибиотиков.
  3. Произведите разведение в соответствующем 96-луночном круглом планшете для серийных разведений.
  4. Выполните разведения 1:10, начиная с исходного MOI, для титрования AAV1, AAV2, AAV5, AAV8 и AAV9.
  5. См. пример схемы эксперимента ниже на Дополнительном рисунке 2. Рассчитайте MOI, необходимый для трансдукции AAV, как показано в разделе «Обсуждение».
  6. Добавьте 33 µL стока AAV к 297 µL среды, чтобы получить в общей сложности 330 µL раствора с MOI 1 × 106.
  7. Выполните 10-кратные серийные разведения, начиная с MOI 1 × 106, добавляя 33 µL в 297 µL среды DMEM с 2% FBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется избегать высоких значений MOI во избежание снижения жизнеспособности клеток. Для каждого типа клеток и серотипа AAV может потребоваться оптимизация условий эксперимента, так как они могут существенно влиять на оптимальный MOI. Не все вирусные геномы являются инфекционными; функциональные титры могут отличаться от значения vg/mL.

10. Дозирование AAV

  1. С помощью многоканального дозатора удалите всю среду из заранее подготовленного планшета со сфероидами.
  2. Перенесите 100 µL раствора с требуемой MOI из планшета для разведений в планшет для обработки, используя многоканальный дозатор.
  3. Поместите планшеты обратно в прибор для визуализации и начните мониторинг трансдукции, отслеживая интенсивность зеленой флуоресценции в течение 72 h.
  4. Если мониторинг длится более 3 дней, каждые 3 дня добавляйте в каждую лунку по 100 µL полной среды DMEM для восполнения питательных веществ.

11. Визуализация живых клеток, мониторинг трансдукции и анализ данных

  1. Поместите планшет обратно в прибор после добавления необходимого AAV и MOI в группу обработки.
  2. Начните регистрацию эффективности трансдукции каждые 6 h.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения оптимальной экспрессии GFP обычно требуется от 3 до 5 дней. Это зависит от используемого промотора и конфигурации генома.
  3. Проанализируйте данные, создав определение анализа, специфичное для интересующих клеток и репортерных генов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, поместите планшет в стандартный инкубатор при 37 °C и оцените эффективность трансдукции с помощью qPCR, вестерн-блоттинга или ELISA.
  4. Определите параметры анализа, выполнив анализ в светлом поле для первичного обнаружения сфероидов.
  5. Оптимизируйте параметры сегментации следующим образом:
    1. Тип анализа: "Spheroid Brightfield."
    2. Метод сегментации: "Adaptive Threshold."
    3. Диапазон порога: 0,3–0,8 (изначально рекомендуется автоподстройка)
    4. Top-hat фильтр: 200–500 µm (удаляет неравномерность освещения)
  6. Оптимизируйте параметры светлого поля следующим образом:
    1. Загрузите репрезентативные изображения для разных временных точек.
    2. Протестируйте диапазон порога (0,2–0,9) для нахождения оптимального обнаружения.
    3. Настройте фильтры размера исходя из ожидаемого диапазона размеров сфероидов.
    4. Проверьте сегментацию путем визуального осмотра наложенных масок.
  7. Оптимизируйте зеленый канал для оценки трансдукции AAV следующим образом:
    1. Определите уровень фона в необработанных лунках (MOI=0).
    2. Установите порог на уровне 2–3× выше фонового шума.
    3. Протестируйте на образце, обработанном с максимальным MOI.
  8. Оптимизируйте время экспозиции , чтобы избежать насыщения при сохранении сигнала.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для трансдукций AAV в качестве показателя эффективности трансдукции указывайте общий сигнал флуоресценции на один сфероид.

12. Анализ данных

  1. Выберите подходящие параметры, настроив фильтры и маски таким образом, чтобы выделялись клетки на изображении, а не фоновый шум.
  2. Выберите репрезентативное изображение для обучения программного обеспечения.
  3. Примените оптимизированные параметры ко всем изображениям в исследовании.
  4. Извлеките данные в виде отдельных значений или сгруппированно, после чего перенесите их в систему статистического анализа для дальнейшего представления результатов.

13. Расчет времени начала действия

  1. Рассчитайте время обнаружения первого сигнала GFP для каждой MOI.
  2. Выполните интерполяцию по значению: средний показатель для необработанных лунок (MOI = 0) + 3 стандартных отклонения (SD).
  3. Скопируйте значения интенсивности зеленой флуоресценции каждого сфероида для каждой временной точки из программного обеспечения для визуализации живых клеток в статистическое программное обеспечение.
  4. Вычислите среднее значение для повторностей.
  5. Рассчитайте средний сигнал и SD для всех лунок с необработанными сфероидами (MOI = 0).
  6. Используйте асимметричную сигмоидальную кривую (5PL-аппроксимация) для интерполяции времени начала сигнала для каждой MOI.
  7. Например, в Таблице 1 использовались следующие значения интерполяции:
    1. Для scGFP: 254,955 (среднее) + 3 × 288,055 (SD) = 1,412,120 (интерполяционный сигнал)
    2. Для ssGFP: 2,417,941 (среднее) + 3 × 26,093  (SD) =  3,200,746 (интерполяционный сигнал)

14. Измерьте флуоресценцию с помощью планшетного ридера с функцией измерения флуоресценции.

