Выделение и характеристика малых внеклеточных пузырьков из инфрапателлярных жировых подушек пациентов с остеоартритом

Summary

РЕЗЮМЕ Этот протокол представляет собой стандартизированный рабочий процесс для выделения и характеристики малых внеклеточных везикулов (sEV) из инфрапателлярных жировых подушек пациентов с остеоартритом.

Abstract

Внеклеточные везикулы (EV), особенно малые внеклеточные везикулы (sEV), определяемые как везикулы меньше 200 нм, служат необходимыми посредниками межклеточной коммуникации и выделяются почти всеми типами клеток в различные биологические жидкости. Инфрапателлярная жировая подушечка (IPFP) тесно связана с развитием и прогрессированием остеоартрита колена (OA). Однако стандартизированные методы прямой изоляции sEV от эксплантов IPFP остаются ограниченными. Мы представляем воспроизводимый протокол для выделения и характеристики sEV, полученных из тканей IPFP, полученных у пациентов с ОА. Кондиционированная среда, собранная из культур тканей IPFP, последовательно очищается от клеток и мусора с помощью низкоскоростной центрифугирования, затем ультрацентрифугирования для обогащения пузырьков в диапазоне размеров sEV. Полученные везикулы характеризуются на основе минимальной информации для исследований внеклеточных везикул (MISEV2023) рекомендаций с использованием набора представительных белковых маркеров по различным функциональным категориям: CD63 как мембранно-ассоциированный тетраспанин, ALIX и TSG101 как цитозольные белки, участвующие в биогенезезе, опосредованном механизмом Эндосомального сортирующего комплекса, необходимого для транспортировки (ESCRT), и Calnexin как белок, проживающий в эндоплазматическом ретикуле для мониторинга потенциала невезикулярное загрязнение. Такой рабочий процесс даёт чётко очерченные препараты sEV, подходящие для последующих применений, таких как функциональные анализы или протеомное профилирование в исследованиях остеоартрита.

Introduction

Малые внеклеточные везикулы (sEV) — это гетерогенный подтип внеклеточных везикул, которые, согласно оперативной классификации, предложенной Международным обществом внеклеточных везикул (ISEV) в минимальной информации для изучения внеклеточных везикул (MISEV2023), определяются как везикулы диаметром обычно меньше 200 нм¹. sEV выделяются практически всеми типами клеток в биологические жидкости и привлекают всё большее внимание благодаря своей важной роли посредников межклеточной коммуникации как в физиологическом, так и в патологическом^{контексте 2,3}.

Мембрана sEV обогащается множеством функциональных белков. Среди них тетраспанины, такие как CD63, связаны с организацией мембраны везикул и^{слиянием 4}. Кроме того, цитозольные белки, связанные с эндосомным сортирующим комплексом, необходимым для транспорта (ESCRT), такие как ALIX и TSG101, являются неотъемлемой частью биогенеза и секреции sEV. Таким образом, они служат надёжными маркерами для подтверждения эндосомного происхождения изолированных^{пузырьков 5,6}.

Инфрапателлярная жировая подушечка (IPFP) признана активной суставной тканью, тесно связанной с началом и прогрессированием остеоартрита (OA^)7,8. При воспалительных и дегенеративных состояниях предполагается, что sEV, полученные из IPFP, несут воспалительные медиаторы и патогенные сигналы, способствуя воспалению синовиа и деградации^{хряща 9}. Характеристика sEV, выделяемых тканями IPFP у пациентов с ОА, может дать критически важные данные о межклеточных коммуникационных сетях, связанных с заболеваниями.

Учитывая растущий интерес к sEV как молекулярных медиаторов и потенциальных терапевтических агентов, крайне важно создать подход к изоляции с высоким выходом, высокой чистоты и воспроизводимости. Хотя дифференциальное ультрацентрифугирование остаётся одной из самых широко используемых стратегий^{очистки 10}, протоколы, оптимизированные для клеточных культурных супернатантов или биофлюидов, могут быть напрямую применимы к тканям, полученным из твёрдых жиров, таких как IPFP. Высокое содержание липидов, плотный внеклеточный матрикс и вариабельные ферментативные условия пищеварения могут влиять на восстановление и чистоту везикул.

Культура эксплантатов тканей обеспечивает физиологически значимый подход, который сохраняет нативную клеточную архитектуру и взаимодействие между клетками, минимизируя чрезмерное нарушение ферментов, что позволяет собирать sEV, высвобождаемые в близких условиях. Однако в настоящее время отсутствует стандартизированный рабочий процесс, специально разработанный для изоляции sEV из культур IPFP.