  1. Запустите программное обеспечение флуоресцентного планшетного ридера на компьютере, подключенном к прибору.
  2. Навигация в/к Файл > Открыть Протокол: выберите тип планшета (например, на 96 или 384 лунки) и убедитесь, что выбрана правильная схема расположения лунок. 
  3. Установите время интегрирования для флуоресцентного детектирования; этот параметр определяет длительность сбора сигнала флуоресценции прибором из каждой лунки.
  4. Отрегулировать Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода. усиление или чувствительность настройки
    если the анализ требуется более высокий или нижний сигнал обнаружение
  5. Установите следующие параметры флуоресценции для GFP: возбуждение — 485 нм, эмиссия — 528 нм.
  6. Нажмите «Run» в программном обеспечении, чтобы начать измерение.
  7. Измерить флуоресценция из каждый лунка
    ПРИМЕЧАНИЕ: По завершении анализа программное обеспечение отображает необработанные значения флуоресценции, которые можно использовать для построения графиков путем расчета средних значений и вычитания фонового сигнала.
  8. Экспорт Результаты в the предпочтительный формат для далее анализ или отчетность.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если протокол образца был изменен, используйте Файл > Используйте функцию «Сохранить как» для создания отдельной версии, сохранив оригинал для дальнейшего использования.

15. Трансдукция люминесцентного трансгена

  1. Следуйте тому же протоколу посева и дозирования AAV, который был подробно описан выше.
  2. Добавьте по 100µL AAV1, AAV2, AAV5, AAV8 и AAV9, несущих трансген нано-люциферазы, с различными MOI в диапазоне от 0–106, к 100 µL сфероидов HeLa, уже выращенных в ULA-планшетах.
  3. Инкубируйте планшеты в обычном инкубаторе при 37 °C и оцените эффективность трансдукции через 3 дня после проведения процедуры.

16. Приготовление ингибитора внеклеточной люминесценции и субстрата люминесценции для анализа живых клеток

  1. Извлеките планшеты для анализа из инкубатора на 3-й день (конечная точка).
  2. Добавьте ингибитор внеклеточной люминесценции и субстрат непосредственно к клеткам.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление среды не требуется.
  3. Извлеките внеклеточный ингибитор из хранилища при −20 °C и дайте ему разморозиться при комнатной температуре.
  4. Кратковременно центрифугируйте пробирку, чтобы собрать жидкость с крышки и стенок.
  5. Приготовьте необходимый объем реконструированного 15X внеклеточного ингибитора люминесценции, смешав 1 объем внеклеточного ингибитора с 14 объемами полной среды DMEM.
    1. Например, если для эксперимента требуется 1,0 mL реагента, добавьте 67 µL ингибитора к 933 µL DMEM. Для 1 планшета приготовьте 1 mL DMEM и добавьте 67 µL ингибитора.
  6. Перенесите приготовленный ингибитор из шага 16.5 в стерильный резервуар для реагентов.
  7. С помощью многоканального дозатора внесите по 10 µL ингибитора в лунки, трансдуцированные AAV.
  8. Извлеките субстрат для живых клеток (Live Cell Substrate) из хранилища при −20°C и перемешайте.
  9. Кратковременно центрифугируйте пробирку, чтобы собрать жидкость с крышки и стенок.
  10. Приготовьте необходимый объем реконструированного 3,6X реагента для живых клеток.
  11. Для 1 планшета приготовьте 4 mL DMEM и добавьте 144 µL субстрата.
  12. Перенесите приготовленный субстрат из шага 16.11 в стерильный резервуар для реагентов.
  13. С помощью многоканального дозатора внесите по 50 µL субстрата в те же лунки, которые были трансдуцированы AAV.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если одновременно используется несколько планшетов для анализа, может потребоваться корректировка объема реагентов.
  14. Встряхивайте планшет на шейкере при 300 rpm в течение 5 min при комнатной температуре.
  15. Считайте показатели планшета с помощью системы визуализации in vivo в течение 2 ч после добавления реагентов для детекции люминесценции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Интенсивность люминесценции будет постепенно снижаться в течение 2 ч.

17. Биолюминесцентная визуализация

  1. Включите систему биолюминесцентной визуализации как минимум за 30 мин до начала съемки, чтобы ПЗС-камера успела охладиться (−90 °C).
  2. Убедитесь, что планшеты готовы к визуализации (например, добавлен субстрат для визуализации живых клеток для считывания биолюминесценции).
  3. Снимите крышку планшета, чтобы избежать отражения и рассеивания света.
  4. При съемке снизу очистите дно планшета.
  5. Поместите планшет в камеру визуализации на предметный столик.
  6. Разместите планшет по центру под камерой.
  7. Установите параметры визуализации для люминесценции: автоэкспозиция или установленное время экспозиции (обычно 1–60 s), биннинг (рекомендуется средний), значение диафрагмы f/stop (1 для максимальной чувствительности).
  8. Сделайте снимок для анатомического ориентирования.
  9. Зафиксируйте люминесцентное изображение.

18. Анализ данных биолюминесцентной визуализации

  1. Используйте инструменты ROI для выделения лунок или областей интереса.
  2. Для корректного сравнения обеспечьте одинаковый размер ROI для всех образцов.
  3. Измерьте общий поток (фотон/с) для биолюминесценции.
  4. Измерьте эффективность излучения.
  5. Экспортируйте данные в электронную таблицу для статистического анализа.
  6. Сохраните файлы изображений и результаты анализа.
  7. Экспортируйте изображения в формате TIFF или JPEG для презентаций.

Результаты

Здесь мы демонстрируем, что 3D-сфероиды могут быть использованы в качестве инструмента для оценки трансдукции AAV, различения конструкций генома вектора, таких как самокомплементарные (sc) и одноцепочечные (ss), а также для оценки кинетики трансдукции. Обзор процесса представлен на Рисунке 1. Вкратце, сначала клетки экспансируют в 2D-культурах и высевают в планшеты с ультранизкой адгезией (ULA) для формирования компактных сфероидов (Рисунок 1A). Затем планшеты центрифугируют для стимуляции агрегации (Рисунок 1B) и переносят в систему визуализации живых клеток для мониторинга формирования сфероидов в режиме реального времени (Рисунок 1C). На 3-й день сфероиды трансдуцируют AAV с использованием различных MOI (Рисунок 1D). Кинетика трансдукции отслеживается в динамике с помощью визуализации живых клеток (Рисунок 1E), а конечный анализ проводится с использованием планшетного считывания флуоресценции или люминесценции (Рисунок 1F).

Рисунок 2 демонстрирует морфологию сфероидов из 6 различных клеточных линий, показывая разную плотность, степень округлости и форму. Все клеточные линии выращивали в полной среде DMEM в течение нескольких пассажей перед использованием в экспериментах. После того как клетки достигли логарифмической фазы, клетки HEP3B, HEK293T, A375, HeLa, HEPG2 и Huh7 собирали и подвергали серийному разведению в планшетах с ULA и круглым дном, начиная с плотности 10 000 клеток на лунку с последующим двухкратным серийным разведением (схема планшета приведена на Дополнительном Рисунке 1, репрезентативные результаты показаны на Дополнительном рисунке 2). Размер сфероидов может составлять всего 50 µm при сохранении структуры сфероида и отличной восприимчивости к трансдукции. После посева клеток планшет с ULA и круглым дном центрифугировали при 350 × g в течение 5 min, что позволило клеткам собраться в центре лунки и самоорганизоваться в сфероиды. Этот этап особенно полезен для клеток, которые не агрегируют естественным образом. Время центрифугирования можно увеличить с 5 до 15 min для высокорезистентных клеток, таких как лимфоциты. Хорошо сформированные сфероиды характеризуются округлым и компактным фенотипом, как это наблюдалось для клеток HEK293T и Huh7, в то время как плохо сформированные сфероиды агрегированы рыхло и склонны к распаду при замене среды.

Затем планшет переносят в инкубатор при 37 °C, оснащенный прибором для мониторинга живых клеток. Контроль планшетов осуществляется ежедневно с интервалом в 6 h для оценки формирования сфероидов каждой из описанных здесь клеточных линий. Большинству клеточных линий требуется 3 дня для самосборки в сфероид. Как показано на Рисунке 2, каждая клеточная линия проявляла отчетливые морфологические особенности и различную степень уплотнения через 3 дня после посева. Линии гепатоцитов (Huh7, HEPG2 и HEP3B) образовали более компактные и плотные сфероиды по сравнению с другими клеточными линиями. HEK293T имела выраженную округлую сферическую форму с отчетливым некротическим ядром, в то время как A375 образовала клеточный агрегат неправильной формы (ранее описанный как деформированный сфероид)18,19. Считается, что эти различия в морфологии являются индикаторами патофизиологических состояний заболевания, что дополнительно подтверждает преимущество использования 3D-моделей по сравнению с системами 2D-культивирования18,19. Протокол сборки сфероидов обладает высокой воспроизводимостью для всех шести протестированных клеточных линий и применялся для всех представленных здесь трансдукций.

После оптимизации концентрации клеток, времени формирования сфероидов и состояния зеленой/красной автофлуоресценции (показано в Дополнительный рисунок 3), мы приступили к тестированию трансдукции AAV в сфероидах с использованием системы визуализации живых клеток и планшетного ридера (пример схемы расположения лунок для титрования AAV показан на Дополнительный рисунок 4). Рисунок 3 представлен оптимизированный протокол получения сфероидов, примененный к четырем различным клеточным линиям (HEK293T, Huh7, HEP3B и HEPG2). На 3-й день формирования сфероидов в них трансдуцировали два вектора AAV2 с различными конструкциями векторного генома, мечеными GFP, при различных множественностях заражения (MOI). Эти две конструкции трансгенов AAV представляют собой высокоэффективный (scGFP) и низкоэффективный (ssGFP) варианты GFP. После трансдукции клеток планшеты помещали в систему визуализации живых клеток для мониторинга трансдукции AAV в режиме реального времени. Через 72 часа интенсивность зеленой флуоресценции регистрировали с помощью программного обеспечения для визуализации живых клеток. В Рисунок 3, синие линии соответствуют геномам sc-GFP, тогда как красные линии соответствуют геномам ss-GFP. Сфероиды оказались высокочувствительными к трансдукции AAV; сильная трансдукция sc-GFP наблюдалась при очень низких титрах AAV и в различных клеточных линиях. В представлены репрезентативные видеозаписи трансдукции AAV в различных клеточных линиях и при разной множественности заражения (MOI), полученные в режиме реального времени. Дополнительный видеоматериал 1, Дополнительный видеоматериал 2, Дополнительный видеоматериал 3, Дополнительный видеоматериал 4, Дополнительный видеоматериал 5, и Дополнительный ролик 6С другой стороны, трансдукция сфероидов AAV-ssGFP наблюдалась на более низком уровне, что соответствует ожидаемому более слабому или медленному действию данного типа регуляторного элемента.20,21Это демонстрирует полезность 3D-сфероидов как для сильной, так и для слабой трансдукции AAV, а также для различения сильно трансдуцирующих генов, таких как sc-GFP, и менее эффективных генов, таких как ss-GFP. Мы наблюдали 100-кратную разницу в относительной флуоресценции между sc- и ss-трансгенами при MOI, равном 10.6 в клетках HEK293T, и трехкратную разницу в клеточных линиях, которые труднее трансдуцировать, таких как HEP3B.