Здесь мы описываем пошаговый протокол изоляции и характеристики малых внеклеточных везикул из эксплантических культур инфрапателлярных жировых подушек пациентов с остеоартритом с использованием дифференциальной ультрацентрифугации, предоставляя воспроизводимую методологическую основу для последующих функциональных и трансляционных исследований.

Protocol

Использование тканей IPFP у пациентов с остеоартритом в этом исследовании было одобрено Этическим комитетом Первой больницы Хэбэйского медицинского университета (Одобрение No [2024] 018). Сбор образцов проводился в утверждённый срок, а письменное информированное согласие всех участников было получено до получения ткани.

1. Подготовка среды и растворов

1. Подготовьте 500 мл полной среды DMEM/F12, обеднённой экзосомами, смешав 445 мл базального средного DMEM/F12, 50 мл сыворотки плода без экзосомы (10%) и 5 мл пенициллина/стрептомицина/амфотерицина B (соответственно 100 U/mL, 100 мкг/мл и 0,25 мкг/мл). Фильтруйте-стерилизуйте через фильтр диаметром 0,22 мкм.
2. Подготовьте буфер Western Blot, смешав 950 мл дистиллированной воды (_{dH 2O}) с 50 мл 20-кратного буфера (Tris/MOPS/SDS).
3. Подготовьте буфер переноса вестерн блот, смешав 800 мл_{dH 2O}с 100 мл буфера 10x и 100 мл абсолютного этанола.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот буфер быстрого передачи был специально оптимизирован для высокоточечного влажного переноса (400 мА) при комнатной температуре. Из-за низкой генерации тепла ледяная ванна не требуется при длительности переноса менее 45 минут, что показало высокую эффективность переноса белков в диапазоне 10–250 кДа.
   ВНИМАНИЕ: Абсолютный этанол горючий. Обращайтесь в хорошо проветриваемом помещении и держитесь подальше от источников тепла.
4. Подготовьте буфер для промывания, смешивая 50 мл 20 x TBS (200 мМ Tris и 3 млн NaCl при pH 7,5–7,6) и 2 мл Tween-20 с 950 мл dH₂O.
5. Приготовьте хемилюминесцентный рабочий раствор, смешивая равные объемы раствора люминола/энхансера и буфера перекиси (примерно 0,1 мл рабочего раствора требуется на квадратный сантиметр мембраны).
   ВНИМАНИЕ: Хемилюминесцентные субстраты могут раздражать. Надевайте перчатки и защиту для глаз. Утилизировать химические отходы в соответствии с местными институциональными нормами.

2. Подготовка ткани IPFP и сбор кондиционируемой среды

1. Промывайте только что полученную салфетку IPFP (примерно 10 г) три раза с 50 мл предварительно охлаждённого PBS за раз, мягко перемешивая вручную в трубке центрифуги, чтобы тщательно удалить остаточную кровь.
2. Измельчите ткань IPFP на кусочки примерно 2 мм x 2 мм x 2 мм с помощью стерильных ножниц или скальпеля.
3. Переложите части ткани IPFP в колбы T175. Добавьте 50 мл полной среды DMEM/F12 с истощёнными экзосомами. Инкубировать при 37 °C с 5% CO₂ в течение 48 часов с мягким перемешиванием.
4. Собирайте полную среду DMEM/F12 (то есть кондиционированную среду) в трубках по 50 мл на льду. Профильтруйте сито диаметром 70 мкм для удаления тканевых остатков.

3. Изоляция sEV с помощью дифференциальной ультрацентрифугирования

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все следующие шаги при 4 °C или на льду.

1. Первоначальная низкоскоростная центрифугирование для удаления тканевых мусоров
   1. Центрифугуйте кондиционированную среду при 300 г в течение 10 минут при 4 °C. Аккуратно соберите супернатант и переместите его в новые центрифугные трубки на 50 мл.
   2. Центрифугуйте супернатант при 3 000 x g в течение 10 минут при 4 °C. Соберите супернатант и переместите его в новые трубки, убедитесь, что гранулу не навредят.
2. Промежуточное центрифугирование и фильтрация.
   1. Центрифугуйте супернатант при 10 000 x g в течение 30 минут при 4 °C.
   2. Соберите супернатант и профильтруйте его через вакуумный фильтр диаметром 0,22 мкм, чтобы удалить крупные везикулы и загрязнители.
3. Первая ультрацентрифуга: гранулирование sEV.
   1. Переместить фильтрованный супернатант в поликарбонатные центрифугные трубки объемом 40 мл.
   2. Ультрацентрифугуйте образцы при 110 000 x g в течение 70 минут при 4 °C с использованием ротора с фиксированным углом (k-фактор = 70). Аккуратно удалите супернатант с помощью пипетки.
   3. Суспензируйте гранулу в 10 мл предварительно охлаждённого, стерильного PBS. Фильтруйте вновь суспендированный раствор через шприцовый фильтр 0,22 мкм, чтобы обеспечить удаление оставшихся заполнителей.
4. Вторая ультрацентрифуга: очистка sEV
   1. Снова ультрацентрифугуйте подвеску при 110 000 x g в течение 70 минут при 4 °C с помощью ротора с фиксированным углом (k-фактор = 70).
   2. Аккуратно сбросьте супернатант, оставив sEV на дне трубки. Подвесьте последний sEV пеллет в 200 мкл стерильного PBS.
   3. Разделите подвеску sEV на аликвоты объемом 20 мкл, чтобы предотвратить повреждения при повторяющихся циклах замерзания-оттаивания. Храните аликвоты при -80 °C для длительного использования.

4. Характеристика sEV с помощью вестерн-блот-анализа

1. Подготовьте образцы белка sEV.
   1. Смешайте гранулу sEV (начиная с шага 3.5.2) с 80–120 мкл буфера лизиса RIPA с дополнением ингибиторами протеаз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стремитесь к соотношению примерно 1 мкл буфера RIPA на 0,5–1,0 мкг предполагаемого белка. Рекомендуется конечная концентрация белка не менее 1,0 мкг/мкл для обеспечения эффективного электрофоретического разделения и высококачественного обнаружения сигналов при западном блот-анализе.
      ВНИМАНИЕ: Буфер RIPA содержит моющие средства и раздражители. Используйте средства индивидуальной защиты.
   2. Кратко разведите смесь в вихрь и инкубуйте образцы на льду в течение 15–30 минут с лёгким покачиванием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательное смешивание на этом этапе критически важно для полного разрушения мембраны и оптимального высвобождения белка. Недостаток вихрей может привести к неполному лизу и несогласованности концентраций белка между репликатами.
   3. Центрифугуйте лизат при концентрации 12 000–14 000 г в течение 10–15 минут. Аккуратно соберите супернатант.
   4. Определите общую концентрацию белка лисата sEV с помощью высокочувствительного анализа на бицинхониновой кислоте (BCA).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать высокочувствительный анализ BCA вместо стандартного BCA для образцов внеклеточных везикул из-за его более низкого диапазона обнаружения (0,5–20 мкг/мл), что позволяет точно количественно оценивать обычно низкие концентрации белка, полученные из очищенных препаратов sEV. Проведите анализ в соответствии с протоколом набора.
2. Вестерн-блот анализ.
   1. Смешайте образцы белка с 5 x буфером загрузки образцов SDS-PAGE.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для обнаружения CD63 подготовьте образцы с помощью невосстанавливающего буфера нагрузки 5x (без β-меркаптоэтанола) и инкубуйте при 70 °C в течение 10 минут. Эти условия сохраняют конформационные эпитопы и предотвращают агрегацию этого тетраспанина, вызванную теплом. Для других маркеров, включая ALIX (ALG-2-взаимодействующий белок X), TSG101 (ген чувствительности к опухолям 101) и Calnexin, подготовьте образцы с помощью буфера с уменьшающим нагрузкой 5x с 10% β-меркаптоэтанолом, и нагревая при 95 °C в течение 5 минут для обеспечения полной денатурации белка.
   2. Загружать подготовленные образцы (обычно 20–40 мкг общего белка) в готовый градиентный гель (4%–12%).
   3. Загрузите маркер молекулярной массы белка в назначенную скважину согласно рекомендациям производителя.
   4. Пропустите гель в буфере с постоянным напряжением 100 В.
   5. Продолжайте пробег 1–1,5 часа, или пока нагрузочный краситель не достигнет дна геля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время работы может варьироваться в зависимости от системы электрофореза и процента геля.
   6. Переносите белки из геля на мембраны PVDF с помощью влажной системы переноса на 400 мА в течение 30 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Длительность передачи может варьироваться в зависимости от бренда используемого буфера передачи.
   7. Заблокировать мембраны в безбелковом блокирующем буфере, приготовленном в трибуферном физиологическом растворе с 0,2% Tween-20 (TBS-T) на 30 минут при комнатной температуре с мягким перемешиванием. Блокирующий буфер формируется без белков сыворотки, биотина или фосфорилированных белков, чтобы минимизировать неспецифическое связывание и фоновые помехи.
   8. Инкубировать мембрану специфическими первичными антителами, разбавленными в буфере разбавления антител без сыворотки, содержащем стабилизаторы на основе белка и антителосохраняющих добавки при 4 °C за ночь (12–16 часов) с мягким перемешиванием.
   9. Промывайте мембраны в буфере для стирки (TBST содержит 0,2% Tween-20) под мягким перемешиванием на шейкере.
   10. Инкубировать мембраны соответствующими вторичными антителами при комнатной температуре в течение 1 часа с мягким перемешиванием.
   11. Снова промыйте мембраны в буфере для стирки под мягким перемешиванием шейкером.
   12. Визуализируйте белковые полосы с помощью хемилюминесцентного субстрата.
       ВНИМАНИЕ: Хемилюминесцентные субстраты могут раздражать кожу и глаза. Наденьте подходящие перчатки и защитные очки. Утилизировать субстрат в соответствии с институциональными рекомендациями по опасным отходам.