Далее мы приступили к тестированию трансдукции различными серотипами AAV в зависимости от дозы как в сфероидах HEK293T, так и в сфероидах Huh7. Как показано на рисунке 4, 3D-сфероиды были восприимчивы к трансдукции AAV-scGFP четырех различных серотипов. Через 72 ч после трансдукции уровень scGFP измеряли с помощью флуоресцентного планшетного ридера (рисунок 4A,B) и программного обеспечения для визуализации живых клеток (рисунок 4C,D)). Все 4 серотипа были успешно обнаружены с помощью этих двух приборов. Система визуализации живых клеток показала более широкий диапазон соотношения сигнал/шум, чем флуоресцентный планшетный ридер, хотя нормализованный сигнал не выявил значимых различий. Мы обнаружили, что AAV2 обладал наибольшей эффективностью трансдукции в обеих клеточных линиях, за ним следовал AAV1, в то время как AAV5 и AAV9 показали значительно более низкую трансдукцию.

Далее мы оценили эффективность трансдукции люминесценции с использованием протокола для сфероидов. Для этого клетки HeLa выращивали в виде 3D-сфероидов согласно оптимизированному протоколу, описанному здесь. На 3-й день сфероиды HeLa трансдуцировали пятью различными серотипами AAV, кодирующими репортерный ген нано-люциферазы. Через 72 ч после трансдукции AAV клетки обрабатывали субстратом Live Cell и инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем измеряли люминесценцию и получали изображения с помощью системы биолюминесцентной визуализации (Рисунок 5A). При использовании данной системы наблюдалась эффективная трансдукция для всех серотипов AAV. Была отмечена высокая чувствительность при различении эффективности трансдукции разных серотипов AAV, что указывает на то, что данный протокол не ограничивается только флуоресцентным анализом. В соответствии с тенденциями, наблюдаемыми на Рисунке 5, трансдукция AAV-нано-люциферазы в клетках HeLa показала, что AAV2 является наиболее эффективным серотипом, как и в случае с векторами AAV-GFP. Аналогично, самая низкая эффективность трансдукции наблюдалась для серотипа AAV9, что подтвердили как флуоресцентные, так и люминесцентные векторы (Рисунок 4 и 5). Репрезентативное изображение трансдукции AAV-нано-люциферазы представлено на Рисунке 5B.

Помимо интенсивности трансдукции, протоколы с использованием 3D-сфероидов позволяют проводить кинетический мониторинг трансдукции. На рисунке 6 представлены репрезентативные результаты кинетики трансдукции 3D-сфероидов HEK293T векторами AAV2-scGFP и AAV2-ssGFP при различных MOI (0-106) (рисунок 6A-G). С помощью системы визуализации живых клеток было установлено, что трансдукция AAV2-scGFP обнаруживается при MOI всего 101, при этом увеличение сигнала GFP по сравнению с необработанными клетками становится заметным примерно через 34 ч. Сигнал AAV2-ssGFP значительно слабее и нарастает медленнее, чем сигнал AAV2-scGFP. Для дальнейшего сравнения скорости трансдукции мы рассчитали время начала, когда сигнал GFP становится обнаруживаемым. Было отмечено, что scGFP трансдуцирует клетки в среднем в 4 раза быстрее, чем ssGFP. Индивидуальные значения времени начала приведены в таблице 1. Эти кинетические измерения раскрывают дополнительный аспект эффективности трансдукции, полезный для оптимизации анализа.