5. Характеристика sEV с помощью анализа отслеживания наночастиц (NTA)

1. Включите анализатор отслеживания наночастиц и модуль насоса шприца согласно инструкции производителя и дайте системе выровняться не менее 30 минут до измерения.
2. Аккуратно разморозьте образцы EV на льду и разведите их в стерильном, безфосфатном буферном физиологическом растворе (PBS), чтобы достичь оптимальной концентрации частиц в рекомендованном диапазоне измерений (примерно 1 x 10⁸ –1 x 10⁹ частиц/мл).
3. Загрузите 1 мл разбавленной образцы в стерильный шприц и медленно введите образец в измерительную камеру, чтобы не появляться воздушные пузырьки.
4. Отрегулируйте уровень камеры и фокус, чтобы чётко визуализировать отдельные частицы, демонстрирующие броуновское движение.
5. Запишите три видео длительностью по 60 с для каждого образца при условиях постоянного потока с помощью насоса-шприца для обеспечения равномерного распределения частиц.
6. Анализируйте записанные видео с помощью NTA с порогом обнаружения 12, размером размытия — Auto, максимальной дальностью прыжка — Auto.
7. Генерируйте распределение размеров частиц и профили концентрации с помощью автоматизированной функции анализа программного обеспечения.
8. Экспортировать исходные данные, графики распределения размеров частиц и измерения концентрации для дальнейшего статистического анализа.
9. Тщательно очистите измерительную камеру стерильной водой без частиц, затем 70% этанола, а затем снова промите стерильной водой без частиц, чтобы предотвратить перекрёстное загрязнение между образцами.

6. Характеристика sEV с помощью пропускной электронной микроскопии (TEM)

1. Используйте медные сетки с углеродным покрытием на 200 сеток. Проводите светящийся разряд на сетках в течение 30 секунд с использованием системы светящегося разряда, если она есть.
2. Нанесите 10 мкл sEV подвески (ресуспензионной в стерильной, фильтрованной PBS) на сетку и инкубировать 2–5 минут при комнатной температуре.
3. Удалите лишнюю жидкость, аккуратно коснувшись края сетки фильтрующей бумагой.
4. Промывайте решётку, последовательно размещая поверхность с образцом на три отдельные капли ультрачистой воды.
5. Нанесите 10 мкл 2% раствора фосфотунгстиновой кислоты (pH 7,0) на сетку и инкубируем 1–2 минуты при комнатной температуре.
   ВНИМАНИЕ: Фосфоронгстическая кислота — это коррозийный кислотный реагент, который может вызывать раздражение кожи, глаз и дыхательных путей. Обращайтесь в соответствии с требованиями учреждения по безопасности, при этом нося соответствующие средства индивидуальной защиты, включая перчатки и защиту глаз. Утилизация пятенных отходов и загрязнённых материалов в соответствии с одобренными процедурами по опасным химическим отходам.
6. Удалите лишние пятна фильтрующей бумагой и дайте сетке полностью высохнуть при комнатной температуре минимум 10 минут.
7. Осмотрите сетки с помощью электронного микроскопа с ускорением напряжения 80 кВ.
8. Получите репрезентативные изображения с соответствующими увеличениями для оценки морфологии везикул.