Схема процесса культивирования клеток; формирование сфероидов, трансдукция и анализ с использованием системы IncuCyte.
Рисунок 1: Обзор трансдукции AAV с использованием 3D-культур. (A) Клетки экспансируют в 2D-культуре и высевают в планшеты с ультранизкой адгезией (ULA) для формирования сфероидов. (B) Планшеты центрифугируют для стимуляции агрегации и переносят в (C) систему IncuCyte S3 для мониторинга формирования сфероидов в режиме реального времени. (D) На 3-й день сфероиды трансдуцируют AAV с различными MOI. (E) Кинетика трансдукции отслеживается продольно с помощью имиджинга живых клеток, и (F) конечный анализ может быть выполнен с использованием флуоресцентного или люминесцентного считывания в планшетах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Сравнение сфероидов клеточных культур; микроскопическое изображение шести различных клеточных линий в экспериментальной установке.
Рисунок 2: Морфологическая характеристика сфероидов различных клеточных линий. Репрезентативные изображения сфероидов, полученных из клеток HEP3B, HEK293T, A375, HeLa, HEPG2 и Huh7, демонстрируют вариабельность размеров, морфологии и компактности при высокой воспроизводимости между повторностями (масштабная линейка, 50 µm). Все клеточные линии высевали в концентрации 1 x 104 клеток/лунку на 3 дня. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Анализ экспрессии генов в клетках, меченных GFP; MOI в зависимости от флуоресценции, несколько клеточных линий, график, изображения.
Рисунок 3: Сравнение эффективности трансдукции AAV самокомплементарными (scGFP) и одноцепочечными (ssGFP) векторами в различных клеточных линиях. 3D-сфероиды (A) HEK293T, (B) Huh7, (C) HEP3B и (D) HEPG2 были самоорганизованы и трансдуцированы различными MOI AAV2-scGFP (синий) и AAV2-ssGFP (красный). Общая интенсивность зеленой флуоресценции была количественно определена через 72 h после трансдукции. Репрезентативные изображения сфероидов, обработанных при максимальном MOI для каждого AAV, полученные через 72 h с помощью системы визуализации живых клеток. Масштабные отрезки соответствуют 200 µm. Планки погрешностей соответствуют SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. 

Графики интенсивности флуоресценции для серотипов AAV в клетках HEK293T, Huh7; MOI, переменная времени.
Рисунок 4: Трансдукция AAV в 3D-сфероидах позволяет дифференцировать активность различных серотипов AAV. 3D-сфероиды из клеток (A,C>) HEK293T и (B,D>) Huh7 были трансдуцированы AAV1, AAV2, AAV5 и AAV9 с трансгеном scGFP при различных значениях MOI. Единицы интенсивности флуоресценции измеряли через 72 h с помощью флуоресцентного планшетного ридера (A,B>) и системы визуализации живых клеток (C,D>). Планки погрешностей обозначают SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

График и тепловая карта эффективности трансдукции AAV; MOI в зависимости от общего потока; анализ вирусных векторов.
Рисунок 5: Трансдукция AAV в 3D-сфероидах с люминесцентными репортерами. Сфероиды HeLa были трансдуцированы AAV1, AAV2, AAV5, AAV8 и AAV9, кодирующими репортерный трансген нанолюциферазы, при возрастающих MOI. Люминесценция была визуализирована и измерена с помощью конечного считывания (Endpoint readout) с использованием системы имиджинга люминесценции через 72 ч после трансдукции. (A) Значения общего потока (Total Flux). (B) Репрезентативное конечное считывание с изображениями люминесценции планшетов со сфероидами, демонстрирующее распределение сигнала в зависимости от MOI и серотипов. Каждый вектор AAV был протестирован в двух горизонтальных повторностях. Планки погрешностей соответствуют SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Анализ экспрессии генов; графики зависимости MOI от времени; интенсивность флуоресценции sgGFP; результаты экспериментов.
Рисунок 6: Оценка кинетики трансдукции в 3D-сфероидах. Сфероиды HEK293T были трансдуцированы AAV2-scGFP (синий) и AAV2-ssGFP (красный) при 7 различных значениях MOI (A–G). Суммарная интенсивность зеленого свечения измерялась в течение 72 h с интервалом в 6 h с помощью системы Monitor spheroid formation/growth. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

множественность зараженияscGFP (ч)ssGFP (ч)
1>72 ч>72
1034.2>72
10016.554.2
10005.623.1
100003.313
1000001.98

Таблица 1: Время начала детекции GFP.

Дополнительный рисунок 1: Схема расположения лунок для титрования сфероидов. (A) Репрезентативная схема расположения лунок, демонстрирующая схему разведения для сфероидов HEK293T, Huh7, HEP3B и HEPG2, созданных из начальных плотностей посева от 10,000 до 78 клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Формирование сфероидов при различных плотностях посева. Репрезентативные микрофотографии сфероидов HEK293T и Huh7, полученных из начальных плотностей посева от 10 000 до 78 клеток на 3-й день. Масштабная линейка соответствует 50 µm.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 3: Информация о клеточных линиях для формирования 3D-сфероидов.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 4: Схема расположения лунок для серийных разведений AAV. (A) Репрезентативная схема расположения лунок, демонстрирующая схему серийного разведения AAV, использованную для AAV1, AAV2, AAV5 и AAV9, начиная с MOI 106. Отрицательный контроль показан в ряду H и представляет собой необработанные сфероиды.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный ролик 1: Визуализация в реальном времени трансдукции AAV2-scGFP в сфероидах HEK293T при MOI 106.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный видеоролик 2: Визуализация живых клеток в режиме реального времени при трансдукции сфероидов Huh7 вектором AAV2-scGFP при MOI 106.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный видеоролик 3: Визуализация живых клеток в режиме реального времени при трансдукции сфероидов HEP3B вектором AAV2-scGFP при MOI 106.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительное видео 4: Визуализация в реальном времени трансдукции AAV2-scGFP в сфероидах HEK293T при MOI 106 в рамках исследования дозозависимости.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный фильм 5: Визуализация живых клеток в реальном времени при трансдукции сфероидов HEK293T вирусом AAV2-scGFP с MOI 104.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный ролик 6: Визуализация трансдукции AAV2-scGFP в сфероидах HEK293T при MOI 101 в режиме реального времени на живых клетках.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 1: Расчет MOI, необходимого для трансдукции AAV.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Здесь мы представляем оптимизированную платформу in vitro 3D для разработки AAV и тестирования их активности. Данная платформа обеспечивает усиленную трансдукцию, высокую чувствительность и лучшую трансляционную предсказуемость благодаря использованию трехмерного культивирования клеток, которое более точно воспроизводит архитектуру тканей человека. Эта система успешно дифференцирует эффективность трансдукции различных серотипов AAV и регуляторных элементов, включая одноцепочечные и самокомплементарные векторы, в нескольких клеточных линиях. Мы отмечаем, что, в отличие от традиционных 2D-анализов, где эффективность трансдукции часто определяется как процент трансген-положительных клеток, система 3D-сфероидов не позволяет легко проводить количественный анализ с разрешением до одной клетки. Следовательно, эффективность трансдукции в данном исследовании определяется как общая интенсивность сигнала репортера (флуоресцентного или люминесцентного), которая отражает совокупный вклад доли трансдуцированных клеток и уровня экспрессии трансгена в каждой клетке. Высокая чувствительность сфероидов существенно снижает потребность в больших количествах продукта, что делает данный метод экономически эффективным, универсальным и физиологически релевантным для исследований и разработки AAV.