Results

Успешная изоляция малых внеклеточных везикул (sEV) из тканей человеческих инфрапателлярных жировых подушек (IPFP) была подтверждена с помощью мультимодальной характеристики.

Трансмиссионная электронная микроскопия (TEM) показала, что изолированные везикулы имеют характерную чашковидную морфологию с чётко очерченными липидными двуслойными мембранами, что соответствует структурным особенностям sEV (Рисунок 1)¹¹.

Discussion

Этот протокол обеспечивает воспроизводимый и практичный рабочий процесс для выделения малых внеклеточных везикулов (sEV) из тканей человеческих инфрапателлярных жировых подушек (IPFP) с использованием эксплантической культуры с последующим дифференциальным ультрацентрифугированием. Изолированные везикулы были валидированы с помощью комплементарных методов характеристики, включая трансмиссионную электронную микроскопию (TEM), анализ отслеживания наночастиц (NTA) и обнаружение Western blot...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 мл ПЭТ-центрифугных трубок	himac (Eppendorf Himac Technologies)	5720411148	Полиэтилентерефталат, 26 x 90 мм
70 µ m Клеточное сито	Beijing Lanjieke Technology	560049	Для удаления тканевых мусоров
Антиаликсовое антитело	Биотехнологии Shanghai Abways	CY7215	Положительный маркер sEV
Антитела к кальнексину	Биотехнологии Shanghai Abways	CY5839	Отрицательный маркер (загрязнение ЭР)
Антитела к CD63	Affinity Biosciences	DF2305	Маркер тетраспанина
Антитела против TSG101	Биотехнологии Shanghai Abways	CY5985	Положительный маркер sEV
Набор для анализа белков BCA	Shanghai YaMei Biotechnology	ZJ102	Для количественной оценки белков
Колба для клеточной культуры (T175)	NEST Биотехнология	560229	Для IPFP эксплантной культуры
Центрифуга (50 мл)	BIOFIL	560041	Для начальных шагов на низкой скорости
Сыворотка плода с истощённым экзосомами	Cyagen Biosciences	FBSNE-01061	Для культуры тканей
HRP Goat anti-Rabbit IgG	Биотехнологии Shanghai Abways	AB0101	Вторичные антитела к белому
Мгновенный буфер загрузки белка (денатурирование, редукция, 5 раз;)	Shanghai YaMei Biotechnology	LT101	Для денатурации белков
Набор для анализа белков Micro BCA	Thermo Scientific	23235	Для количественной оценки белков
Фильтр Millex-GP (0.22 & micro; m)	Beijing Lanjieke Technology	560360	Стерильная — для фильтрации пузырьков
Анализатор отслеживания наночастиц	Malvern Panalytical	NanoSight NS300	Для анализа размера и концентрации
Буфер быстрой передачи без льда с омни-вспышкой	Shanghai YaMei Biotechnology	PS201S	Для переноса белка Western blot
Фосфотунгстическая кислота (2%)	Сигма-Олдрич	P4006	Для TEM-отрицательного окрашивания
Буфер загрузки белка (денатурирующий, нередуцирующий, 5-кратный;)	Shanghai YaMei Biotechnology	LT103	Для денатурации белков
Безбелковый быстрый блокирующий буфер (5 и раз;)	Shanghai YaMei Biotechnology	PS108	Для блокировки мембран
Буфер лизиса RIPA	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	R0010	Для экстракции белка sEV
TBS (20 и больше раз;)	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	T1080	Для буфера для промывки
Пропускной электронный микроскоп	Hitachi	HT7800	Для морфологической характеристики
Буфер электрофореза Tris/MOPS/SDS	Shanghai YaMei Biotechnology	PS120	Для разделения белков
Tween-20	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	T8220	Для буфера для промывки
Ультрацентрифуга	himac (Eppendorf Himac Technologies)	CP100NX	Высокоскоростная система изоляции
Сверхчувствительный комплект для обнаружения хемилюминесцентных систем	Shanghai YaMei Biotechnology	SQ201	Для визуализации белковых полос
Универсальный буфер разведения антител	Shanghai YaMei Biotechnology	PS119L	Для первичных/вторичных антител