Данный подход позволяет решить основные проблемы, связанные с традиционными методами 2D-культивирования клеток, которые основаны на адгезии к искусственным поверхностям и характеризуются отсутствием клеточной организации, что может  приводить к неточным прогнозам эффективности векторов в клинических условиях. Система 3D-сфероидов лучше имитирует структуру ткани и закономерности распределения препаратов, предоставляя данные о поведении векторов, которые более точно соответствуют реальным биологическим условиям22,23. В протоколе используются простые планшеты с ультранизкой адгезией, что делает его легко воспроизводимым в стандартных лабораторных условиях.

Эта адаптивная система может быть использована для анализа нейтрализации AAV, изучения проникновения AAV, а также для разработки более сложных экспериментов по совместному культивированию с целью исследования влияния различных клеточных сред на трансдукцию AAV. Кроме того, платформы для высокопроизводительного скрининга лекарственных средств и векторов могут быть легко интегрированы с платформой для создания сфероидов, что обеспечит автоматизацию и снижение затрат в рабочих процессах по поиску векторов для разработки более таргетных продуктов.

Основным практическим преимуществом сфероидов является их способность к непрерывному росту в течение нескольких недель без необходимости пассажа клеток, что позволяет проводить длительные исследования активности AAV. Такая стабильная система культивирования сохраняет важные межклеточные взаимодействия и компоненты матрикса, позволяя избежать перерывов, вызванных повторным сбором клеток, который требуется при использовании 2D-культур24. Сохраненная клеточная среда поддерживает естественную организацию белков и мембранные структуры, которые имеют решающее значение для оценки связывания AAV и их проникновения в клетки25.

Хотя 3D-сфероиды обладают большим потенциалом для оценки трансдукции AAV, они также имеют некоторые трансляционные недостатки по сравнению с моделями in vivo , прежде всего из-за их упрощенной структуры относительно нативных тканей. В сфероидах отсутствуют критические физиологические компоненты, включая сосудистую сеть для доставки вектора, иммунные клетки для оценки иммуногенности и тканеспецифические барьеры, такие как гематоэнцефалический барьер, которые могут существенно влиять на эффективность AAV26. Эти ограничения указывают на то, что сфероиды, несмотря на промежуточный уровень сложности между традиционными 2D-культурами и животными моделями in vivo, остаются недостаточными для полного воспроизведения физиологического микроокружения, необходимого для комплексной оценки AAV.

Представленный здесь протокол создания сфероидов описывает использование одного типа клеток за раз. Данный протокол может быть расширен за счет включения 2–3 дополнительных типов клеток, которые агрегируют в базовую трехмерную структуру. Более сложные 3D-модели, такие как органоиды или микрофлюидные системы, представляют собой многоклеточные системы, которые воспроизводят клеточное разнообразие и организацию конкретных органов и содержат 10 или более различных типов клеток, организованных в тканеподобные структуры. Такие усовершенствованные 3D-органоиды могут включать несколько типов клеток27, культуры, встроенные в гидрогель, методы «висячей капли» и микрофлюидные платформы11,27,28. Хотя эти методы обеспечивают более сложную архитектуру ткани, что могло бы помочь углубить наше понимание биологии AAV, они, как правило, требуют более специализированных реагентов, оборудования и значительного технического опыта. С другой стороны, 3D-сфероиды, сформированные в планшетах с ультранизкой адгезией, значительно проще и подходят для многих лабораторий благодаря своей экономичности и воспроизводимости.

Критически важными этапами для успешной реализации данного протокола являются поддержание высокой жизнеспособности клеток, так как поврежденные клетки могут ухудшить формирование сфероидов и эффективность трансдукции. Использование планшетов с ультранизкой адгезией и оптимизация центрифугирования также имеют решающее значение для достижения компактности сфероидов. Оптимизация MOI для каждого типа клеток и серотипа AAV необходима, чтобы избежать получения слабых сигналов или насыщения. Также критически важен выбор подходящего метода детекции, особенно для кинетического анализа, где требуется совместимость с системами непрерывной визуализации живых клеток. Для точной интерпретации трансдукции AAV в 3D-сфероидах важен ряд технических аспектов.

Слабый или отсутствующий сигнал трансдукции может быть следствием низкого титра вируса, неоптимальной MOI или недостаточного времени инкубации; эту проблему можно решить путем проверки вирусных титров, оптимизации MOI и увеличения времени инкубации (обычно до 3–5 дней). Слабые сигналы флуоресценции или люминесценции могут свидетельствовать о низком уровне экспрессии трансгена или ограниченном проникновении реагента внутрь 3D-структуры, что можно исправить путем оптимизации настроек экспозиции или выделения дополнительного времени для диффузии субстрата. Серьезной проблемой для некоторых клеточных линий, таких как клетки HeLa, является автофлуоресценция, которая может привести к высокому фоновому сигналу и снижению чувствительности в анализах на основе флуоресценции. Чтобы преодолеть этот недостаток, мы внедрили репортерную систему на основе люминесцентной нанолюциферазы, которая обеспечивает более высокое соотношение сигнал/шум и позволяет более точно определять трансдукцию на фоне автофлуоресценции. Кроме того, фоновый сигнал может возникать из-за неправильного выбора порога отсечки или флуоресценции компонентов среды; его следует контролировать, используя необработанные лунки (MOI = 0) для определения базового уровня. Наконец, насыщение сигнала при высоких значениях MOI может произойти из-за избыточного количества введенного вируса или ограничений детектора; это можно минимизировать, сократив диапазон MOI и оптимизировав настройки экспозиции детектора для поддержания измерений в пределах линейного динамического диапазона.

В целом, данный метод создания 3D-сфероидов представляет собой оптимизированную воспроизводимую систему для оценки трансдукции, активности и кинетики AAV. Восполняя пробел между традиционными 2D-анализами и исследованиями in vivo, этот подход позволяет более эффективно разрабатывать векторы и способствует продвижению клинически значимых стратегий генной терапии.

Раскрытие информации

Авторы не имеют конфликтов интересов, подлежащих раскрытию.

Благодарности

Авторы благодарят Мортена Сейрупа и Триш Хоанг за предоставление плазмиды для продукции нанолюциферазы AAV и реагентов живого субстрата. Данный проект был поддержан в рамках участия в исследовательской программе ORISE в CBER Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA), которая осуществляется Ок-Риджским институтом науки и образования в соответствии с межведомственным соглашением между Министерством энергетики США и FDA.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Инкубатор на 37°CThermoFisher Scientific#51025983Стандартные условия культивирования
Клетки A375ATCCCRL-1619Линия клеток
Плазмида AAV1Addgene112862Плазмида AAV
Плазмида AAV2Addgene104963Плазмида AAV
Плазмида AAV5Addgene104964Плазмида AAV
Плазмида AAV8Addgene112864Плазмида AAV
Плазмида AAV9Addgene112865Плазмида AAV
Пластинчатый ридер BioTek GEN5Agilent TechnologiesNAКонечноточечное считывание флуоресценции или люминесценции
ЦентрифугаThermoFisher Scientific#TSO-MX1RПоддержание суспензии сфероидов
Фосфатно-солевой буфер для культур клеток Corning™ (1X)Fisher Scientific#MT21040CMXPBS для промывки клеток
DMEM с высоким содержанием глюкозы, добавка GlutaMAX, пируватThermoFisher Scientific#10569010Полная ростовая среда
Внеклеточный ингибитор NanoLuc PromegaN235BГасит любой сигнал Nanoluc®, исходящий из внеклеточной среды  
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Sigma-Aldrich#F4135-500mLОбеспечение факторами роста
Клетки HEK293TATCCCRL-3216Линия клеток
Клетки HeLaATCCCRM-CCL-2Линия клеток
Клетки HEP3BATCCHB-8064Линия клеток
Клетки HEPG2ATCCHB-8065Линия клеток
Клетки Huh7ABMT8973Линия клеток
Инвертированный микроскоп IncuCyte S3SartoriusNAМониторинг формирования и роста сфероидов
Система визуализации IVIS SpectrumSpectralinvivoNAКонечноточечное считывание люминесценции
Тест-система Nano-Glo® для живых клеток PromegaN2013Люминесцентный субстратный реагент для детекции живых клеток
Пенициллин-стрептомицин (10 000 U/mL)ThermoFisher Scientific# 15140122Предотвращение бактериальной контаминации
Флаконы для культивирования тканей T75 с вентиляциейFisher Scientific#NC0509296 Флаконы для выращивания клеток
Трипсин-ЭДТА (0,05%)ThermoFisher Scientific#25300120Ферментативное открепление клеток
Планшеты с ультранизкой адгезиейCorning#7007Предотвращение адгезии клеток для стимуляции формирования сфероидов

Ссылки

  1. Mendell JR, et al. Current Clinical Applications of In Vivo Gene Therapy with AAVs. Mol Ther. 2021;29(2):464-88.
  2. Byrne BJ, et al. Current clinical applications of AAV-mediated gene therapy. Mol Ther. 2025;33(6):2479-516.
  3. Najera SS, et al. AAV2 delivery of the saCas9 gene results in presentation of an HLA-A*02:01-restricted T cell epitope potent to induce T cell cytotoxicity. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33(3):101506.
  4. Alhakamy NA, Curiel DT, Berkland CJ. The era of gene therapy: From preclinical development to clinical application. Drug Discov Today. 2021;26(7):1602-19.
  5. Arutyunyan IV, et al. Gene Expression Profile of 3D Spheroids in Comparison with 2D Cell Cultures and Tissue Strains of Diffuse High-Grade Gliomas. Bull Exp Biol Med. 2023;175(4):576-84.
  6. Cashen P, Manser B. Quality by design (QbD) for adeno-associated virus (AAV): A framework for a QbD assessment for AAV products within the chemistry manufacturing and controls (CMC) documentation [Internet]. Port Washington (NY): Pall Corporation; 2021. Available from: https://www.pall.com/
  7. Center for Biologics Evaluation and Research. Potency Assurance for Cellular and Gene Therapy Products: Draft Guidance for Industry [Internet]. Silver Spring (MD): U.S. Food and Drug Administration; 2023. Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/potency-assurance-cellular-and-gene-therapy-products
  8. Fu Q, Polanco A, Lee YS, Yoon S. Critical challenges and advances in recombinant adeno-associated virus (rAAV) biomanufacturing. Biotechnol Bioeng. 2023;120(9):2601-21.
  9. Martinez RA, et al. A versatile cell line for establishing potency of cell type-specific AAV transgenes. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33(1):101401.
  10. Zengel J, et al. Development of cell lines with increased susceptibility to diverse adeno-associated viral vectors to enable in vitro potency assays. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33(1):101416.
  11. Marconi GD, et al. Three-Dimensional Culture System: A New Frontier in Cancer Research, Drug Discovery, and Stem Cell-Based Therapy. Biology (Basel). 2025;14(7):875.
  12. Bialkowska K, Komorowski P, Bryszewska M, Milowska K. Spheroids as a Type of Three-Dimensional Cell Cultures-Examples of Methods of Preparation and the Most Important Application. Int J Mol Sci. 2020;21(17):6225.
  13. Ducker M, Millar V, Ebner D, Szele FG. A Semi-automated and Scalable 3D Spheroid Assay to Study Neuroblast Migration. Stem Cell Reports. 2020;15(3):789-802.
  14. Hiller T, et al. Generation of a 3D Liver Model Comprising Human Extracellular Matrix in an Alginate/Gelatin-Based Bioink by Extrusion Bioprinting for Infection and Transduction Studies. Int J Mol Sci. 2018;19(10):3129.
  15. Jakeman PG, et al. Improved in vitro human tumor models for cancer gene therapy. Hum Gene Ther. 2015;26(5):249-56.
  16. Kapalczynska M, et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Arch Med Sci. 2018;14(4):910-9.
  17. Gunti S, Hoke ATK, Vu KP, London NR Jr. Organoid and Spheroid Tumor Models: Techniques and Applications. Cancers (Basel). 2021;13(4):874.
  18. McRobb LS, Lee VS, Faqihi F, Stoodley MA. A Simple Model to Study Mosaic Gene Expression in 3D Endothelial Spheroids. J Cardiovasc Dev Dis. 2024;11(10):305.
  19. Ohguro H, et al. 3D Spheroid Configurations Are Possible Indicators for Evaluating the Pathophysiology of Melanoma Cell Lines. Cells. 2023;12(5):759.
  20. Casey G, et al. Self-complementarity in adeno-associated virus enhances transduction and gene expression in mouse cochlear tissues. PLoS One. 2020;15(11):e0242599.
  21. Hutt JA, et al. Scientific and Regulatory Policy Committee Points to Consider: Nonclinical Research and Development of In Vivo Gene Therapy Products, Emphasizing Adeno-Associated Virus Vectors. Toxicol Pathol. 2022;50(1):118-46.
  22. El Harane S, et al. Cancer Spheroids and Organoids as Novel Tools for Research and Therapy: State of the Art and Challenges to Guide Precision Medicine. Cells. 2023;12(7):1001.
  23. Najera SS, et al. Targeting NAD+ Metabolism Vulnerability in FH-Deficient Hereditary Leiomyomatosis and Renal Cell Carcinoma with the Novel NAMPT Inhibitor OT-82. Mol Cancer Ther. 2025;24(2):200-13.
  24. Huang HL, et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J Biomed Sci. 2010;17(1):36.
  25. Ripa I, Andreu S, Lopez-Guerrero JA, Bello-Morales R. Membrane Rafts: Portals for Viral Entry. Front Microbiol. 2021;12:631274.
  26. Habanjar O, Diab-Assaf M, Caldefie-Chezet F, Delort L. 3D Cell Culture Systems: Tumor Application, Advantages, and Disadvantages. Int J Mol Sci. 2021;22(22):12200.
  27. Kaiser VM, Gonzalez-Cordero A. Organoids - the future of pre-clinical development of AAV gene therapy for CNS disorders. Gene Ther. 2025;Mar 27. Epub ahead of print. PMID: 40148593.
  28. Ramamurthy RM, Atala A, Porada CD, Almeida-Porada G. Organoids and microphysiological systems: Promising models for accelerating AAV gene therapy studies. Front Immunol. 2022;13:1011143.

Перепечатки и разрешения

Теги

3D
Видео скоро будет доступно
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.